Name: Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, farelerde odaklanmış ultrason ile kan-beyin bariyerini açarak kemogenetik nöromodülasyonu değerlendirin. Bu yöntem, gen aktarımı ve histolojik analiz için cerrahi müdahaleyi en aza indirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Beyin ve Davranış Vakfı, NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü ile desteklenmiştir. Birkaç 3D baskılı bileşen orijinal olarak Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Fransa) tarafından tasarlanmıştır. Yazar, makalenin hazırlanmasında teknik yardım için John Heath (Caltech) ve Margaret Swift'e (Caltech) teşekkür eder.

Çıkar çatışması yok.

ATAC, doğru MRI kılavuzluğunda hedefleme, FUS-BBBO ve gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi dahil olmak üzere belirli nöral devrelerin başarılı nöromodülasyonu için çeşitli tekniklerin başarılı bir şekilde uygulanmasını gerektirir. Görüntüleme kılavuzluğunda FUS-BBBO ile küçük beyin yapılarının hedeflenmesini basitleştirmek için 3D yazdırılabilir bileşenler geliştirildi.
MRG kılavuzluğunda odaklanmış ultrason (MRIgFUS) uygulaması bir takım zorluklar ortaya çıkarmaktadır. İlk olarak, tipik MRI bobini, ultrason donanımını değil, yalnızca bir numuneyi barındıracak şekilde tasarlanmış sınırlı alana sahiptir. MRI'ların daha büyük delikleri, sinyal bir bobinin32 doldurma faktörü ile ilgili olduğundan, ekipman maliyetini artırır ve görüntü kalitesini düşürür. Sonuç olarak, MRG'de bir hayvan görüntüsünün üstüne yerleştirilen herhangi bir FUS donanımı, görüntüleme kalitesinden ödün verecektir. İkincisi, MRI uyumlu cihazlar tasarlamak zor ve pahalıdır. MR uyumlu malzemelerin diyamanyetik olması, radyofrekans ışınlaması sırasında girdap akımı oluşturma eğiliminin düşük olması ve yüksek manyetik alanlarda düşük manyetik duyarlılığa sahip olması gerekir. Herhangi bir iletken malzemede, girdap akımlarının oluşması veya manyetik duyarlılığı da görüntüleme kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir. Son olarak, mevcut MRI uyumlu malzemeler, stereotaksik çerçeveler gibi hassas hedefleme makinelerinin üretiminde tipik olarak kullanılan metallerden daha düşük Young modülüne ve dayanıklılığına sahiptir. Konumsal ayarlamalar için kullanılan motorların MRG uyumlu olması ve boyutlarından dolayı MRG deliğinin dışına yerleştirilmesi gerekir. Bu motorlar, MRI uyumlu malzemeler kullanılarak bir MRI deliği içindeki dönüştürücüye belirli bir mesafede bağlanmalıdır. Plastik çarpıtma sorunları, sağlam boyutlu bileşenleri uygulamak için deliğin içinde yeterli alan olmaması ve tüm beyin boyunca hedefleme pozisyonlarını değiştirmek için yetersiz alan, önceki çalışmalarda hedefleme doğruluğunu etkilemiştir.
Bu sorunları çözmek için MRG ve FUS-BBBO uygulamasında görüntülemenin tarayıcı dışında yapılmasına karar verildi. MRI rehberliğine izin vermek için fareler, fare beyin yapılarını hem MRG'de hem de stereotax koordinat alanında lokalize etmek için kullanılabilecek MRI ile görünür bir hedefleme kılavuzuna sahip 3D baskılı bir kısıtlamanın içine yerleştirildi. Hem fare kafatası hem de hedefleme kılavuzu kulak çubuğu tutucularına sıkıca tutturulduğundan (Şekil 1a,b), MRI görüntüsündeki uzamsal koordinatları ilişkilendirmek ve stereotaksik aletleri sıfırlamak için bir hedefleme kılavuzu kullanılabilir. Kısıtlamanın hareketli parçaları yoktur ve bir dönüştürücü içermez, bu da onu hem sağlam hem de bir MRI'nın içine sığacak kadar küçük hale getirmemize izin verdi ve dönüştürücünün elektroniğinden sinyal parazitini ortadan kaldırdı. Bazı materyaller için 3D baskılı destek MRG'de görülebildiği için hedefleme kılavuzunun içindeki boşluk oyulmuştur (Şekil 1c). Stereotax kalibrasyonunu sağlamak için düzenekte delikler açıldı (Şekil 3). Ultrason dönüştürücüsü, bir stereotaksın bir elektrot tutucusuna bağlandı ve hedefleme, bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi (Şekil 1d). Dönüştürücü, düz düzlemden herhangi bir sapmayı önleyecek şekilde, kulak çubuklarının muhafazası ile uzunluğu boyunca desteklenmelidir. Dorso-ventral yönde hedefleme, dairesel bir dizide faz kaymaları kullanılarak elde edilebilir.
Pratik hedefleme hassasiyeti, ultrason odaklama ve kafatası zayıflaması ile belirlenir. FUS-BBBO prosedürü sıçanlarda 11 ayrıntılı olarak tanımlanmıştır ve bir dizi başka model organizmada23,33,34 ve insanlarda 16,17 uygulanmıştır. Ultrason odak boyutu arasındaki ilişki, frekansla ters orantılıdır, burada daha yüksek frekanslar daha hassas teslimatla sonuçlanabilir. Bununla birlikte, kafatasının zayıflaması, kafatasının ısınmasına ve kortikal alanlarda hasara yol açabilecek35 frekanslarıyla artar. Kesin hedefleme stratejisi beyin bölgesine bağlı olacaktır. Beyin dokusu içinde tam genişlikte yarım maksimum basıncın sığdığı bölgeler, striatum, orta beyin ve hipokampus gibi birçok beyin yapısında öngörülebilir ve güvenli BBB açılmasına izin verir. Beynin tabanına yakın bölgeler farelerde özel bir zorluk teşkil eder. Fare beyni, dorso-ventral yönde yaklaşık 8-10 mm'dir, bu da piyasada bulunan birçok dönüştürücünün tam genişlikte yarı maksimum boyutuyla karşılaştırılabilir. Sonuç olarak, kafatasının dibini hedeflemek, kulak kanallarında, ağızda veya nefes borusunda bulunan kemiklerden ve havadan ultrason yansımasına yol açabilir ve bu da öngörülemeyen yüksek ve düşük basınç modellerine yol açabilir36. Bu basınçların bazıları, kanamaya ve doku hasarına neden olduğu gösterilen bir atalet kavitasyon eşiğini geçebilir37. Kafatasının tabanına yakın bölgeleri hedeflemek için, kesişimsel genetik38'in gen ekspresyonunu FUS ışını ile hedeflenenden daha küçük bir alanla sınırlamak için kullanıldığı kesişimsel ATAC7'nin kullanılması tercih edilebilir. Yayınlanmış kesişimsel ATAC örneğinde, dopaminerjik hücrelerde bir gen düzenleme enzimini (Cre38) eksprese eden transgenik bir hayvan, dopaminerjik hücrelerin bulunduğu bölgenin alt bölümünde ultrason ile hedeflenmiştir. Son olarak, kortikal bölgeler FUS ile hedeflenebilir, ancak ultrasonun kırınımı ve yansıması meydana gelebilir ve bu da eşit olmayan basınç profillerine yol açabilir. Bu protokol, kullanılan türlere büyük ölçüde bağımlı olacağından kortikal bölgelerin hedeflenmesini kapsamaz; bununla birlikte, hipokampus 7'nin üzerindeki korteksin bir miktar hedeflendiği gözlemlenmiştir (örneğin, Şekil 7), en azından farelerde bunun mümkün olduğunu göstermektedir.
Kemogenetik aktivatör seçimi ve dozlama, spesifik deneysel ihtiyaçlara bağlı olacaktır. Yazarların çalışmalarından biri de dahil olmak üzere bir dizi çalışma7, önemli bir spesifik olmayan yanıtgöstermedi 39,40, daha yüksek dozlar (ör., 10 mg / kg) en azından bazı durumlarda41 yan etkilere neden olabilir. Bununla birlikte, tüm davranışsal deneylerde olduğu gibi, CNO ve metabolitlerinin42 potansiyel hedef dışı aktivitesi nedeniyle uygun kontroller31 gereklidir. Bu tür kontroller, DREADD'leri eksprese eden hayvanlara CNO ve salin kontrollerinin uygulanmasını ve CNO'nun vahşi tip hayvanlara uygulanmasını veya bazı özel durumlarda, sırasıyla kemogenetik reseptörleri eksprese eden ve eksprese etmeyen beynin ipsi ve kontralateral bölgelerinin karşılaştırılmasını içerebilir. Ek olarak, son araştırmalar, geliştirilmiş özgüllüğe sahip bir dizi yeni DREADD agonistiortaya çıkardı 28,29,43. Diğer kemogenetik reseptörler 5,25,44 de ATAC prosedürü ile birlikte kullanılabilir.
Gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi, her hayvan için ölüm sonrası gereklidir. Hayvanların küçük bir kısmı, FUS-BBBO7'yi takiben zayıf gen ekspresyonu gösterir. Ek olarak, yanlış hedefleme mümkün olduğundan, gen ekspresyonunun uzamsal doğruluğunu ve özgüllüğünü göstermek gerekir. Bazı AAV'ler retrograd veya anterograd izleme yeteneği45 gösterebilir ve doğru ultrason hedeflemesine rağmen ultrason ile hedeflenen bölgeden uzakta transfeksiyona neden olabilir. Eksprese edilen kemogenetik reseptör bir floroforla kaynaşmışsa veya birlikte eksprese ediyorsa, doku kesitlerinde floroforun görüntülenmesi, ekspresyonun lokalizasyonunu ve yoğunluğunu değerlendirmek için yeterli olabilir. Bununla birlikte, birçok floresan proteini doku fiksasyon işlemi tarafından hasar görür ve DREADD'lerle sıklıkla kullanılan mCherry proteini için immün boyama, önceki çalışmalarda daha iyi sinyal vermiştir7. Son olarak, beynin belirli bölgelerindeki nöronların yoğunluğu nedeniyle (örneğin, hipokampustaki granüler hücre tabakası), hücre sayımlarını gerçekleştirmek için füzyonların aksine, IRES altında eksprese edilen nükleer lokalize floroforların kullanılması faydalı olabilir, çünkü çekirdekler DAPI veya TO-PRO-3 gibi nükleer lekelerle kolayca bölümlere ayrılabilir ve karşı boyanabilir. Nöromodülasyonu c-Fos boyama ile değerlendirmek için, herhangi bir floresan sinyali yerine nükleer karşı boyama yapmak ve c-Fos pozitif çekirdeklerini saymak zorunludur. Bazı durumlarda, hücresel kalıntılar floresan gösterebilir ve pozitif hücrelerin ölçümlerini karıştırabilir.
FUS-BBBO ile ilaç ve gen iletiminin sınırlamaları, invaziv intrakraniyal enjeksiyonlarla verilenden daha düşük çözünürlüğü ve daha büyük miktarlarda enjekte edilen ilaçlara veya viral vektörlere olan ihtiyacı içerir. Ek olarak, beyne doğrudan enjeksiyon, enjekte edilen bir bölgeye özel bir iletimle sonuçlanırken, FUS-BBBO, periferik dokulara olası bir iletimle sonuçlanan intravenöz bir yol kullanır. Nöromodülasyon için kemogenetik kullanımının sınırlamaları, nöromodülasyonun yoğunluğunda hızlı değişiklikler gerektiren bazı davranışsal protokoller için yetersiz olabilecek yavaş bir zaman ölçeğini içerir.

Optogenetik 1,2 ve kemogenetik 3,4,5 gibi devreye özgü nöromodülasyon teknolojilerinin kullanımı, nöronal devre bozuklukları olarak psikiyatrik durumları anlamamızı sağlamıştır. Nöronal devrelerin incelenmesi zordur ve beyin bozukluklarının tedavisinde kontrol edilmesi daha da zordur, çünkü tipik olarak belirli hücre tipleri, beyin bölgeleri, moleküler sinyal yolları ve aktivasyon zamanlaması ile tanımlanırlar. Hem araştırma hem de klinik uygulamalar için ideal olarak, bu tür bir kontrol noninvaziv olarak uygulanacaktır, ancak hem kesin hem de noninvaziv nöromodülasyon elde etmek zordur. Örneğin, nöroaktif ilaçlar beyne noninvaziv olarak ulaşabilirken, beyin boyunca hareket ederek uzamsal özgüllükten yoksundurlar. Öte yandan, elektriksel derin beyin stimülasyonu belirli beyin bölgelerini kontrol edebilir, ancak belirli hücre tiplerini kontrol etmekte zorlanır ve ameliyat ve cihaz yerleştirme gerektirir6.
Akustik Hedefli Kemogenetik7 (ATAC), uzamsal, hücre tipi ve zamansal özgüllük ile nöromodülasyon sağlar. Üç tekniği birleştirir: uzamsal hedefleme için odaklanmış ultrason kaynaklı kan-beyin bariyeri açma (FUS-BBBO), hücre tipine özgü promotörlerin kontrolü altında genleri noninvaziv olarak iletmek için adeno ilişkili viral vektörlerin (AAV'ler) kullanımı ve transfekte edilmiş nöral devreleri ilaç uygulaması yoluyla seçici olarak modüle etmek için tasarlanmış kemogenetik reseptörler. FUS, ultrasonun insan beyni de dahil olmak üzere dokuların derinliklerine milimetre uzamsal hassasiyetle odaklanma yeteneğinden yararlanan FDA onaylı bir teknolojidir. Yüksek güçte FUS, esansiyel tremor8 için FDA onaylı bir tedavi de dahil olmak üzere noninvaziv hedefli ablasyon için kullanılır. FUS-BBBO, düşük yoğunluklu ultrasonu, ultrason odağında kan damarlarında salınan sistemik olarak uygulanan mikro kabarcıklarla birleştirir ve BBB9'un lokalize, geçici (6-24 saat) ve geri dönüşümlü açılmasına neden olur. Bu açıklık, kemirgenlerde10 ve insan olmayan primatlarda 15 önemli doku hasarı olmadan proteinlerin 9,10, küçük moleküllerin 11 ve viral vektörlerin7,12,13,14 beyne iletilmesine izin verir. FUS-BBBO16,17 için klinik çalışmalar devam etmekte olup, bu tekniğin olası terapötik uygulamalarını göstermektedir.
AAV kullanılarak viral gen iletimi, CNS bozuklukları için klinik kullanıma doğru hızla ilerlemektedir ve son FDA ve AB düzenleyici onayları önemli kilometre taşları olarak kabul edilmektedir. Son olarak, yalnızca Tasarımcı İlaçlar Tarafından Aktive Edilen Tasarımcı Reseptörleri (DREADD'ler) gibi kemogenetik reseptörler18, sinirbilimciler tarafından transgenik veya transfekte edilmiş hayvanlarda nöronal uyarılma üzerinde farmakolojik kontrol sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır19,20. DREADD'ler, endojen ligandlardan ziyade sentetik kemogenetik moleküllere yanıt vermek üzere genetik olarak tasarlanmış G proteinine bağlı reseptörlerdir (GPCR'ler), öyle ki bu ligandların sistemik uygulaması, DREADD eksprese eden nöronların uyarılabilirliğini arttırır veya azaltır. Bu üç teknoloji ATAC'ta birleştirildiğinde, seçilen nöral devrelerin uzamsal, hücre tipi ve zamansal hassasiyetle noninvaziv modülasyonu için kullanılabilirler.
Burada, basit 3D baskılı hedefleme ekipmanı kullanarak farelerde FUS-BBBO ile beyin bölgelerinin doğru hedeflenmesi için metodolojiyi dahil ederek FUS-BBBO11 için daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletiyor ve güncelliyoruz. Ayrıca, FUS-BBBO'nun ATAC'a bir uygulamasını da gösteriyoruz. Kemogenetik reseptörleri taşıyan AAV'lerin verilmesi ve gen ekspresyonunun ve nöromodülasyonun histoloji ile değerlendirilmesi için gerekli adımları gösteriyoruz. Bu teknik, özellikle gen ekspresyonu veya nöromodülasyon için büyük veya çoklu beyin bölgelerini hedeflemek için geçerlidir. Örneğin, bir korteksin geniş bir alanı FUS-BBBO ile kolayca transdüksiyon yapılabilir ve kemogenetik kullanılarak modüle edilebilir. Bununla birlikte, alternatif bir teknik olan intrakraniyal enjeksiyonlarla gen iletimi, çok sayıda invaziv enjeksiyon ve kraniotomi gerektirecektir. FUS-BBBO ve uygulaması ATAC, beyin bölgelerinin daha büyük ve invaziv olarak hedeflenmesinin daha zor olduğu farklı boyutlardaki hayvanlara ölçeklendirilebilir.

<table><tbody><tr><td>21 gauge iğneler (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14826C</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge kelebek kateter</td><td>Harvard Bioscience</td><td>725966</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge iğneler (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14826F</td><td></td></tr><tr><td>Emici mavi ped</td><td>Ofis Deposu</td><td>902406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-253-G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry antikoru</td><td>Thermofisher</td><td>PA534974</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Biospec 70/30</td><td>Bruker</td><td>özel</td>, <td>RF bobinlerini içerir</td></tr><tr><td>Klozapin-n-oksit</td><td>Tocris</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>Özel tasarlanmış 3D baskılı fare koşumları ve MRIgFUS hedefleme bileşenleri</td><td>ImageGuidedTherapy, Szablowski laboratuvarı</td><td>szablowskilab.org/downloads'ten</td><td></td></tr> <tr><td>özel indirmeÖzel MRIgFUS makinesi</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Definity mikro kabarcıklar</td><td>Lantheus</td><td>DE4</td><td></td></tr><tr><td>Gazdan arındırılmış susonik/ultrason jeli</td><td>Fisher Scientific</td><td>5067714</td><td></td></tr><tr><td>Epilasyon cr&egrave; me</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sekiz elemanlı dairesel dizi dönüştürücü</td><td>Imasonic Inc.</td><td>özel</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Pedleri / Alkollü Bezler (% 70) (BD) Ofis</td> <td>Deposu</td><td>599893</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Nötr tamponlu formalin (% 10)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optik hidrofon</td><td>Hassas Akustik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1513314</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>524650-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Prohance kontrast madde</td><td>Bracco</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu Fisher</td><td> Bilimsel</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikor, Eşek anti keçi</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikor, Eşek anti tavşan</td><td>ThermoFisher</td><td>84546</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas (düz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17467480</td><td></td></tr><tr><td>ThermoGuide Yazılımı</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku yapıştırıcısı (Gluture)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9855218</td><td></td></tr><tr><td>Tüberkülin Şırınga (1 mL) (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>VeroClear 3D yazdırılabilir malzeme</td><td>Stratasys</td><td>RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Vialmix mikro kabarcık aktivasyon cihazı</td><td>Lantheus</td><td>VMIX</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli mikrotom</td><td>Sıkıştırma</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

beyin yapılarını hedeflemek ve kemogenetik nöromodülasyonu değerlendirmek için odaklanmış ultrason kaynaklı kan-beyin bariyeri açılması

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Akustik Hedefli Kemogenetik (ATAC), spesifik nöral devrelerin noninvaziv kontrolüne izin verir. ATAC, odaklanmış ultrason (FUS) ile indüklenen kan-beyin bariyeri açılışı (FUS-BBBO), adeno-ilişkili viral (AAV) vektörlerle gen iletimi ve tasarlanmış, kemogenetik, protein reseptörleri ve bunların akraba ligandları ile hücresel sinyallemenin aktivasyonunun bir kombinasyonu yoluyla bu kontrolü sağlar. ATAC ile tek bir noninvaziv ultrason uygulaması kullanarak hem büyük hem de küçük beyin bölgelerini milimetre hassasiyetinde transdüksiyon yapmak mümkündür. Bu transdüksiyon daha sonra bir ilaç kullanarak serbestçe hareket eden hayvanlarda uzun süreli, invaziv olmayan, cihazsız bir nöromodülasyona izin verebilir. FUS-BBBO, AAV'ler ve kemogenetik birden fazla hayvanda kullanıldığından, ATAC diğer hayvan türlerinde kullanım için de ölçeklenebilir olmalıdır. Bu makale, daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletmekte ve karmaşık bir MRG uyumlu FUS cihazına ihtiyaç duymadan, MRG kılavuzluğunda küçük beyin bölgelerine FUS-BBBO ile gen iletiminin nasıl optimize edileceğini özetlemektedir. Protokol ayrıca, herhangi bir laboratuvar tarafından 3D olarak basılabilen ve farklı türler veya özel ekipman için kolayca değiştirilebilen fare hedefleme ve kısıtlama bileşenlerinin tasarımını da açıklar. Tekrarlanabilirliğe yardımcı olmak için protokol, ATAC geliştirmede mikro kabarcıkların, AAV'lerin ve damar delinmesinin nasıl kullanıldığını ayrıntılı olarak açıklar. Son olarak, ATAC kullanan çalışmaların ön araştırmalarına rehberlik etmesi için örnek bir veri gösterilmiştir.

ATAC protokolünü gerçekleştirmenin ilk adımı, FUS-BBBO'nun istenen beyin bölgelerine hedeflenmesidir. Örneğin, tarif edilen protokolü takiben, hipokampus FUS-BBBO ile hedeflendi ve farelere kontrast madde ve AAV9 taşıyan DREADD'ler enjekte edildi, ardından fare beyninin görüntülerini alan bir FLASH 3D MRI dizisi izledi. Hipokampal bölgede (Şekil 6) ve beynin diğer bölgelerinde (Şekil 7) bir T1 sinyal artışı sağlandı. Birkaç hafta sonra, DREADD'ler hedef beyin bölgesinde eksprese edildi. Birçok DREADD, bir floresan raportöre (örneğin mCherry) kaynaştırılırken, formaldehit ile perfüzyon ve fiksasyon işleminin bu proteinlerin floresansını büyük ölçüde azalttığı bulunmuştur. mCherry veya DREADD'a karşı immün boyama, önceki deneyimlere dayanarak ekspresyonun daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesini sağlamıştır (Şekil 8). Önceki deneylerde, farelerin ~% 85'i FUS-BBBO7'yi takiben ekspresyon gösterdi. DREADD'lerin yeterli düzeyde ekspresyonu için basit bir test, işlevselliklerini hücresel düzeyde test etmektir. Örneğin, CNO19, deskloroklozapin28 veya diğerleri29 gibi bir kemogenetik ligand veya salin kontrolü sağlayarak ve kardiyak perfüzyon ve fiksasyondan önce 2 saat bekleyerek yapılabilir. Beyin bölümleri daha sonra nöronların aktivitesinin arttığını gösteren c-Fos proteini30 ve DREADD için birlikte immün boyandı. DREADD'lerle hedeflenen beyin bölgesi, kemogenetik ligand alan grupta salin7 alan gruba kıyasla veya FUS-BBBO'ya maruz kalmayan kontralateral bir bölgeye kıyasla önemli ölçüde daha fazla sayıda nöronal çekirdek gösteriyorsa, deney başarılı kabul edildi. Dikkat çekici bir şekilde, bu ligandların bazılarının, DREADD'lerin ekspresyonu olmadan spesifik olmayan nöronları aktive etme potansiyeli vardır. Örneğin, CNO'nun farelerde düşük seviyelerde klozapin metabolize edildiği gösterilmiştir, bu da BBB'yi geçer ve yüksek potens27 ile DREADD'leri aktive eder. Bununla birlikte, belirli olmayan konumlara bağlandığı da gösterilmiştir. Her deneyde olduğu gibi, kemogenetik çalışmalarda tüm uygun kontrollerin dahil edilmesi çok önemlidir31. Olası bir kontrol, kemogenetik ligandın, ilacın tek başına istenen davranışsal veya histolojik tahlil üzerindeki etkilerini dışlamak için prosedürler olmaksızın vahşi tip farelere uygulanmasıdır. Başka bir kontrol, dört grubun dahil edilmesi olabilir: DREADD + ligand, DREADD + araç, EGFP + ligand, EGFP + araç, hem FUS-BBBO ile gen iletiminin hem de kemogenetik ligandın olası etkilerini açıklayacak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Şekil 1: ATAC'ta FUS'un MRI kılavuzluğunda hedeflenmesi süreci. (a) Kulak çubukları, bir burun konisi ve bir MRI tarayıcısının içine sığabilecek bir platform ile fare yerleşimi. (b) MRG'de görülebilen 3D baskılı bir kılavuz (mavi) kulak çubuğu çerçevesinin uçlarına takıldı ve daha sonra dört geçmeli cıvata (yarı saydam mavi) içeren bir yüzey MRI bobini tutucusu ile yerine sabitlendi. (c) 3D baskılı kılavuzun sagital MRG'de (sol panel) görünümü, kılavuzun alt kısmıyla hizalanmış bir dönüştürücünün sanal temsilinin alt kısmı (sarı yarım daire). Sağ panel, koronal görünümden MRG'de 3D baskılı kılavuzun görünümünü gösterir. Parlak daire, güçlü bir MRI kontrastına sahip bir polijet destek malzemesinden yapılmıştır. Haç plastikle oluşturuldu. Sarı bir daire, stereotaksik bir çerçeve içindeki kılavuzla eşmerkezli olarak hizalanmış dönüştürücü konumunu temsil eder. (d) Beyin yapılarını hedeflemek için, sanal bir dönüştürücü, bir ultrason konisinin / yuvasının kalınlığına uyması için farelerin üzerinde z yönünde hareket ettirildi. Bu durumda, su banyosunun kalınlığı nedeniyle, doğru hedefleme için dönüştürücü kılavuzun 8,2 mm yukarısına hareket ettirildi. Beyin yapıları MRG görüntüleme verileri kullanılarak seçildi ve MRG koordinatları daha sonra yazıldı ve stereotaksik makineye girildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Şekil 2: Kullanılan yazılımın arayüzü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Şekil 3: MRG koordinat alanını stereotaksik aletle eşleştirme işlemi. (a) Bir dönüştürücü tutucu içindeki üç delik, MRI kılavuzundaki üç delikle hizalandı ve tüm düzeneğe esnemeye neden olmadan üç konik hedefleme cıvatası yerleştirildi. (b) İdeal olarak, üç cıvata da deliklerin ortasına oturacaktır. (c) Hizalamada herhangi bir belirsizlik varsa, üç cıvatanın tümü yerine oturmaz, örneğin, 1°'lik küçük, muhtemelen algılanamayan sapma durumunda, zıt cıvatalar MRI kılavuzuna sıkışırken yalnızca bir cıvata sığar. Alternatif olarak, cıvatalar zorlandığı için tüm tertibatta gözle görülür bir esneme olabilir. (d) Cıvata bağlantısının büyütülmüş görünümü. En iyi doğruluk için cıvatalar eşmerkezli olarak yerleştirilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Şekil 4: Şırınga içindeki mikro kabarcıkların hızlı yeniden dağılımı. (a) Şırınga karıştırıldıktan 5 saniye sonra fotoğraflandı. (b) Bir dakika sonra, 1 mL tüberkülin şırıngasının tepesine yakın bir yerde yoğunlaşan kabarcıkların bir kısmını gösteren açıkça görülebilen bir tabaka vardı. Bu örnek, özellikle, bir mikro kabarcık çözeltisi kullanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Şekil 5: Bir dönüştürücünün merkezini bir MRI kılavuzunun merkezine yerleştirme işlemi. (a) Bu belgede gösterilen modellerde, kırmızı taşıyıcı, Şekil 10.56b'de gösterilen konumdan burada gösterilen konuma 3 mm ileri hareket edecek şekilde tasarlanmıştır. (b) Mavi MRI kılavuzu sonikasyondan önce çıkarıldı ve ultrason geçişini sağlamak için fare ile dönüştürücü (turuncu) arasına bir ultrason jeli uygulandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Şekil 6: BBB açıklığının MRG görselleştirmesi. (a) BBB açıklığının eksenel görünümü. Ok ucu ile gösterilen daha parlak alan, bir MRI T1 kontrast maddesinin ekstravazasyonunu gösterir. (b) Dorsal hipokampusun ve hipokampusun üzerindeki korteksin FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen koronal görünümü. (c) FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen merkezi hipokampusun koronal görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Şekil 7: Bu yazıda açıklanan üç cıvatalı hedefleme sistemi kullanılarak 4 beyin bölgesinin hedeflenmesi örneği. Ok uçlu alanlar, bir MRG kontrast maddesinin difüzyonu ile BBB açılmış bölgeleri gösterdi. Dört bölge, aşağıdan yukarıya doğru her BBB açıklığı arasında ~ 150 s olacak şekilde art arda hedeflendi. Görüntü, son BBB açılışından sonraki 2 dakika içinde çekildi. Ölçek çubuğu 2 mm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Şekil 8: DREADD ifadesinin algılanması.  (a) DREADD'lere bağlı florofor için immün boyama, bu durumda mCherry bazı çalışmalarda güvenilir bir tespit yöntemiydi. (b) (a)'daki ile aynı koşulları kullanarak hipokampusu hedefleyen DREADD'lerin bulunduğu başka bir temsili bölümde, mCherry'nin floresansı kendi başına güçlü bir arka plan ve nispeten zayıf sinyal üretti. (c) Negatif kontrol olarak, sistemik AAV enjeksiyonu alan, ancak FUS-BBBO uygulanmayan bir fare kullanıldı. mCherry immün boyama ile anlamlı bir ekspresyon bulunamaz. Ölçek çubukları 500 mm'dir. (a, c'deki veriler7'den izinlerle uyarlanmıştır, Telif Hakkı 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, odaklanmış ultrason kan beyin bariyeri (BBB) açılması, ortaya çıkan gen ekspresyonunun değerlendirilmesi ve histolojik testlerle kemogenetik reseptörlerin nöromodülasyon aktivitesinin ölçülmesi yoluyla gen iletimi için gerekli adımları tanımlar.

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Protokolümüz, farelerde odaklanmış ultrasonun milimetre altı hassasiyetle hedeflenmesini sağlar. Ameliyat veya MRI uyumlu ultrason ekipmanı kullanmaya gerek kalmadan ucuz 3D baskılı parçalar kullanarak ultrasonu hedeflememizi sağlar. Odaklanmış ultrason kan-beyin bariyeri açılışı ilk başta oldukça zor olabilir.Dönüştürücünün, gazı alınmış jel veya su kullanılarak hayvana uygun şekilde bağlanması ve enjeksiyon sırasında mikro kabarcıkların çökmemesi çok önemlidir. Prosedürü göstermek, Caltech'te yüksek lisans öğrencisi olan Richard Li olacak. Anestezi uygulanmış bir farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, temiz bir 25 ila 35 gauge kateteri yıkamak için mililitre başına 10 birim heparinize salin kullanın ve hayvanın kuyruğunu dezenfekte etmek için bir etanol pedi kullanın.Kateteri lateral bir kuyruk damarına yerleştirin ve kateteri yerine sabitlemek için doku yapıştırıcısı kullanın. İğne doğru yerleştirilmişse, kateterde bir kan geri akışı gözlenecektir. Yapıştırıcı kuruduğunda, hayvanın kafasındaki tüyleri epilasyon kremi ile çıkarın ve fareyi 3D baskılı bir MRI taşıyıcısına yerleştirin, ön dişleri bir burun konisinin içinde olacak şekilde bir ısırma çubuğuna monte edin.Körelmiş çubukları güvenli bir basınçla kafatasına sabitleyin ve hayvanın saniyede bir nefes hızında serbestçe nefes aldığını doğrulamak için solunumu 30 saniye boyunca gözlemleyin. Hedefleme kılavuzunu kulak çubuklarına bağlayın ve solunumu tekrar kontrol edin. MRI taşıyıcısını bir MRI tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu bir mıknatısın deliğinin içine yerleştirin.Ardından, tüm beyni görüntülemek için 3D hızlı düşük açılı çekim dizisini kullanarak fareyi tarayıcıda lokalize etmek için bir MRI dizisi edinin. MRI kılavuzluğunda hedefleme yapmak için, taşıyıcıyı stereotaksik bir aletin içine yerleştirin ve bloğu stereotaksik aletin iki destek direğine karşı yerine sabitlemek için çift taraflı bantlı metal bir blok kullanın. MRI görüntülerini, çalışan bir odaklanmış ultrason yönlendirme yazılım programı olan bir bilgisayara aktarın ve görüntüleri açın.Tüm görüntüler yüklendiğinde, görüntüyü üç eksende yeniden biçimlendirmek için sağ tıklayın ve yeniden biçimlendir'i tıklatın. Dönüştürücüyü dairesel hedefleme kılavuzuna yerelleştirmek için sağ tıklayın. Sagital görünümde, su banyosunun ve dönüştürücü muhafazasının kalınlığını hesaba katmak için sanal dönüştürücünün dikey konumunu ayarlayın.Yörünge planlayıcısında hedeflenecek alanları belirtin ve koordinatları bir elektronik tabloya not edin. İstenen hedefleme derinliğini çevirin ve daha önce gösterildiği gibi koordinatları not edin. Ardından yörüngeyi gönder'i tıklayın ve noktaların her birini hedeflemek için yürütün.Bir MRG'nin koordinatlarını stereotaksik çerçeve ile ilişkilendirmek için, özel olarak monte edilmiş dönüştürücüyü bir hedefleme kılavuzunun üzerine yerleştirin ve üç hedefleme cıvatasının her biri hem dönüştürücü tutucusundan hem de hedefleme kılavuzundan geçene kadar çevirin. Cıvataların gerilim veya eğilme altında olmadığını onaylayın ve dönüştürücü, MRG'de bir hedefleme kılavuzunun merkezinin göründüğü noktaya yerleştirilene kadar dönüştürücüyü ön-arka yönde 10.56 milimetre ileri çevirin. Ardından, sanal dönüştürücünün merkezinden hedeflenen bölgeye olan mesafeyi belirleyin ve dönüştürücüyü bu koordinatlara taşımak için çerçeveyi kullanın.Enjeksiyon çözeltisini hazırlamak için, 800 mikrolitre salin ve 100 mikrolitre MRI kontrast maddesini karıştırarak 1.5 mililitrelik bir tüpe yükleyin. Daha sonra, mikro kabarcıkları bir mikro kabarcık aktivasyon cihazında 45 saniye boyunca etkinleştirmeden önce, aktive edilmemiş bir mikro kabarcık çözeltisini oda sıcaklığına getirin. Aktivasyondan sonra, çözeltinin ortasından 100 mikrolitre mikro kabarcıkları 21 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik tüberkülin şırıngasına yavaşça yükleyin ve kontrast madde çözeltisine 80 mikrolitre mikro kabarcık ekleyin.Yüzdürmeyi önlemek için 1,5 mililitrelik tüpü 15 saniye boyunca hafifçe ters çevirerek hazırlanan çözeltiyi karıştırın. Karıştırmanın sonunda, 200 mikrolitre mikro kabarcık çözeltisini iğnesiz bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı ters çevirin. Hala ters çevrilmişken şırıngayı karıştırmak ve 30 kalibrelik bir iğneyi karıştırmak ve takmak için pistonu bastırın ve geri çekin.Ardından, iğnenin ucunda damlacıklar görünene kadar mikro kabarcık çözeltisini yavaşça dışarı itin. Mikro kabarcıklar hazır olur olmaz, insonasyon için nabız süresini 10 milisaniyeye, her saniye 120 tekrarla, kafatasında 0,3 ila 0,45 mega paskal basınçla ayarlayın. Hedefleme kılavuzunu çıkarın ve kabarcıkları önlemek için fare kafasına gazı alınmış ultrason jeli uygulayın.Dönüştürücüyü doğrudan kulak çubuğu tutucusunun düz kısmına yerleştirilene kadar indirin ve koordinatları stereotaksik aletlere çevirin. İlgilenilen adeno ile ilişkili virüsü, vücut ağırlığı konsantrasyonunun gramı başına 0.5 ila 2 kez 10 ila 10. viral partiküle seyreltin ve virüs partiküllerini 30 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Solüsyonu kuyruk ven kateterine enjekte edin ve 80 mikrolitre mikro kabarcık solüsyonunu fareye enjekte edin.Kan-beyin bariyerinin açılmasını MRI ile değerlendirmek için, gösterildiği gibi hızlı, düşük açılı bir çekim dizisi kaydedin. DREADD stimülasyonu için, klozapin N-oksidi steril salin içinde mililitre konsantrasyonda bir miligramda çözün ve intraperitoneal olarak enjekte edin. Doğumdan 15 ila 45 dakika sonra, hayvanın davranışsal aktivitesini kaydetmeye başlayın.Nöronal aktivasyon analizi için beyin dokusunu kullanın. Gösterildiği gibi protokolü takiben, hipokampal bölgede ve beynin diğer bölgelerinde bir T1 sinyal artışı elde edilebilir. Gözlemlendiği gibi, mCherry'ye karşı immün boyama, DREADD ekspresyonunun daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesine yol açar Bu prosedürde, mikro kabarcıkları nazikçe tutmayı ve MRI görüntüleme ve insonasyon sırasında hayvanın stabil olduğundan emin olmayı unutmayın.

focused-ultrasound-induced-blood-brain-barrier-opening-for-targeting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Mikro kabarcık Insonation azaltılmış zaman-ortalamalı akustik güçler tümör ablasyonu için umut vaat eden bir strateji yanı sıra, hedeflenen terapötik teslimat için. Bu çalışmanın amacı non-termal mikrovasküler ablasyon subkutan C6 gliomlar ve yükü teslim maksimize etmek için düşük görev döngüsü ultrason darbeli stratejileri ve nanocarriers geliştirmek.

Kontrast Ultrason Gliomlar, Tedavi Hedeflenen İlaç-Rulman Nanopartikül Teslimat ve Mikrovasküler Ablasyon ile Fare

Kan-beyin bariyeri (KBB) ve Mikro-aracılı odaklanmış ultrason bozulması beyinde non-invaziv hedeflenen ilaç dağıtımı için umut verici bir...

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Bu videoda, mikro kabarcık aracılı odaklanmış ultrason (FUS) kullanarak geçici açıklıklar oluşturarak kan-beyin bariyerini (BBB) geçici olarak bozma yöntemi açıklanmaktadır. Bu geçici lokal BBB açıklıkları sonunda daha büyük boyutlu ilaç moleküllerini doğrudan beyin parankimine iletmek için kullanılabilir.

Fokus Ultrason Tabanlı Mikrokabarcık Aracılı Kan-Beyin Bariyeri Açma: Sonoporasyon Yoluyla Farenin Kan-Beyin Bariyerinde Lokalize Geçici Açıklıklar Oluşturma Tekniği

Mikrobubble ajanları ile odaklanmış ultrason odaklama odak ve geçici kan beyin bariyeri açabilirsiniz. Bu teknik, kan beyin bariyeri boyunca çok çeşitli ajanlar sunmak için kullanılmıştır. Bu makale, MRI kılavuzu olsun veya olmadan kemirgen beynine lokalize teslimat için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

Kan-beyin bariyeri (BBB) mikrobubble aracılı odaklanmış ultrason (FUS) ile geçici olarak bozulabilir. Burada, ultrason olmayan uzmanlar için erişilebilen modüler bir FUS sistemi kullanarak yüksek verimli BBB açma in vivo için adım adım bir protokol açıklıyoruz.

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia'yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Bu protokol, kan-beyin bariyer geçirgenliğini artırmak için odaklanmış ultrason ve mikrobubble tedavileri sırasında kemirgen beyninin gerçek zamanlı in vivo multifoton floresan görüntülemesini sağlayan cerrahi ve teknik prosedürleri açıklar.

Kan-Beyin Bariyer Geçirgenliğini Artırmak için Odaklanmış Ultrason ve Mikrobubble Tedavilerini Görselleştirmek için Gerçek Zamanlı Intravital Multifotoğraf Mikroskopisi

Bu çalışma, kan-beyin bariyeri (BBB) açıklığını izlemek için juguler ven kateterizasyonu ile canlı sıçanları kullanan kombine manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ve düşük yoğunluklu darbeli odaklanmış ultrason (FUS) protokolünü açıklamaktadır.

Klinik Öncesi Odaklanmış Ultrason Sistemi ile Sıçanlarda Kan-Beyin Bariyeri Açıklığının İzlenmesi

A yöntemi genel mikro-kabarcıkların ve ultrason ile fare kan-beyin bariyerini açılması için tarif edilmiştir. Bu teknik kullanılarak, manganez fare beyin için uygulanabilir. Manganez depolarize nöronlarda birikerek bir MR kontrast madde olduğundan, bu yaklaşım nöronal aktivitenin görüntüleme sağlar.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Bu çalışmada, biz kan - beyin bariyerini nörodejeneratif koşullar altında çalışmasının değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut. Bizim hedefe ulaşmak için biz yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) etiketli infüzyon-albümin içine fare juguler ven ve onun kaçak beyin parankimi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirilir.

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Öğrenin, farelerde odaklanmış ultrason ile kan-beyin bariyerini açarak kemogenetik nöromodülasyonu değerlendirin. Bu yöntem, gen aktarımı ve histolojik analiz için cerrahi müdahaleyi en aza indirir.

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması (Video) | JoVE Journal

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Daha fazla video keşfet