Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Otomatik cPILOT protokolümüz, araştırmacıların numuneleri yüksek bir veri elde etme yoluyla analiz etmesini kolaylaştırır. Bu önemlidir, çünkü hastalıklar veya farklı koşullar hakkında biyolojik bilgilere çok daha hızlı ulaşabilmek için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, birden çok örneği paralel olarak işlemeye yardımcı olması ve böylece yüksek iş gücü örneklerini kullanırken işlem yapılabilir hataları azaltmasıdır.

Laboratuvarımız yaşlanma ve Alzheimer hastalığı ile ilgili uygulamalarla ilgilenmektedir. Ancak, bu teknik aynı zamanda herhangi bir hastalık veya biyolojik dokular dahil olduğu için sorun çalışma için kullanılabilir. Pozitif basınç aparatı, ısıtma ve soğutma cihazı ve vakum pompaları açarak başlayın.

Bilgisayara bağlanıp çalışmaya hazır olduğunda mavi ışık gösteren sıvı işleyiciyle tüm aksesuarları bağlayın. Aliquot 300 karaciğer mikrolitre 500 mikrolitrelik bir tüp içine homojen ve iki mililitre derin kuyu plaka üzerine yerleştirin. Protokolün başlangıcına kadar numuneyi dört santigrat derecede saklayın.

Yazılımdaki yöntemi açın ve gerekli ipuçlarını ve laboratuvar yazılımlarını konumlarına yerleştirin. Ardından son güverte düzenini çapraz olarak denetleyin ve protokolü devam etmek için İleri'yi tıklatın. Yük 230 mikrolitre ipuçları ve rezervuar sekiz molar üre 90 mikrolitre aspire.

Sonra siyah iki mililitre derin derin plaka bir satır için dağıtın. TL1'in uçlarını boşaltın ve üre tüm kuyulara eklenene kadar bu adımı tekrarlayın. Denatürasyon tamponu ekledikten sonra, derin kuyu plakahomogenate fare karaciğer10 mikrolitre aktarmak için 90 mikrolitre ipuçları kullanın.

İpuçlarını boşaltın, ardından bir sıra 90 mikrolitre uç yükleyin ve bir reaktif plakasından üç mikrolitre DTT aspire edin. DTT'yi derin kuyu plakasının bir ve iki sıralarına dağıtın. Numune plakasını alüminyum folyo ile kapatın ve 300 RPM'de dönerken 37 santigrat derecede 600 saniye kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, 90 mikrolitrelik bir sıra yükleyin, altı mikrolitre IAM IAM'ı üçüncü satırdaki reaktif plakasından aspire edin ve örnek plakadan birine verin. Numune plakasını kapatın ve soğutma cihazında 300 RPM'de dönerken 30 dakika boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra numune plakasının mührünü kapatın ve 90 mikrolitrelik bir sıra yükleyin.

İkinci satırdaki reaktif plakadan beş mikrolitre sistin alın ve örnek plakanın bir ve iki sıralarına dağıtın. Tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 30 dakika boyunca 1800 RPM zamanında sallayın.

Sonra 2 0 000 mm tris tampon 800 mikrolitre ekleyin 10 milimolar kalsiyum klorür her kuyuya iki azı laksetmek için üre konsantrasyonu seyreltmek için örnek plaka üzerinde. 96 kuyu plakasının ilk satırına 20 mikrolitre tripsin ekleyin ve plakayı güvertede belirli bir yere yerleştirin. Numune plakasına tripsin ihraci ekledikten sonra, onu kapatın ve ısıtma ve soğutma cihazında 37 santigrat derecede 15 saat kuluçkaya yatırın ve 600 RPM'ye yerleştirin.

Formik asit plakasının üçüncü sırasından 150 mikrolitre 5 formik asit azarlayarak ve birinci ve ikinci satırdaki numune plakasına dağıtarak sindirimi durdurun. Peptidleri tuzdan arındırmaya devam edin. Aspire 600 mikrolitre asetonitril için 1070 mikrolitre ipuçları kullanın.

Daha sonra C-18'i etkinleştirmek için katı faz ekstraksiyonunun veya SPE plakasının bir ve iki sırahalinde dağıtın. Daha sonra, sindirilmiş numuneyi iki geçişte SPE plakasına yükleyin. İki sıra ipucu yükleyin, sindirilmiş numunelerin 534 mikrolitresini aspire edin ve bunları SPE plakasının bir ve ikisine dağıtın.

Plakaya basınç uygulayın ve tüm numuneler yüklenene kadar bu adımı tekrarlayın. Su ile yıkayarak peptidleri temizleyin ve peptidleri %0,1 formik asitte 60-40 asetonitil ile seyreltin. Daha sonra pozitif basınç aparatı kullanarak peptidler elite bir toplama plaka üstüne plaka yerleştirin.

Akış aşağı çizin ve yazılım gerekli ipuçları ve labware kurmak, güverte düzeni ile çapraz kontrol ve dimetilasyon için protokol devam etmek için İleri'yi tıklatın. Peptidleri %1 asetik asitle yeniden oluşturur. Dimetilasyon etiketleme yapmak için, 90 mikrolitre uçları yükleyin ve reaktif plaka iki ikinci satırından 60 milimolar ışık formaldehit 16 mikrolitre aspire.

Örnek plakadan birini sıraya dizmek için dağıtın ve ardından uçları boşaltın. 90 mikrolitre uçları bir satır yük ve reaktif plaka iki satır üç 60 milimolar ağır formaldehit 16 mikrolitre aspire. Örnek plakanın iki sırasını dağıtın ve uçları boşaltın.

Yük 90 mikrolitre ipuçları ve aspire 16 mikrolitre 24 milimolar sodyum cyanoborohyride ve 24 milimolar sodyum cyanoborodeuteride satır bir ve iki reaktif plaka üç, sonra dimelasyon reaksiyonu başlatmak için örnek plaka bir ve iki reaktifdağıtmak. Uçları boşaltın ve 1800 RPM'de 15 dakika boyunca zamanlanmış bir sarsıntı gerçekleştirmek için orbital shaker kullanın. Daha sonra 90 mikrolitre uçtan oluşan iki sıra yükleyin ve 3.

Reaksiyonu durdurmak için bir ve iki örnek plaka iki satır içine dağıtın. Tuzsuzluk için yeni bir iki mililitre derin kuyu plaka hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler eşit hacimlerde birleştirin. Kombine hafif ve ağır peptidler desalting sonra, peptidler aşağı kuru ve isobarik etiketleme gerçekleştirin.

Bir orbital shaker üzerinde 100 milimolar triethylonnium bikarbonat tampon 100 mikrolitre ile peptidler yeniden. Daha sonra 90 mikrolitre uçlarını kullanarak 25 mikrolitre kombine dimetilpeptid'i aspire edin ve Bunları TMT işleme plakasının ilk satırına dağıtın. Bir sıra 90 mikrolitre uç yükleyin ve 10 mikrolitre TMT aspire edin.

TMT işleme plakasının ilk satırında dağıtın, ipuçlarını boşaltın ve 1800 RPM'de bir saat boyunca zamanlanmış bir sarsıntı gerçekleştirin. TEAB plakasının ikinci sırasından sekiz mikrolitre hidroksilin aspire edin ve TMT işleme plakasından birine koyun. 1800 RPM'de 15 dakikalık bir sarsıntıdan sonra, TMT etiketli peptidlerin 30,5 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra el yazması talimatlara göre veri toplama ve analiz ile devam edin. 22 Plex kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme deneyinden 22 muhabir iyon kanalının tümlerinde tanımlanan bir peptidin temsili MS verileri burada gösterilmiştir. Peptit dizilimi betain-homosistein S-metiltransferaz'a karşılık gelir.

Hem hafif hem de ağır dimetillenmiş zirveler için en yoğun parça iyonları MS3 parçalanması için daha da izole edildi. Muhabir iyon yoğunlukları doğrudan örnekteki peptit bolluğu ile orantılıdır. Genel olarak, bu kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme deneyi numune işleme sürelerini kısaltarak protein ekspresyonunu birden fazla kanal veya koşulda görselleştirmeyi mümkün kılarak mümkün kalmıştır.

Tüm 22 kanal boyunca toplam muhabir iyon yoğunlukları karşı günlük 10 bolluk kutu arsa daha az inter-well veya inter-sample değişkenlik gösterir. Toplam otomasyonun değerlendirilmesi, 22 numunede her proteinde muhabir iyon bolluğundaki hata inceleyerek yapılmıştır. Robotik platform ile örnek işleme varyasyon çok düşük katsayıları sonuçlandı.

3098 peptidler arasında, muhabir iyon bolluğundaki ortalama değişim katsayısı hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler için sırasıyla %12.36 ve %15.03 idi. Bu protokol denerken, izotopik ve izobarik düzeylerin tek bir deneyde kullanıldığını göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu nedenle, denemede kullanılmak üzere tasarlanmış etiketleri ile her örnek belirlemek için dikkatli planlama yapılması gerekir.

Bu yöntem diğer robotik sistemlere kolayca entegre edilebilir ve doku veya hücre likatları ve diğer biyoakışkanlar gibi çeşitli dokulara uygulanabilir.