Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol önemlidir çünkü glia'nın bölgesel olarak heterojen, morfolojik, fonksiyonel ve genetik olarak olduğunu öğreniyoruz. Bu tekniğin birincil avantajı, merkezi sinir sisteminin dört farklı bölgesinden üç ayrı glia alt kümesini inceleyebilmenizdir. Bu prosedürü ben ve laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Rachel Tinky gösterecek.

Yavrunun başının orta hattı boyunca deri tabakasını kesmek için ince makas kullanın, kaudal olarak başlayın ve burnuna ulaşana kadar rostral hareket ettirin. Herhangi bir doku hasarını önlemek için kafatasını derinlemesine kesmekten kaçının. Başı aşağı doğru açı vererek, kutanöz tabakayı kafatasının her iki tarafına çekin ve foramen magnumdan başlayarak kafatası orta hattı boyunca bir kesi yapmak için yaylı makas kullanın.

Korteks, beyincik ve beyin sapını açığa çıkaran ince uçlu forseps ile kafatasının yarısını ayırın. Maruz kaldıktan sonra, beyni yavaşça kafatasından kaldırın ve 10 mililitre PBS ve antibiyotik solüsyonu ile 10 santimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Arka beyin takılıyken beynin hasar görmediğinden emin olun.

İnce kavisli uçlu forseps ile beyinciği sıkıştırın. Buz üzerinde belirlenmiş 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Orta beyni korteksten ayırın.

Kortikal meninksleri çıkarın ve belirlenmiş bir konik tüpe yerleştirin. Meninkslerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için doku dikkatlice incelenmelidir. Meningeal hücreler kültürde kalırsa, glial hücrelerin büyümesine zararlı olabilirler.

Omuriliği incelemek için, ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve omurilik dokusu açığa çıkana kadar sol ve sağ taraflar arasında geçiş yaparak omurları kesmek için ince yaylı makas kullanın. Omuriliği ve meninksleri nazikçe çıkarın ve buz üzerinde belirtilen konik tüpe yerleştirin. Doku ile her tüpe 0.53 milimolar EDTA ile bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin.

Karışımı 10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 kez ezin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik boş bir konik tüpe aktarın. Çözeltiyi 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 15 dakika inkübe edin.

Sekiz dakika sonra lizatları hafifçe çalkalayın. İnkübasyondan sonra, mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon için her tüpe bir tane olmak üzere beş mililitre MGM ve 200 mikrolitre DNase I ekleyin. Her lizatı 10 mililitrelik bir pipetle 10 kez ezin.

Daha sonra, ayrışmamış dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında üç dakika bekletilmesine izin verin. Hücre süspansiyonlarını, ayrışmamış dokuyu geride bırakarak yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini beş mililitre MGM'de yeniden süspanse edin ve 20 kez tritüre edin, hücre süspansiyonlarını kaplanmış T25 şişelerine yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Hücre kalıntılarını temizlemek için ortamı 24 saat sonra değiştirin. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonunu gerçekleştirmek için, hücreleri 15 saat boyunca çalkalayın, ardından süpernatanı şişeden çıkarın ve steril bir petri kabına koyun. Süpernatanı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin.

Kalan mikroglia'yı çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün. Yapışmayan hücre süpernatanı çıkarın, hücreleri sayın ve istenen konsantrasyonda Poli-D-Lizin kaplı bir yüzeye yerleştirin. Hücreleri en az bir saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Daha sonra ortamın %95'ini nazikçe aspire edin ve OPC'lerin bozulmasını en aza indirmek için kuyu duvarına pipetleyerek yavaşça ılık OPC ortamı ekleyin. Bu yöntem, interferon gama sinyalinin OPC farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkilediğini göstermek için kullanıldı. İnterferon gama reseptörü olmadan, kortikal OPC'ler olgun miyelinizan oligodendrositlere kolayca farklılaşmaz, bu da MBP boyamasının yokluğu ile kanıtlanmıştır.

GFAP ekspresyonu da analiz edildi. İnterferon gama eksikliği olan hücreler, GFAP'yi güçlü bir şekilde eksprese eder, bu da astrositik bir fenotipi benimsiyor olabileceklerini düşündürür. CNS hücrelerindeki bölgesel heterojenlik, korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilikteki değişen astrosit morfolojisi ile kanıtlanır.

Aynı bölgeden gelen astrositler de morfolojik heterojenlik sergileyebilir ve bu glial alt tipin oldukça dinamik olduğu fikrini destekler. OPC'lerin diferansiyel sitokin stimülasyonuna bölgesel yanıtları da araştırıldı. Sitokin sinyali, kök ve bağışıklık hücresi davranışını önemli ölçüde etkiler ve OPC'lerin olgun miyelinizan oligodendrositlere nasıl farklılaştığını etkileyebilir.

Rejyonel glial hücre izolasyonunu takiben hücreler, immünohistokimya, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve Western blotlama gibi çeşitli teknikler kullanılarak çeşitli deneysel koşullarda ve asitte kullanılabilir.