Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı
June 26th, 2020
Bu makalede, organik çözücü karışımlarında gama modifiye peptit nükleik asit oligomerlerinden nanoyapıların tasarımı ve kendi kendine montajı için protokoller sağlandığı belirtilmiştir.
Bu yeni protokol, sentetik nükleik asit taklit gama PNA'nın belirli organik çözücü karışımlarında nanoyapılar oluşturmak için birden fazla farklı dizinin kullanımını açıklamaktadır. Burada açıklanan tahliller, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin çok az veya hiç protokol yayınlanmamış organik çözücülere uyarlanma gereğini göstermektedir. Bu tekniğin yeni uygulayıcıları, nanomalzeme PNA'nın toplama eğilimi nedeniyle sulu-zengin ortamlar için geliştirilen mevcut protokolleri organik çözücü açısından zengin ortamlara uyarlamakta zorlanabilirler.
Gama PNA stokları hazırlayarak başlayın. Ticari bir üreticiden HPLC sınıfı saflaştırılmış gama PNA iplikçikleri aldıktan sonra, deiyonize sudaki her bir ipliği 300 mikromolar konsantrasyona geri alın. Gama PNA'larını eksi 20 derecede birkaç aya kadar saklayın.
Kendi kendine montaj yapmaya hazır olduğunuzda, %75 DMSO, %75 DMF ve %40 1, 4-dioksan toplu iş örnekleri hazırlayın. İlk olarak, ana stoktan 0,67 mikrolitre aliquoting ve 10 mikrolitre son bir hacim için deiyonize su ekleyerek her oligomer 20 mikromolar alt stokları hazırlayın. 20 mikromolar alt hisse senetlerinden her bir oligomerin bir mikrolitresini 200 mikrolitrelik PCR tüpüne ekleyin, bu da dokuz oligomer için toplam dokuz mikrolitre hacmine gelecektir.
40 mikrolitre lik son hacim için bir mikrolitre deiyonize su ile 30 mikrolitre susuz DMSO veya DMF ekleyin. 40%1, 4-dioksan toplu hazırlamak için, 1, 4-dioksan 16 mikrolitre ekleyin ve deiyonize su ile 40 mikrolitre hacmi getirmek. 90 ila 20 santigrat derece soğutma bir termal döngüc içinde 22,5 saat boyunca örnekler anneal.
Tipik olarak, iki oligomer ve üç oligomer gama PNA alt kümesi için elde edilen erime sıcaklıkları farklı çözücü koşulları için 40 ila 70 santigrat derece aralığında dır. Termal döngücörü el yazması talimatlara göre programla. Anneleştirme tamamlandıktan sonra, örnekler karakterizasyondan önce 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklanabilir.
Kutuyu yaklaşık beş mililitre suyla doldurarak boş bir pipet ucu kutusundan nem haznesi yapın. Nitroselüloz çözeltisi oluşturmak için izoamyl asetat çözücü ile amil asetat ticari olarak kullanılabilir% 2 kolokit 20 kat seyreltme hazırlayın. Nitroselüloz çözeltisine bir kapak daldırma ve hava-kuru izin için cımbız kullanın, sonra bir mikroskop slayt bir akış odası yapmak, iki çift taraflı bant şeritler, ve nitroselüloz kaplı coverslip.
Biotin BSA çözeltisini bir miligram biotin BSA tartarak ve bir mililitre PBS'de eriterek hazırlayın. Pipet 15 mikrolitre biotin BSA bir açıyla akış kanalına ve nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında 2-4 dakika kuluçka. Bir mililitre PBS'de bir miligram BSA'dan oluşan yıkama tamponunun 15 mikrolitresini, fazla biotin BSA'yı temizlemek için kanala üfleyin, sonra da akış kanalını nemlendirilmiş odada 2-4 dakika kuluçkaya yatırarak yüzeyi pasifize edin.
Ölçü 0.5 streptavidin miligram ve BSA bir miligram, sonra PBS bir mililitre her ikisi de çözünür. Pipet 15 mikrolitre streptavidin çözeltisi akış kanalına yerleştirin ve 2-4 dakika nemli haznesine yerleştirin ve 15 mikrolitre yıkama tamponu dederek kanalı yıkayın. Daha sonra, nemlendirilmiş odada gama PNA oligomerlerinin 15 mikrolitrelik kısmını boşaltın, sonra da bir milimolar Trolox'un 15 mikrolitresini nanoyapılarla aynı çözücü bileşiminde akıtarak bağlanmamış nanoyapıları yıkayın.
Akış kanalını slayt tutucuya aktarın ve TIRF görüntüleme, 60X yağ daldırma hedefi ve 1,5 X büyüteçle donatılmış bir floresan mikroskobuyla görüntüleyin. Cy3 kanalını izlerken akış kanalını 60 veya 90X büyütme de tazyin. El yazması talimatlara göre 20 ve%6 SDS stokları hazırlayın, ardından 200 mikrolitrelik PCR tüpüne her 20 mikromolar oligomerden bir mikrolitre ekleyerek gama PNA oligarmerlerini anneal.
40 mikrolitrelik son bir hacim için PCR tüplerine 30 mikrolitre susuz DMSO ve %6 veya %20 SDS mikrolitre ekleyin ve bu da sırasıyla 5,25 veya 17,5 milimolar son bir SDS konsantrasyonu ile sonuçlanır. Anneal gama PNA'lar termocycler daha önce açıklandığı gibi. TIRF veya TEM protokolünü kullanarak SDS varlığında gama PNA nanoyapılarını karakterize edin.
%75 DMSO'da bulunan gama PNA oligomerlerinin TIRF görüntülemesi iyi organize edilmiş mimariler gösterirken, %75 DMF'de annealing spicule şekilli veya iğne benzeri nanoyapılarla sonuçlandı. 40%1, 4-dioksan durumu ipliksi nanoyapıların seyrek bir dekorasyon üretti. Ayrıca, %75 DMSO'da oluşturulan gama PNA nanotüpleri, TEM görüntüleme sırasında yüksek büyütme veya nanoskobik çözünürlüklerde nanofiberlerin birleştirilmesini göstermiştir.
Nanoyapıların genişliğinin nicel analizi, maksimum değerler80 nanometrenin üzerinde olan 16,3 nanometre ortanca genişlik gösterdi. Bitişik gama PNA'larının yerini alan izoardiye DNA oligomerleri düz ipliksi yapılar oluşurken, çapraz gama PNA'larının değiştirilmesi yıldız yapılarına neden olur. Bitişik DNA oligomerleri ile değiştirilen nanoyapıların ortanca genişlikleri yaklaşık 19 nanometreidi.
Yüksek SDS konsantrasyonlarında, gama PNA nanofibers de TIRF görüntüleme ile bakıldığında kritik micelle konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında son derece ağ morfolojileri benimsemek. TEM görüntüleme, 5.25 milimolar SDS'deki gama PNA montajının yapısal donatmada en önemli azalmalara sahip olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, nanoyapıların toplama eğilimi nedeniyle belirtildiği gibi çözücü bileşimlerini korumak önemlidir.
Bu yöntemler uygulayıcıları farklı çözücü bileşimleri, yüzey aktif maddeler ve diğer PNA DNA nanoyapılarının keşfedilmemiş diğer yollarını takip etmeye teşvik eder.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, organik çözücü karışımlarında gamma-modifiye edilmiş peptit nükleik asit oligomerlerinden nanoyapıların tasarımı ve kendiliğinden birleşimi için protokoller sağlar. Yeni protokol, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin organik çözücülerde kullanım için uyarlanmasını vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nanoteknoloji
- Biyokimya
- Organik Kimya
Arka Plan
- Gamma PNA, sentetik bir nükleik asit taklididir.
- Mevcut protokoller öncelikle sulu ortamlar için tasarlanmıştır.
- Organik çözücüler nanoyapı oluşumu için benzersiz zorluklar sunar.
- Organik çözücülerde PNA'nın toplanması deneyleri karmaşık hale getirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Gamma PNA kullanarak nanoyapı oluşturma protokolü sağlamak.
- Organik çözücü ortamları için yayınlanmış protokoller eksikliğini gidermek.
- Uygulayıcıların mevcut teknikleri uyarlamaya yardımcı olmak.
Kullanılan Yöntemler
- HPLC sınıfı saflıkta temizlenmiş tellerden gamma PNA stoğunun hazırlanması.
- PNA tellerinin spesifik konsantrasyonlara deionize suda yeniden süspanse edilmesi.
- Gamma PNA'nın eksi 20 derece Celsius'ta depolanması.
- Organik çözücülerde kendiliğinden birleşimi değerlendirmek için testlerin yapılması.
Ana Sonuçlar
- Organik çözücülerde nanoyapıların başarılı bir şekilde oluşturulmasını göstermiştir.
- Sulu olmayan ortamlar için protokollerin uyarlanmasının önemini vurgulamıştır.
- PNA toplanması ile ilgili zorlukları belirlemiştir.
- Nükleik asit nanoteknolojisi alanında gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlamıştır.
Sonuçlar
- Çalışma, organik çözücülerde gamma PNA kullanmak için uygun bir yöntem sunmaktadır.
- Çeşitli ortamlarda nükleik asit teknolojilerinin daha fazla araştırılmasını teşvik etmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, nanoyapı uygulamalarını optimize etmek için bulgulara dayanarak genişleme gösterebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables the self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acid (γPNA) nanostructures in organic solvent mixtures, addressing a critical gap in nucleic acid nanotechnology for non-aqueous environments. By demonstrating programmable assembly of addressable single-stranded tiles into micron-scale nanofibers, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery where aqueous-incompatible assays or screening campaigns require organic solvent compatibility. The inclusion of surfactant-mediated bundling control provides a tunable parameter for optimizing nanostructure morphology, enhancing reproducibility in downstream biophysical or imaging applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nucleic acid-like recognition in organic solvents, supporting target hypothesis testing where traditional aqueous probes fail due to solubility or stability constraints.
- Operational Value: Provides a standardized scaffold for presenting ligands or capturing analytes in solvent conditions relevant to membrane-associated targets or lipid-based assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates addressable, single-stranded tile arrays with programmable binding domains for multiplexed target engagement in organic media.
- Operational Value: Yields nanostructures with quantifiable width distributions (median 16.3 nm, max >80 nm) enabling calibration of imaging or detection platforms in non-aqueous formats.
- Scientific Value: Demonstrates surfactant-dependent morphology control (e.g., SDS reducing bundling), allowing assay optimization to minimize false signals from aggregation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates structure-activity studies of γPNA analogs in solvent systems mimicking intracellular or microenvironmental conditions, supporting translational biomarker exploration.
- Operational Value: Enables longitudinal stability assessment of nanostructures under storage conditions (4°C for 12–24 hours post-annealing), informing reagent handling in preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement must be assessed in organic solvent mixtures, such as lipid-soluble compound screening or membrane protein assays, prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via programmable γPNA tile assembly, enabling de-risking of targets that are inaccessible to aqueous nucleic acid probes.
- Screening: Generates reproducible nanofiber templates for presenting capture molecules in solvent conditions compatible with hydrophobic compound libraries.
- Analytics: Provides measurable outputs (nanofiber width, bundling degree, morphology via TIRF/TEM) for comparing assembly conditions and quantifying structural consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing evaluation of γPNA nanostructures in solvent systems relevant to tissue penetration or subcellular localization studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, sequence-agnostic platform for γPNA-based nanostructure fabrication, adaptable across multiple targets without re-engineering core assembly logic.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in nanostructure formation through solvent-specific annealing protocols and surfactant titration, reducing mechanistic ambiguity in non-aqueous recognition events.
- Operational Value: Standardized stock preparation (300 μM in water, −20°C storage) and defined annealing cycles (22.5 hours, 90°C to 20°C) ensure reproducibility across sites and teams.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions for targets requiring organic solvent compatibility, reducing late-stage failure risk from assay-context mismatch.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of screening campaigns by providing a validated method to assess target engagement in physiochemically relevant milieus.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid nanotechnology and solvent handling, particularly for anhydrous DMSO, DMF, and 1,4-dioxane mixtures.
- Depends on access to thermal cyclers with programmable annealing, fluorescence/TIRF microscopes, and TEM for characterization.
- Necessitates standardization of surfactant concentrations (e.g., 5.25 mM or 17.5 mM SDS) to control bundling, as variability directly impacts nanostructure width and morphology.
- Requires adaptation across model systems due to γPNA’s aggregation propensity in organic solvents, necessitating empirical optimization of solvent ratios and annealing profiles.
- Practical limitation: Nanostructure stability is time-sensitive (12–24 hours at 4°C post-annealing), requiring tight coordination between assembly and imaging to avoid degradation or aggregation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Self-assembly Protocol for Multiple Distinct PNA Oligomers
2:48
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy Imaging
5:08
Different Morphologies for PNA Nanofibers in Varying Concentrations of SDS
6:01
Results: TIRF and TEM Imaging of PNA Nanofibers
7:41
Conclusion
