Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Protokolümüz, iki ana makro besinin, proteinlerin ve karbonhidratların alım seviyelerinin kontrolü ile ilgili beslenme seçimlerini kodlayan larva nöronal popülasyonlarının tanımlanmasını sağlar. Yöntemimizin basitliği ve nispeten yüksek verimi, farklı beslenme koşullarına maruz kalan çeşitli genotipler için gıda alımının ölçülmesine izin verir. Ebeveyn çizgilerini genetik olarak geçmek için, bazı aktif maya macunu ile desteklenmiş L3 yetiştirme diyet plakaları ile 60 milimetre embriyo toplama kafesleri kurun.

Beş ila sekiz günlük yetişkin TripA1 dişi bakireleri ve Janelia GAL4 erkeklerini embriyo toplama kafeslerine aktarın ve çiftleşmenin 25 santigrat derecede 24 ila 48 saat boyunca% 60 nem ve 12, 12 açık karanlık döngü ile gerçekleşmesine izin verin. Çiftleşme döneminden sonra, çiftleşmiş yetişkin sinekleri taze L3 yetiştirme diyet plakalarına aktarın ve yumurtlamanın 25 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca gerçekleşmesine izin verin. Tüm plakaların yumurta yumurtlamasının genotipi ve tarihi ile etiketlendiğinden emin olun.

Yumurtlama dönemi bittiğinde, plakaları kafeslerden çıkarın ve plakanın dörtte birindeki embriyo sayısını sayarak plaka başına yumurta sayısını tahmin edin. Larva yoğunluğunu plaka başına maksimum 200 embriyoda tutun ve plakaları plastik kapaklarla kapatın. L3 yetiştirme plakalarını dokuz gün boyunca 18 santigrat derece, %60 nem ve 12, 12 açık karanlık döngüde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, test edilecek genotiplerin her birinden üç grup 10 L3 ve ayrıca sıfır boya gıda kontrolü için bir grup 10 L3 toplayın. Larva toplamayı mümkün olduğunca nazikçe gerçekleştiren beş numara veya tüy ağırlığındaki forseps kullanın. Toplanan larvaları bir mililitre su içeren plastik tabak ağırlığındaki botlara aktarın.

30 santigrat derecelik bir inkübatör kurun ve test sırasında larva dehidrasyonunu önlemek için suyla dolu bir tepsi ekleyerek nem seviyelerini yüksek tutun. Başlamadan önce tahlil plakalarının sıcaklığını 30 santigrat dereceye kadar ısıtarak dengeleyin. Tüm plakaların diyetin genotipi ve protein-karbonhidrat oranı ile etiketlendiğinden emin olun.

Hayvanları içeren plastik tekneleri doğrudan 37 santigrat derecede bir su banyosuna aktararak deney larvalarını iki dakika boyunca ısı şoku verin. Gerekli zamanlayıcı sayısını bir saat boyunca ayarlayın, ardından plastik teknelerdeki suyu dikkatlice boşaltın ve L3 gruplarını teknelerden varlık plakalarının merkezine aktarın. Plakaları örtün ve zamanlayıcıyı başlatın.

Larvaların karanlıkta 30 santigrat derecede bir saat beslenmesine izin verin. Plakaları bir buz banyosuna aktararak besleme testini durdurun. Test edilen her L3 grubu için, mikrotüpün alt kısmını doldurmaya yetecek kadar 0,5 milimetre cam boncuk ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk metanol içeren iki mililitre mikrotüp hazırlayın.

Mikrotüpleri soğuk tutmak için bir tezgah soğutucusu kullanın. L3 gruplarını besleme tahlil plakalarından dikkatlice kurtarın ve bir miktar su ile plakaların kapaklarına aktarın. Yiyecek artıklarını vücutlarından çıkarmak için larvaları durulayın ve herhangi bir yaralanmayı önlemeye özen gösterin.

Larvaları hazırlanan mikrotüplere aktarın ve gıda boyasını bağırsaklardan çıkarmak için bir doku parçalayıcı ile parçalayın. İki mililitrelik mikrotüpleri doğrudan yeni tüplere ters çevirerek 1.5 mililitrelik mikrotüpleri temizlemek için ekstraktları aktarın. Cam boncukların çoğu iki mililitrelik tüpün dibinde kalacak şekilde nazikçe yapın.

Ekstraktları 10 dakika boyunca maksimum hızda ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek hücresel kalıntıları temizleyin, ardından süpernatanları 1,5 mililitrelik tüpleri temizlemek için aktarın. Gıda tüketiminin kalorimetrik miktar tayinini yapmak için, metanol içinde bir ila iki seri olarak seyrelterek standart mavi boya çözeltileri hazırlayın. Deney numunelerinin 100 mikrolitresini, standartları ve işlenmemiş parçayı 96 kuyulu bir mikroplakanın kuyularına aktarın ve emilimi 600 nanometrede ölçün.

Bu protokol, larva sinir sistemindeki spesifik nöronal popülasyonların termogenetik aktivasyonu altında hayvanlar için tüketilen makro besinlerin nispi miktarlarını ölçmek için kullanıldı. Nöron popülasyonlarının farklı şekilde aktive edilmesi, üçüncü instar larvalarında makro besin dengesini önemli ölçüde etkiledi. Kontrol çizgisi için gözlemlenen ve burada gri renkle gösterilen beslenme modeli, daha yüksek protein/karbonhidrat oranlı diyetlerde gıda alımında beklenen bir azalmayı göstermekte ve bu da yöntemin etkinliğini göstermektedir.

Deney hayvanları için oluşturulan beş fenotipik sınıf, çok ye ve aşırı yiyerek protein seyreltmesini telafi et, çok ye, ama telafi etme, az ye, az ye ama telafi etme, az ye ve telafi etme ve anormal yemek idi. Bu fenotipik sınıfların ve genotiplerin her biri için, üçüncü instar larvalarının merkezi sinir sistemlerindeki GFP paternleri gösterilmiştir. Bu protokolü denerken, hayvan davranışıyla ilişkili varyasyonu en aza indirmek için gelişimsel olarak senkronize erken üçüncü instar larvaları oluşturmak önemlidir.

Bu protokolü takiben, gıdaların radyo etiketlemesi, bu yöntemler kullanılarak bulunan isabetlerin doğrulanmasına ve daha fazla diseksiyonuna izin verecektir.