Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

Domuz yumurtalarının kapsüllemesi için yapılan bu protokol, KÜRESEL COC organizasyonunun sürdürülmesini mümkün kılar. Bu, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmasını önler. Açıklanan iki protokolün başlıca avantajları kullanıcı dostu olan ve hem yumurta hem de kemo hücre sağkalımını etkin bir şekilde kontrol altına almaktır.

Kültür sistemlerinin her ikisi de üreme biyolojisi temel araştırma için değerli araçlar, ve gelişmiş kısırlık tedavisi için klinik önemi olabilir. Ayrıca yeni biyoteknoloji yöntemleri geliştirmek ve hayvancılık geliştirmek için uygulanabilir. Yumurtalıkları duruladıktan sonra, HM ortamı ile dolu bir kabına aktarın ve sonraki tüm manipülasyonlar sırasında 38 santigrat derecede bir kuvözde saklayın.

Büyük domuz folikülüfoliküler sıvıaspire ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 100 kez G santrifüj. Daha sonra, 0,2 mikrometrelik membran gözenek filtresine bağlı steril bir şırınga kullanarak supernatant filtre ve negatif 80 santigrat derece de hızlı dondurma. COC'leri orta boy foliküllerden izole etmek için, 2-3 yumurtalıkları HM ile dolu steril 10 santimetrelik Petri kabına aktarın. Hafifçe foliküler sıvı ve COCs Petri kabına dışarı akmasına neden olacak steril bir cerrahi sayı 15 bıçak ile çıkıntılı yumurtalık folikülleri yüzeyini kesti.

Tek kullanımlık bir şırıngaya bağlı 28 gauge iğne ile foliküler içeriği aspire ve başka bir Petri kabına aktarın. IVF Petri yemekleri hazırlamak için, merkezi kuyulara bir mililitre HM ekleyin ve dış halkalara üç ila dört damla HM yerleştirin. Daha sonra, hasar görmemiş COC'ları dış halkalarda HM damlalarına taşımak için bir polikarbonat mikropipet kullanın ve kısa bir süre için 3-4 kez durulayın.

Bittiğinde, ayrı ayrı merkezi kuyuya aktarın. Tüp bebek plakalarını kuvözde saklayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi trombin ve fibrinojen çözeltileri hazırlayın.

İşlem günü, fibrinojen çözeltisini buz üzerinde yavaşça eritin ve kullanmadan hemen önce oda sıcaklığına getirin. Mix 0.5%aljinat çözeltisi ve fibrinojen çözeltisi bire bir oranında iki mililitre son hacmi için ve yavaşça karışımı girdap. Cam mikroskop slaytlarına ince parafin film şeritleri uygulayarak kuluçka odalarını onarın.

Pipet 7.5 mikrolitre fa karışımı damla parafin film kaplı cam slayt üzerine ayıran spacers ile, sekiz ila 10 damla iki satır düzenlenmiş yerleştirerek. En az olgunlaşma ortamı hacmiyle birlikte, FA damlasının merkezine üç ila beş CO'yu aktarmak için bir mikropipet kullanın. Her FA damla üstüne trombin çözeltisi 7,5 mikrolitre ekleyin onu kapsayacak şekilde.

Jel neredeyse anında formları çünkü onları karıştırmak için gerek yoktur. Kuluçka odasını önceden hazırlanmış bir cam kaydırakla kaplayın, sonra odayı ters çevirin ve nemli filtre kağıdıyla kaplı 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Petri kabını 38 santigrat derecede %5 karbondioksite 5-7 dakika koyun.

Kuluçkadan sonra, her FA kapsülü 100 mikrolitre olgunlaşma ortamı içeren 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Her iki günde bir, ortamın yarısını taze önceden dengeli olgunlaşma ortamıyla değiştirin. Image COC 10x büyütme de ters ışık mikroskobu kullanıyor.

COC'leri dört gün boyunca biraraya çıkardıktan sonra, olgunlaşma ortamını kuyulardan çıkarın ve DMEM'de mililitre başına 10 uluslararası üniteden 100 mikrolitre ekleyin. Kültür plakasını kuvözde 25-30 dakika bekletin. Çözünmüş kapsüllerden COC'leri çıkarın.

DMEM birkaç kez yıkayın, sonra PBS içeren bir IVF çanak iç halka aktarın. 30 milimetrelik Petri kabında beş gram FEP tozu bir yatak yapın. FEP tozu üzerine üç ila beş COC içeren olgunlaşma ortamının tek bir damlatma dağıtın.

Parçacıkların sıvı damlayüzeyini tamamen kaplayıp sıvı bilyeler veya LM'ler oluşturmasını sağlamak için plakayı dairesel bir hareketle hafifçe döndürün veya LM'ler. Birkaç 60 milimetrelik IVF Petri yemekleri hazırlayın ve nem haznesini oluşturmak için dış halkalara üç ila dört mililitre steril su ekleyin. 1000 mikrolitrelik pipet ile oluşan LM pick up ve merkezi kuyuiçine yerleştirin.

Mermerleri 4 gün boyunca 38 derecede karbondioksit inkübatöründe 4 gün kuluçkaya yatırın. Ortamı değiştirmek için, her LM'ye 30 mikrolitre olgunlaşma ortamı uygulayın, bu da onun yayılmasına neden olur. Mermer içeriği eridiğinde, biyoreaktörden salınan COC'leri Petri kabındaki taze olgunlaşma ortamına aktarın.

Olgunlaşma ortamında 3-4 yıkAmadan sonra, 30 mikrolitre taze ortamla birlikte COC'leri FEP toz yatağına aktarın. Toz parçacıklarının sıvı damlasının yüzeyini tamamen kaplamasını ve yeni bir LM.Then oluşturmasını sağlamak için plakayı dairesel bir hareketle hafifçe döndürün ve LM'yi IVF Petri kabına aktarın. Hem in vitro olgunlaşma sistemleri sıkıca birbirine yapışmış granüloz hücreleri ve kümülüs hücrelerinin bozulmamış katmanları ile COCs üretti.

COC canlılık analizi, her iki kapsülleme sisteminde de optimum büyüme koşullarının sağlandığını doğrulamıştır. Her iki grupta da sadece yüksek canlılık oosit leri gözlendi. Yumurtalar iletim elektron mikroskobu ile görüntülendi.

Mitokondri eşit olarak dağıtıldı ve kabuk benzeri bir şekle sahipti. Sadece birkaçı uzamış ve kümelenmeleri düzensiz bir şekilde gözlemlenmiştir. Endoplazmik retikulum ya mitokondri ile ilişkili ya da yumurta sitoplazmasında serbestti.

Sıvı damlacıklar küçük, koyu, yuvarlak yapılar olarak ortaya çıktı ve Golgi aparatı dilate sarnıç ile ortaya çıktı. Fa kapsüllerini kuluçka odasından kültür plakalarına aktarırken ve format LM'yi IVF Petri kabına alıp aktarırken hassas ve dikkatli olmak önemlidir.