Name: Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Öğrenin, sıçan vokal kıvrımını kriyoseksiyon ve histokimyasal analiz için hazırlama yöntemini. Bu protokol, nöromüsküler adaptasyonları incelemek için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü'nden F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) ve K23DC014517 (Johnson, PI) hibeleri ile desteklendi.

Bu çalışma New York Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. Sıçan larinksi diseksiyon
<ol><li>Kurumsal olarak onaylanmış protokole göre sıçanı ötenazi edin. Doku örneklerinde kürk kirlenmesini önlemek için ventral boynu mandibuladan manubriuma tıraş edin ve alkolle sürün.</li>
	<li>10x büyütmeli bir diseksiyon dürbün altında, nefes borusu açığa çıkına kadar neşterle orta hat boyun kesisi oluşturarak tüm larinksi kesinleştirin.</li>
	<li>Dış dıştrinsik gırtlaj kaslarını orta çizgide ayırarak, karaçamı, önps ve diseksiyon makası veya neşter kullanarak ortaya çıkarır.</li>
	<li>Trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya kesin ve diseksiyon makası kullanarak tüm larinksi çıkarmak için hyoid kemiğine bir kesi rostral yapın.</li>
	<li>Dışsal gırtlak dokularını (yemek borusu, tiroid bezi ve dıştrinsik gırtlak kasları) büyütme altında mikrodiseksiyon araçları (cımbız, pim ve mikros makas) kullanarak gırtlaktan çıkarın.</li>
	<li>Mikroscisörlerle, arka krikoarytenoid kasları arasındaki orta çizgiyi bir dönüm noktası olarak kullanarak gırtlağı arytenoidler arasında dorsally olarak ikiye ayırın. Ses kıvrımlarını ortaya çıkarmak için larinksin yanal duvarlarını sabitleyin ve daha sonra mikroscisörlerle ses kıvrımlarının ön komiseri arasındaki tiroid kıkırdayının orta çizgisi boyunca ventral olarak ikiye ayırın (Şekil 1). NOT: Bu adım isteğe bağlı olabilir; larinksi bütün tutmak için atlanabilir. Laringlerin bizeksiyonu, aynı larinksin sağ ve sol taraflarını ayrı ayrı kullanarak birden fazla immünostainasyon tekniğine izin verir.</li>
	<li>Her bir hemi-gırtlağı fosfat tamponlu çözeltide (PBS) ~10 s durulayın ve donma sırasında buz kristali oluşumunu azaltmak için bir görev silecek ile hassas bir şekilde kurulayın.</li>
</ol>2. Largeal dokuyu düzeltin ve/veya flaş dondurun
NOT: Fiksasyon tüm immün sistemi baskılama protokolleri için ideal olmayabilir. Genellikle laringeal dokular diseksiyondan hemen sonra flaş donmuş tazedir. Fiksasyon yapmadan laringeal dokuyu flaş dondurmak için adım 2.1'i atlayın.
<ol><li>Hemi-larynges sabitlemek için dokuları PBS'de% 4 formaldehit ile dolu santrifüj tüpüne 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat yerleştirin. Dokuları temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'de 20 dakika boyunca 3x durulayın. Daha sonra temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de% 20 sakkaroz /% 5 gliserol çözeltisine (~ 18 saat veya doku batana kadar) batırın. DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte duman kaputunda kullanılmalıdır.</li>
	<li>Tüm hemi-larynges'i düzgün bir konuma, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile dolu bir kriyo kalıbına yerleştirin. Hemilarynx için, ses kıvrımının medial yüzeyine sahip dokuyu kriyodoldun altına ve vokal kıvrımının boyuna yönüne kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak yerleştirin. Tüm larynges için, arka krikoarytenoidler kriyooldun altına ve kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak vokal kıvrımının boyuna yönüne bakan dokuyu yerleştirin. NOT: OCT bileşiği içindeki tutarlı gırtlaj yönelimi, sıçan vokal kıvrımının kriyoseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Hemilarynx gömülüp dondurulduktan sonra, yönünü değiştirmek için çözülmelidir, böylece birden fazla çözülme-donma döngüsünden doku hasarı riskleri ortaya getirilmelidir.</li>
	<li>Sıvı nitrojenle çevrili çelik bir beherde soğutulmuş izopentan (2-metilbütan) kullanarak flaş donduran dokular. NOT: Beherin yanlarında ve dibinde beyaz çökeltiler oluşmaya başladığında izopentan doku dondurma için en uygun sıcaklığa ulaşır13. Izopentan, sıvı nitrojenden daha yüksek bir termal iletkenliğe sahip olduğu için kullanılır, bu da hızlı donma sırasında doku bloğunun çatlamasını önlemeye yardımcı olur. OTC'deki donma dokusunun daha ayrıntılı bir açıklaması için Kumar ve ark.13'e bakın.</li>
	<li>Her kalıbı önceden etiketlenmiş folyoya sarın ve dehidrasyonu önlemek için ayrı bir dondurucu torbasına yerleştirin ve -80 °C dondurucuda saklanmak üzere transfer edilene kadar hemen kuru buzda saklayın.</li>
</ol>3. Kesit düzleminde kriyoseksiyon hemilarynx
<ol><li>Kriyostattaki oda sıcaklığını, üretici kılavuzu tarafından kas dokusu kesiti için önerilen sıcaklık aralığının (15−25 °C) ortasındaki -20 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Kriyostat kesit kalınlığını 10 μm kalınlığında bölümlere ayarlayın. NOT: Kas lifi kesit analizi için, 10 μm kalınlığındaki bölümler, fiber tipleme analizi için etiketli kas liflerinin tam boyama ve sağlam görüntüleme yoğunluğuna izin vermek için en uygun bölümlerdir14,15,16. Bazı protokoller nöromüsküler hedeflere bağlı olarak farklı kesit kalınlığı gerektirebilir.</li>
	<li>Dokuları kriyostat odasına aktarın, kriyostat numune diskine (chuck) düzgün bir OCT bileşiği katmanı ekleyin ve gömülü doku bloğunu örnek diskteki OCT bileşiğin üzerine yerleştirin. Tirarytenoid (TA) kas lifi analizi için vokal kıvrımının kesitlerini elde etmek için, numuneyi aynaya yapıştırın, böylece ventral tiroid kıkırdağı kriyostat bıçağına ve arytenoid kıkırdak örnek diske bakacaktır. NOT: OCT bileşiği dondurulduğunda beyaz ve opak hale geldiğinden, bu yer işaretlerinin bu aşamada görünmediğini belirtmek önemlidir. Bu görünürlük eksikliği, flaş dondurma aşamasında hemilarynx'in yönünü not etmenin kritik öneme sahip olmasının nedenidir.</li>
	<li>Tiroid kıkırdantının ventral kısmı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.</li>
	<li>Daha sonra tiroid kıkırdılmasının başlangıcından lamina propria, medial TA kasları ve lateral TA kası açığa çıkarana kadar 30 μm kesitleri kırpın ve izleyin. NOT: Gırtlağı simgesel yapılar izlenmeli ve kesit açısının eğik olmadığından emin olmak için tiroid kıkırdajının başlangıcından itibaren her 100 μm'de bir not edilmelidir. Şekil 2 , kesit düzlemdeki iki laringeal yer işareti kümesini 10x büyütmede temsil eder.</li>
	<li>Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 10 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.</li>
	<li>Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın. NOT: Sabit doku IHC hedefine bağlı olarak PBS'de bir haftaya kadar saklanabilirken, düzeltilmemiş doku derhal işlenmelidir.</li>
</ol>4. Boyuna düzlemde kriyoseksiyon hemilarynx
<ol><li>Kriyostat odası tekrar -20 ° C'ye ayarlanmışken, kesit kalınlığını 30 μm'ye değiştirin. NOT: NMJ analizi için, sinir terminali veya motor plakasının parçalanması olmadan gırtlaj kasları içindeki birkaç tam NMJ'yi yakalamak için 30−60 μm arasında bir doku kalınlığı kullanılabilir11,12,17.</li>
	<li>TA kasının NMJ analizi için boyuna vokal katlama bölümleri elde etmek için, numuneleri aynaya yapıştırın, böylece epiglottis kriyostat bıçağına ve trakeal lümen numune diskine doğru aşağı doğru yönelir.</li>
	<li>Tiroid kıkırdağı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.</li>
	<li>Tiroidin başlangıcından TA kasının lamina propria ve medial ve lateral bölünmelerine kadar 30 μm'lik bölümleri kırpın ve izleyin. NOT: Boyuna düzlemdeki beş laringeal yer işareti seti, doku derinliğinin hedef TA kasına doğru ilerlemesini izlemek için önerilir. Şekil 3 , 10x büyütmede boyuna düzlemdeki laringeal işaretleri temsil eder.</li>
	<li>Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 30 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.</li>
	<li>Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).</li>
<li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging%3A+Relevance+to+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li>
<li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li>
<li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Communication+Disorders%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li>
<li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li>
<li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intravenous+cocaine+experience%3A+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anatomic+study+of+the+rat+larynx%3A+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+and+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li>
<li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li>
<li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li>
<li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li>
<li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nöromüsküler analiz için sıçan vokal kıvrımlarının hazırlanması çeşitli zorluklarla karşı karşıya olabilir. Gırtlağı kasları sadece küçük ve kıkırdakla çevrili değildir, böylece doğrudan hedef kasın çıkarılmasını zorlaştırır, ayrıca gırtlağı anatomik yer işaretlerinin derinliğinde hayvanlar arasında yüksek değişkenlik bulunmuştur. Kesit düzlem protokolünü kaslamak için, ventral tiroid kıkırdajının ilk görünümünden sonra 21−85 bölüm (bölüm başına 10 μm) arasında tam ses kıvrım bölümleri ortaya çıktı, bu da NMJ analiz prot...

Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm'den daha az içinde bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11'in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.
Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>2-Metilbütan Sertifikalı</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Maşası SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>bıçakları CL Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Taban Kalıpları 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık</td> Alt <td>Pedler Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Dondurulmuş Kesit</td> Orta <td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>Bel-Art</td><td></td><td></td>11999054</tr><tr><td>İmmünostain Nem Odası</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucular</td><td>Assi</td><td>ASSI. B148</td><td></td></tr><tr><td>Dokumasız Süngerler, 4 Katlı</td><td>Hızlı Medikal</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap kalem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 w/v aq. soln., metanol içermez</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Numune Saklama Çantalar</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Dereceli Ölçü 32 oz / 100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Görev sileceği</td><td>Kimberly-Clark Professional & 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Desen Makas</td><td>Assi</td><td>ASSI. </td><td></td>SAS15RV</tr><tr><td>NOT: Tüm sarf malzemeleri için bunlar satın alınacak ekipman örnekleridir. Yöntemlerimizi tamamlamak için kesin model gerekli değildir.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nöromüsküler analizler için sıçan vokal kıvrımının hazırlanması

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Bu öğreticinin amacı histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımının hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu protokol, sıçan gırtlağım diseksiyonu, flaş dondurma ve ses kıvrımlarının kriyoseksiyonu için prosedürleri özetlemektedir. Bu çalışmada hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde kriyoseksiyon vokal kıvrımlarının nasıl ağlaşılacağı açıklanmaktadır. Bu protokolün bir yeniliği, kriyoseksiyon sırasında içsel gırtlağın doğru tanımlanmasını sağlayan ve doku kaybı olasılığını azaltan gırtlağı takibidir. Rakamlar her iki düzlemde de ilerleyici kriyoseksiyon olduğunu gösteriyor. Tiroid kıkırdılmasının ortaya çıkışından tam vokal kıvrımını içeren ilk bölümün görünümüne kadar yirmi dokuz sıçan hemi-larynges kriyoseksiyon ve izlendi. Tam vokal kıvrımı her iki düzlemdeki tüm hayvanlar için görselleştirildi. Tiroid kıkırdajının görünümünden her iki düzlemde de tam ses kıvrımının görünümüne kadar olan mesafede yüksek değişkenlik vardı. Ağırlık, laringeal yer işaretlerinin derinliği ile ilişkili değildi, bu da bireysel değişkenlik ve doku hazırlığı ile ilgili diğer faktörlerin, bölümleme sırasında yer işaretlerinin görünümündeki yüksek değişkenliklerden sorumlu olabileceğini düşündürdü. Bu çalışma bir metodolojiyi detaylandırıyor ve sıçan vokal kıvrımını histokimyasal nöromüsküler araştırma için hazırlamak için morfolojik veriler sunuyor. Yüksek bireysel değişkenlik nedeniyle, aşırı doku ve doku kaybını önlemek için kriyoseksiyon sırasında gırtlağı yer işaretleri yakından takip edilmelidir. Yeterli doku hazırlama ve sıçan larinks içindeki yer işaretlerinin farkındalığı da dahil olmak üzere tutarlı bir metodolojinin kullanılması, çalışmalar genelinde tutarlı sonuçlara yardımcı olacak ve laringeal nöromüsküler mekanizmaları araştırmak için sıçan vokal kıvrımını bir model olarak kullanmakla ilgilenen yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır.

Temsili sonuçlar, vokal egzersizinin laringeal nöromüsküler sistem üzerindeki etkilerinin devam eden bir araştırmasının bir parçasıydı. 29 erkek Fischer 344/kahverengi Norveç sıçanı (12 9 aylık, 17 24 aylık) CO2 inhalasyonu ve ardından bilateral torakotomi ile tartıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi.
Prosedürler, lateral ve medial TA kaslarının NMJ'leri ve lif boyutunu etiketlemek için belirtilen protokolü izledi. Gırtlağı simgesel yapıları arasındaki mesafe, kriyoseksiyon sırasında i...

Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Bu protokol, optimal boylamsal ve kesitsel analiz için sıçan ve vokal kıvrımın hazırlanmasını kolaylaştırır. Protokol, intrinsik laringeal kasların doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak ve doku kaybı olasılığını azaltmak için kriyoseksiyon sırasında gırtlak takibini kullanır. Rant larinks, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yanıt olarak yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir.Bu gösteri vokal kıvrımın tiroaritenoid kasına odaklansa da, metodoloji diğer intrinsik laringeal kaslara da uygulanabilir. Sıçan gırtlağının diseksiyonu için, ventral boynu mandibuladan manubriuma kadar tıraş edin ve doku örneklerinin kürk kontaminasyonunu önlemek için maruz kalan alanı alkolle temizleyin. Fareyi 10 kat büyütme ile diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve trakea açığa çıkana kadar orta hat boyun kesisi yapmak için bir neşter kullanın.Orta hattaki ventral ekstrinsik laringeal kasları ayırmak için forseps ve keskin bir alet kullanın ve trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya ayırın. Gırtlağı çıkarmak için, üçüncü trakeal halkaya kaudal ve hyoid kemiğe rostral bir insizyon yapmak için diseksiyon makası kullan

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hareketi sırasında memeli nöronlar in vivo fizyolojik tepki ölçmek ve nöronal morfoloji, nörokimyasal fenotip ve sinaptik mikrodevreler nöron fizyoloji ilişkilendirmek için bir teknik tarif edilir.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Sentetik vokal kord modelleri imalatı için metodoloji tarif edilir. Modelleri gerçek boyutlu ve çok katmanlı yapısı, insan vokal kıvrımların taklit. Sonuçlar modelleri akciğer basıncı karşılaştırılabilir basınçlarda öz-salınım ve insan vokal kıvrım bu benzer akış kaynaklı titreşimli tepkiler göstermek göstermektedir.

Sentetik, Multi-Layer, Self-Salınımlı Vokal Fold Model Fabrikasyon

Kaynak: Andreatta, RD ve diğerleri, Ozmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Deri Altı Nörotrofin 4 İnfüzyonu Yaşlanma Sıçan Laringeal Kaslarını Geliştirir. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, yaşlanmaya bağlı denervasyon ve azalmış nöromüsküler kavşaklardan etkilenen laringeal kas fonksiyonunu eski haline getirmek için yaşlı bir sıçan modelinde nörotrofin 4 (NTF4) infüzyonunu göstermektedir. NTF4, sinir rejenerasyonunu tetikler ve nöromüsküler kavşak oluşumunu teşvik ederek...

Yaşlı Bir Sıçanda Laringeal Sinir Rejenerasyonu için Nörotrofin 4 İnfüzyonu

Koku ensheathing hücreleri (OECS), birincil koku nöronların büyümesine izin vermek nöral tepe hücreleri bulunmaktadır. Bu özel özellik, hücresel nakli için de kullanılabilir. Burada bir gırtlak sinir yaralanması modelinde OECS kullanımına göre hücre transplantasyonu bir model mevcut.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Solunum yetmezliği servikal omurilik yaralanması sonucu ölüm önde gelen nedenidir. Kısmi servikal yaralanma tarafından uyarılan solunum yetmezliği, tekrarlanabilir ölçülebilir ve güvenilir klinik öncesi hayvan modeli olan müteakip solunum ve non-solunum nöroplastisiteyi anlamak için yardımcı ve varsayılan onarım stratejilerini test sağlayacaktır.

Post-lezyonlu Solunum nöroplastisite Eğitim için Servikal Spinal Kord Yaralanması bir fare modeli

Burada, sistemik olarak ve direkt olarak sıçan yaşlanmasına bağlı laringeal kasların yeniden şekillendirilmesi için nevrotropin 4'ü (NTF4) tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Anestezik fare modelinde dildeki kas tonusu ve viskoelastik özelliklerini belirlemek için cerrahi bir prosedürü tarif ediyoruz. Prosedür, hipoglossal sinirlerin spesifik olarak uyarılmasını ve kaslara pasif Lissajous kuvvet / deformasyon eğrilerinin uygulanmasını içerir.

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

Bu protokol, fareler ve sıçanlar için, optimize edilmiş bir anestezik rejim ve ince ayarlı endoskopik manipülasyon teknikleri kullanılarak solunum ve yutma sırasında gırtlağın yakından, engelsiz video görüntülemesine izin veren bir seri transoral laringoskopi yaklaşımını tanımlar.

Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesi için minimal invaziv murin laringoskopi

Bu çalışmada, sıçan diyaframlı motor ünitesi bağlantısını ölçmek için motor ünite sayısını ve boyutunu tahmin etmek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklere adım adım bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Frenik Motor Nöron Dejenerasyonu ve Kompanzasyonunun Kantitatif Biyobelirteçleri Olarak Sıçan Diyafram Motor Ünitesi Bağlantı Sonuç Ölçütlerinin Değerlendirilmesi

Laboratuvar fare ve fare ultrasonik seslendirmeleri (USV'ler), ses ve sinir fonksiyonlarını incelemek için faydalıdır. Bu protokol, çiftleşme ile ilgili sorunlar olmadan iştah açıcı USV'leri güvenilir şekilde ortaya çıkaran bir gıda-ödül paradigmasını tanımlar. Hayvan koşullandırma, uyarıcı sunum, kayıt ve akustik analizleri detaylandırarak, duygusal motivasyonel ve kafatası sensorimotor fonksiyonlarını incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunar.

Laboratuvar sıçanları ve farelerde iştah açıcı ultrasonik seslendirmelerin önleyici gıda-ödül çıkarılması

Öğrenin, sıçan vokal kıvrımını kriyoseksiyon ve histokimyasal analiz için hazırlama yöntemini. Bu protokol, nöromüsküler adaptasyonları incelemek için güvenilir bir model sunar.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

Daha fazla video keşfet