Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

Bu yöntemin kullanılması, belirli gen ekspresyonu değişikliklerinin nörolojik hastalıklarla ilişkili patolojilere nasıl atfedilebileceğinin keşfedilmesine izin verebilir. Bu tekniğin avantajı, oluşturulması ve doğrulanması yıllar alabilen genetik hayvan hatları oluşturma veya satın alma ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Bu teknik, nörolojik bozukluklarda rol oynayan genlerin incelenmesine izin verir.

Spesifik genlerin patolojiye nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek, yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Bu protokolün avantajı, embriyoları manipüle etmeyi öğrenmektir, böylece deneyci hayatta kalma oranlarını düşürmeden gen transfer adımını gerçekleştirir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü embriyolar çok kırılgandır, bu nedenle deneyimli bir deneycinin işlem sırasında onları nasıl manipüle ettiğini gözlemlemek yararlıdır.

Ameliyattan en az 30 dakika önce hamile barajlarını ameliyat alanına getirin. Sterilize edilmiş mikrop öldürücü mendiller ve ardından %70 etanol kullanarak tüm ameliyat bölgesini sterilize edin. Daha sonra otoklav aletlerini bir cam boncuk sterilizatöründe sterilize edin.

Steril PBS'yi 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve tüpleri 38 ila 40 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. Steril tuzlu su sıcaklığını bir termometre ile kontrol edin. Su ısıtma sirkülasyon pompasını 37 santigrat dereceye kadar ısıtılacak şekilde açın.

Ardından basınç enjektörünü ve elektroporatörü açın ve düzgün çalıştığından emin olun. Plazma DNA çözeltisini bir masa üstü santrifüjde kısaca döndürün ve buzun üzerine yerleştirin. Cam pipetleri, çekilen cam pipetin ucu yaklaşık 50 mikrometre çapında olacak şekilde bir pipet çektirmesi üzerine çekin.

Ardından pipeti 20 ila 40 mikrolitre DNA çözeltisi ile doldurun. Tüy dökücü losyon, iyot, %70 etanol, pamuklu çubuklar, göz damlaları, dikişler ve gazlı bez dahil olmak üzere ameliyat için gerekli tüm öğeleri ayarlayın. Bir ameliyat formu hazırlayın ve gerekli bilgileri doldurun.

Ameliyattan önce fareyi tartın ve ağırlığı kaydedin. Fareyi uyuşturduktan sonra, ameliyat öncesi analjezikler uygulayın ve tüy dökücü krem veya tıraş bıçağı kullanarak kürkü karın bölgesinden çıkarın. Karnı üç kez povidon iyot ve% 70 etanol ile temizleyerek sterilize edin.

Steril gazlı bez ve örtü ile karın çevresinde steril bir alan oluşturun. Kasın kesilmesini önlemek için cildi forseps ile yukarı kaldırırken karın derisinde orta hat kesisi yapın. Ardından kasları yukarı kaldırın ve hayati organları kesmemeye dikkat ederek kesin.

Halkalı forseps kullanarak rahim boynuzlarını dikkatlice barajdan dışarı çekin ve dolgu ile desteklendiklerinden ve barajdan çok uzağa çekilmediklerinden emin olarak steril alana nazikçe yerleştirin. Önceden ısıtılmış steril PBS ile ameliyatın geri kalanı boyunca uterus boynuzunu nemli tutun. Bir embriyoyu forseps veya parmaklarla yerleştirin, ardından çekilen cam pipeti dikkatlice lateral dikeye yerleştirin ve pipeti bir ventriküle ve ardından diğer ventriküle sokarak her ventriküle iki ila üç mikrolitre enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra bir hilal şekli mevcutsa ventrikül başarılı bir şekilde hedeflenmiştir. Hücreleri frontal kortekste bilateral olarak transfekte etmek için, iki negatif elektrotu embriyonun başının yanlarına, lateral ventriküllere hemen lateral ve hafif kaudal olarak yerleştirin ve pozitif elektrotu gelişmekte olan burnun hemen önündeki gözler arasına yerleştirin. Embriyonun cömertçe nemlendirildiğinden emin olun ve dört kare darbe uygulayın.

Tüm embriyoları enjekte edin ve elektroparat edin, böylece her embriyo DNA çözeltisi enjeksiyonundan hemen sonra elektropore edilir. Tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, uterus boynuzlarını dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin. Rahim boynuzunun yerleştirilmesine yardımcı olmak için karın boşluğunu steril PBS ile kaplayın.

Karın boşluğunu steril PBS ile doldurun, böylece dikiş tamamlandıktan sonra hava cebi kalmaz. Kası emilebilir dikişlerle ve cildi ipek emilmeyen dikişlerle dikin. Barajın ısıtılmış bir odada en az bir saat boyunca tamamen iyileşmesine izin verin.

Önümüzdeki 48 saat içinde barajları düzenli olarak kontrol edin. Baraj anesteziden kurtulup bilincini geri kazandıkça, hareket etmeye ve çırpmaya başlayacaktır. Bu yöntem, pCAG-GFP plazmidi ile yaklaşık 5.000 katman 2/3 piramidal nöronu transfekte etmek için kullanıldı.

Bu hücrelerin çoğu frontal kortikal bölgelere lokalize idi. Temsili bir örnek, yetişkin bir kontrol faresinde transfekte nöronların rostral kaudal dağılımını göstererek, bilateral IUE'lerin frontal korteksteki büyük piramidal nöron popülasyonlarını hedefleme ve genetik olarak etiketleme yeteneğini doğrular. Anne etkileşimi görevinin ilk kısmı, P18 transfekte edilmiş farelerin yuva yatağını bulma yeteneğini test eder.

Kontrol fareleri, yuva yataklarını keşfetmek, yeni yatak takımlarını keşfetmekten daha fazla zaman harcadılar, bu da onların sağlam duyusal motor yeteneklerine ve keşif davranışına sahip olduklarını düşündürdü. Görevin ikinci kısmı, farelerin anneleriyle etkileşime girmeye motive olma eğiliminden yararlanır. Bu görevde, yavrular zamanlarının çoğunu annelerinin yanında geçirirken, boş bardağı veya yuva yatağını keşfetmek için önemli ölçüde daha az zaman harcarlar.

Yetişkin kontrol fareleri, zamanın yaklaşık% 35'ini yeni bir nesneyi keşfetmek için harcadı. Bir roman ve tanıdık bir nesne sunulduğunda, yetişkin fareler yeni nesneyi keşfetmek için daha fazla zaman harcadılar. Sosyalleşme görevinde, yetişkin fareleri kontrol etmek, yeni bir fareyi ve boş bir bardağı keşfetmek için benzer miktarda zaman harcadılar.

Bu davranış, uzuvlar, centroid, kafa ve kulaklar dahil olmak üzere bir fare üzerindeki çeşitli noktaları etiketleyerek DeepLabCut yazılımı ile otomatik olarak izlendi. Yazılım ayrıca, farenin vücudunun uzunluğunu inceleyerek farelerin ne zaman büyüdüğünü belirlemek için de kullanıldı, çünkü fare şahlandığında bu mesafe kısalıyor. Bu prosedürü takiben, dokuyu inceleyerek ve omurga yoğunluğu veya çeşitli proteinlerin ekspresyon seviyeleri gibi farklı ölçümleri test ederek birçok hücresel moleküler soru cevaplanabilir.