Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi
June 11th, 2020
Burada açıklanan, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan Drosophila melanogaster larvaları tarafından belirli bir zaman aralığında yenen yiyecek miktarının kolorimetrik olarak ölçülmesini sağlayan bir protokoldür. Bu tahliller nöronal termogenetik ekran bağlamında gerçekleştirilir.
Protokolümüz, iki ana makro besinin, proteinlerin ve karbonhidratların alım seviyelerinin kontrolü ile ilgili beslenme seçimlerini kodlayan larva nöronal popülasyonlarının tanımlanmasını sağlar. Yöntemimizin basitliği ve nispeten yüksek verimi, farklı beslenme koşullarına maruz kalan çeşitli genotipler için gıda alımının ölçülmesine izin verir. Ebeveyn çizgilerini genetik olarak geçmek için, bazı aktif maya macunu ile desteklenmiş L3 yetiştirme diyet plakaları ile 60 milimetre embriyo toplama kafesleri kurun.
Beş ila sekiz günlük yetişkin TripA1 dişi bakireleri ve Janelia GAL4 erkeklerini embriyo toplama kafeslerine aktarın ve çiftleşmenin 25 santigrat derecede 24 ila 48 saat boyunca% 60 nem ve 12, 12 açık karanlık döngü ile gerçekleşmesine izin verin. Çiftleşme döneminden sonra, çiftleşmiş yetişkin sinekleri taze L3 yetiştirme diyet plakalarına aktarın ve yumurtlamanın 25 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca gerçekleşmesine izin verin. Tüm plakaların yumurta yumurtlamasının genotipi ve tarihi ile etiketlendiğinden emin olun.
Yumurtlama dönemi bittiğinde, plakaları kafeslerden çıkarın ve plakanın dörtte birindeki embriyo sayısını sayarak plaka başına yumurta sayısını tahmin edin. Larva yoğunluğunu plaka başına maksimum 200 embriyoda tutun ve plakaları plastik kapaklarla kapatın. L3 yetiştirme plakalarını dokuz gün boyunca 18 santigrat derece, %60 nem ve 12, 12 açık karanlık döngüde inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, test edilecek genotiplerin her birinden üç grup 10 L3 ve ayrıca sıfır boya gıda kontrolü için bir grup 10 L3 toplayın. Larva toplamayı mümkün olduğunca nazikçe gerçekleştiren beş numara veya tüy ağırlığındaki forseps kullanın. Toplanan larvaları bir mililitre su içeren plastik tabak ağırlığındaki botlara aktarın.
30 santigrat derecelik bir inkübatör kurun ve test sırasında larva dehidrasyonunu önlemek için suyla dolu bir tepsi ekleyerek nem seviyelerini yüksek tutun. Başlamadan önce tahlil plakalarının sıcaklığını 30 santigrat dereceye kadar ısıtarak dengeleyin. Tüm plakaların diyetin genotipi ve protein-karbonhidrat oranı ile etiketlendiğinden emin olun.
Hayvanları içeren plastik tekneleri doğrudan 37 santigrat derecede bir su banyosuna aktararak deney larvalarını iki dakika boyunca ısı şoku verin. Gerekli zamanlayıcı sayısını bir saat boyunca ayarlayın, ardından plastik teknelerdeki suyu dikkatlice boşaltın ve L3 gruplarını teknelerden varlık plakalarının merkezine aktarın. Plakaları örtün ve zamanlayıcıyı başlatın.
Larvaların karanlıkta 30 santigrat derecede bir saat beslenmesine izin verin. Plakaları bir buz banyosuna aktararak besleme testini durdurun. Test edilen her L3 grubu için, mikrotüpün alt kısmını doldurmaya yetecek kadar 0,5 milimetre cam boncuk ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk metanol içeren iki mililitre mikrotüp hazırlayın.
Mikrotüpleri soğuk tutmak için bir tezgah soğutucusu kullanın. L3 gruplarını besleme tahlil plakalarından dikkatlice kurtarın ve bir miktar su ile plakaların kapaklarına aktarın. Yiyecek artıklarını vücutlarından çıkarmak için larvaları durulayın ve herhangi bir yaralanmayı önlemeye özen gösterin.
Larvaları hazırlanan mikrotüplere aktarın ve gıda boyasını bağırsaklardan çıkarmak için bir doku parçalayıcı ile parçalayın. İki mililitrelik mikrotüpleri doğrudan yeni tüplere ters çevirerek 1.5 mililitrelik mikrotüpleri temizlemek için ekstraktları aktarın. Cam boncukların çoğu iki mililitrelik tüpün dibinde kalacak şekilde nazikçe yapın.
Ekstraktları 10 dakika boyunca maksimum hızda ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek hücresel kalıntıları temizleyin, ardından süpernatanları 1,5 mililitrelik tüpleri temizlemek için aktarın. Gıda tüketiminin kalorimetrik miktar tayinini yapmak için, metanol içinde bir ila iki seri olarak seyrelterek standart mavi boya çözeltileri hazırlayın. Deney numunelerinin 100 mikrolitresini, standartları ve işlenmemiş parçayı 96 kuyulu bir mikroplakanın kuyularına aktarın ve emilimi 600 nanometrede ölçün.
Bu protokol, larva sinir sistemindeki spesifik nöronal popülasyonların termogenetik aktivasyonu altında hayvanlar için tüketilen makro besinlerin nispi miktarlarını ölçmek için kullanıldı. Nöron popülasyonlarının farklı şekilde aktive edilmesi, üçüncü instar larvalarında makro besin dengesini önemli ölçüde etkiledi. Kontrol çizgisi için gözlemlenen ve burada gri renkle gösterilen beslenme modeli, daha yüksek protein/karbonhidrat oranlı diyetlerde gıda alımında beklenen bir azalmayı göstermekte ve bu da yöntemin etkinliğini göstermektedir.
Deney hayvanları için oluşturulan beş fenotipik sınıf, çok ye ve aşırı yiyerek protein seyreltmesini telafi et, çok ye, ama telafi etme, az ye, az ye ama telafi etme, az ye ve telafi etme ve anormal yemek idi. Bu fenotipik sınıfların ve genotiplerin her biri için, üçüncü instar larvalarının merkezi sinir sistemlerindeki GFP paternleri gösterilmiştir. Bu protokolü denerken, hayvan davranışıyla ilişkili varyasyonu en aza indirmek için gelişimsel olarak senkronize erken üçüncü instar larvaları oluşturmak önemlidir.
Bu protokolü takiben, gıdaların radyo etiketlemesi, bu yöntemler kullanılarak bulunan isabetlerin doğrulanmasına ve daha fazla diseksiyonuna izin verecektir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, Drosophila melanogaster larvalarının çeşitli makro besin diyetlerine maruz kalmasının kolorimetrik olarak kantitatif analizini sağlayan bir protokol sunar. Araştırma, farklı protein ve karbonhidrat oranları arasında beslenme seçimi ve besin alımı kontrolünde rol oynayan larval nöronal popülasyonları tanımlamaya odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Biyoloji
- Genetik
Arka Plan
- Drosophila melanogaster larvaları, beslenme davranışlarının incelenmesi için bir model olarak hizmet eder.
- Besin makrobesin kalitesi ile beslenme şekilleri arasındaki etkileşim, metabolik seçimleri anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Protokol, çeşitli genotipler arasında besin alımının yüksek verimli bir şekilde taranmasına olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila larvalarının besin alımını kantitatif olarak ölçmek için bir yöntem geliştirmek.
- Besin seçiminin altında yatan nöronal mekanizmaları anlamak.
- Farklı protein ve karbonhidrat oranlarının beslenme davranışları üzerindeki etkilerini incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, üçüncü instar larvalarında beslenme aktivitesini kantitatif olarak ölçmek için davranışsal deneyleri kullanır.
- Drosophila larvaları, nöronal popülasyonlar termogenetik olarak aktive edilirken farklı diyetlere maruz bırakılır.
- Değerlendirme, larvaların ısıl şok altına alınmasını ve ardından diyetlerinden emilen gıda boyasının kolorimetrik ölçümüyle yapılır.
- Larvaya davranışsal sonuçlarda tutarlılık sağlamak için larvaların gelişiminin dikkatli senkronizasyonu kritik öneme sahiptir.
- Kantitasyon için standart eğriler, seri seyreltilmiş boya çözeltileri kullanılarak belirlenir.
Ana Sonuçlar
- Farklı nöronal aktivasyonlar, beslenme şekillerinde makro besin dengesini önemli ölçüde etkiler.
- Besin alımı tepkileri temel alınarak beş fenotip sınıfı belirlenmiştir.
- Yöntem, diyet bileşimi ile besin alımı arasındaki ilişkinin etkili bir şekilde kantitatif analizini sağlamıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, araştırmacıların larvaların diyet seçimlerinde belirli nöronal popülasyonların rolünü araştırmalarını sağlar.
- Besin alımının ve davranışsal fenotiplerin açık ölçümü, metabolik karar verme süreçlerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Bulgular, beslenme fizyolojisi ve bunun nöronal temelleri hakkındaki bilgilere katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
