Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu protokol, makrofajlar, monositler, mikroglia ve dendritik hücreleri içeren mononükleer fagositlerin çok parametreli akış sitometrisi için tüm fare gözlerini tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin temel avantajı, hücre yüzeyi işaretleyici ifadesini kullanarak yakından ilişkili hücre tiplerini ayırt etmek için florofor yoğunluğu ile kantitatif analiz kullanma yeteneğidir. Protokolümüz, lazerle indüklenen koroidal neovaskülarizasyon modelinde hem yerleşik hem de sızan popülasyonlar dahil olmak üzere makrofaj heterojenliğinin analizi için optimize edilmiştir.

Bununla birlikte, bu kavramlar ve teknikler, diyabetik retinopati, deneysel otoimmün üveit ve lupus belirtileri gibi diğer modellere de eşit şekilde uygulanabilir. Bu protokolü denerken, tüm sitometreler tam olarak aynı şekilde yapılandırılmadığından, sitometrenizin yapılandırmasını anlamak kritik bir başlangıç noktasıdır. Bu nedenle, floresan konjuge antikor hacimlerinin titre edilmesi ve/veya sitometrenizin konfigürasyonuna bağlı olarak protokolü optimize etmek için floroforların ayarlanması gerekebilir.

Sindirim tamponunu el yazması talimatlarına göre hazırlayarak başlayın. Diseksiyon mikroskobu ve 10X toplam büyütme kullanarak, kalan konjonktiva ve optik siniri gözlerden çıkarın. Temiz gözleri kuru bir diseksiyon kabına veya küçük bir tartı teknesine taşıyın, ardından görsel eksen boyunca aralarında 90 derecelik bir açı olan iki delikli yara açın.

Her bir gözün vitreus boşluğuna 0,15 ila 0,2 mililitre sindirim tamponu enjekte etmek için 30 gauge iğneli bir şırınga kullanın. Yaylı makas ve ince forseps ile gözleri kıyın, ardından sonraki adımlarda pipet uçlarının tıkanmasını önlemek için lens dokusunu künt mekanik bozulma ile ayırın. Forseps ve makası 0,75 mililitre sindirim tamponu ile durulayın ve her numune için kabı değiştirin.

Yemeğin içindekileri buz üzerindeki bir ayrışma tüpüne aktarmak için bir P1000 pipeti kullanın ve herhangi bir malzeme kaybetmemeye dikkat edin. Çanağı 1,5 mililitre ek bir sindirim tamponu ile durulayın ve toplam hacmi 3,25 ila 3,5 mililitre arasına getirerek ayrışma tüpüne ekleyin. Dokuyu metin el yazmasında açıklandığı gibi bir elektronik ayrıştırıcı üzerinde ayırın, tüm dokunun ters ayrışma tüpünün dibinde ve sindirim tamponu ile temas halinde olduğundan emin olun.

Daha sonra ayrışma tüpünü 37 santigrat derece ve 200 RPM'de 30 dakika inkübe edin. Doku ayrışmasını iki kez daha tekrarlayın, numuneyi ayrışmalar arasında 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 10 mililitre soğuk akış tamponu ekleyin ve numune tüplerini buzun üzerine yerleştirin.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, durdurulmuş göz sindirim reaksiyonunu 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 40 mikrometrelik bir filtreden süzün. Kalan sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden geçirmek için 2,5 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın. Ayrışma tüpünü 10 mililitre akış tamponu ile yıkayın ve filtreyi durulayın.

Ardından, sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden tekrar geçirmek için aynı pistonu kullanın. Bu işlemi beş mililitre akış tamponu ile tekrarlayın. Ardından ayrışma tüpünü yıkayın ve son 10 mililitrelik bir akış tamponu ile filtreleyin.

Konik tüpü dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı boşaltın. Tüpü başka bir tüpe doğru iterek peleti parçalayın. Daha sonra bir mililitre lizasyon solüsyonu ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için tüpü oda sıcaklığında 30 saniye döndürün.

Reaksiyonu 20 mililitre akış tamponu ile durdurun ve konik tüpün 400 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjle. Hücre peletini bozmadan süpernatanı boşaltın. Tüpü başka bir tüpe doğru itin.

Sonra beş mililitre soğuk HBSS ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın. Bir P1000 pipeti kullanarak her numuneye 0,5 mililitre canlı ölü leke ekleyin ve peleti tamamen ayırdığınızdan emin olun.

Numuneleri 1.2 mililitrelik mikrotitre tüplerine aktarın ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Bu arada, tripan mavisi ve bir hemositometre ile numunenin 10 mikrolitrelik bir alikotunu sayın. İnkübasyondan sonra, her numuneyi 400 mikrolitre soğuk akış tamponu ekleyerek yıkayın.

Tüpleri bir mikrotitre tüp rafında 400 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin. Hücreleri 500 mikrolitre soğuk akış tamponunda tamamen yeniden süspanse edin. Ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın.

50 mikrolitre FC bloğunda beş milyona kadar canlı hücreyi bloke edin. Hücre peletini tamamen ayırın ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra her numuneye 50 mikrolitre antikor boyama solüsyonu ekleyin.

Tamamen karıştırın ve dört santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin. Tek bir farenin iki gözünden analiz edilen tüm olaylar için ileri saçılma alanı ve yan saçılma alanı özellikleri burada gösterilmiştir. Boncuk sayımları, APC-Cy7 üzerinde PE grafiği çizilerek temizlendi ve doğrulandı, bu da PE pozitif ve APC-Cy7 negatif olaylardan oluşan sıkı bir küme oluşturuldu.

Daha sonra, canlı hücrelerdeki tekiller tüm olaylardan tanımlandı. Tekliler, ileri saçılma yüksekliğine karşı ileri saçılma alanı arasında pozitif korelasyon gösterirken, ikili ve üçlü hücreler, ileri saçılma yüksekliğinden daha fazla ileri saçılma alanına sahipti. Canlı hücreler ileri saçılma alanı pozitif, canlı ölü leke negatiftir.

Canlı singlet hücrelerden mononükleer fagositlerin tanımlanması için ilk geçit stratejisi burada gösterilmiştir. Canlı singlelet'ler CD45'e karşı CD11b grafiği kullanılarak görselleştirildi. CD45 FMO'da CD45 pozitif hücrelerin olmaması kapı seçimini doğruladı.

Daha sonra, nötrofiller, eozinofiller, B hücreleri ve K hücreleri ve T hücreleri, CD11b'ye karşı soy kapısı ile CD45 pozitif canlı tekiller çizilerek dışlandı. CD45-dim hücreleri, CD45-yüksek hücrelerden ayırt edildi. Makrofaj alt kümeleri de tanımlandı.

CD64 pozitif MHC2 düşük boyanması ile CD45-dim hücrelerinde mikroglia tanımlandı. MHC2 negatif makrofajlar CD64 pozitif MHC2 negatif olarak tanımlandı. CD11c negatif ve CD11c pozitif makrofajlar CD64 pozitif, CD11c negatif olarak gösterildi.

ve MHC2 pozitif hücrelerde CD64 pozitif CD11c pozitif. Lazer tedavisinin MHC2 negatif, CD11c negatif ve CD11c pozitif makrofaj miktarını artırdığı bulundu. Dendritik hücre sayıları da lazer tedavisi ile yukarı regüle edilirken, mikroglia ve monosit sayıları etkilenmedi.

Sistemik perfüzyonun makrofaj sayıları üzerinde etkisi yoktu. Bu prosedürü takiben, tek başına analiz yerine floresansla aktive edilen hücre sınıflandırması, transkriptomik veya proteomik çalışmalar yoluyla makrofaj heterojenliğinin ve bunun fonksiyon üzerindeki etkisinin karakterizasyonuna izin verir.