Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Bu protokol, odaklanmış ultrason kan beyin bariyeri (BBB) açılması, ortaya çıkan gen ekspresyonunun değerlendirilmesi ve histolojik testlerle kemogenetik reseptörlerin nöromodülasyon aktivitesinin ölçülmesi yoluyla gen iletimi için gerekli adımları tanımlar.

Protokolümüz, farelerde odaklanmış ultrasonun milimetre altı hassasiyetle hedeflenmesini sağlar. Ameliyat veya MRI uyumlu ultrason ekipmanı kullanmaya gerek kalmadan ucuz 3D baskılı parçalar kullanarak ultrasonu hedeflememizi sağlar. Odaklanmış ultrason kan-beyin bariyeri açılışı ilk başta oldukça zor olabilir.

Dönüştürücünün, gazı alınmış jel veya su kullanılarak hayvana uygun şekilde bağlanması ve enjeksiyon sırasında mikro kabarcıkların çökmemesi çok önemlidir. Prosedürü göstermek, Caltech'te yüksek lisans öğrencisi olan Richard Li olacak. Anestezi uygulanmış bir farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, temiz bir 25 ila 35 gauge kateteri yıkamak için mililitre başına 10 birim heparinize salin kullanın ve hayvanın kuyruğunu dezenfekte etmek için bir etanol pedi kullanın.

Kateteri lateral bir kuyruk damarına yerleştirin ve kateteri yerine sabitlemek için doku yapıştırıcısı kullanın. İğne doğru yerleştirilmişse, kateterde bir kan geri akışı gözlenecektir. Yapıştırıcı kuruduğunda, hayvanın kafasındaki tüyleri epilasyon kremi ile çıkarın ve fareyi 3D baskılı bir MRI taşıyıcısına yerleştirin, ön dişleri bir burun konisinin içinde olacak şekilde bir ısırma çubuğuna monte edin.

Körelmiş çubukları güvenli bir basınçla kafatasına sabitleyin ve hayvanın saniyede bir nefes hızında serbestçe nefes aldığını doğrulamak için solunumu 30 saniye boyunca gözlemleyin. Hedefleme kılavuzunu kulak çubuklarına bağlayın ve solunumu tekrar kontrol edin. MRI taşıyıcısını bir MRI tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu bir mıknatısın deliğinin içine yerleştirin.

Ardından, tüm beyni görüntülemek için 3D hızlı düşük açılı çekim dizisini kullanarak fareyi tarayıcıda lokalize etmek için bir MRI dizisi edinin. MRI kılavuzluğunda hedefleme yapmak için, taşıyıcıyı stereotaksik bir aletin içine yerleştirin ve bloğu stereotaksik aletin iki destek direğine karşı yerine sabitlemek için çift taraflı bantlı metal bir blok kullanın. MRI görüntülerini, çalışan bir odaklanmış ultrason yönlendirme yazılım programı olan bir bilgisayara aktarın ve görüntüleri açın.

Tüm görüntüler yüklendiğinde, görüntüyü üç eksende yeniden biçimlendirmek için sağ tıklayın ve yeniden biçimlendir'i tıklatın. Dönüştürücüyü dairesel hedefleme kılavuzuna yerelleştirmek için sağ tıklayın. Sagital görünümde, su banyosunun ve dönüştürücü muhafazasının kalınlığını hesaba katmak için sanal dönüştürücünün dikey konumunu ayarlayın.

Yörünge planlayıcısında hedeflenecek alanları belirtin ve koordinatları bir elektronik tabloya not edin. İstenen hedefleme derinliğini çevirin ve daha önce gösterildiği gibi koordinatları not edin. Ardından yörüngeyi gönder'i tıklayın ve noktaların her birini hedeflemek için yürütün.

Bir MRG'nin koordinatlarını stereotaksik çerçeve ile ilişkilendirmek için, özel olarak monte edilmiş dönüştürücüyü bir hedefleme kılavuzunun üzerine yerleştirin ve üç hedefleme cıvatasının her biri hem dönüştürücü tutucusundan hem de hedefleme kılavuzundan geçene kadar çevirin. Cıvataların gerilim veya eğilme altında olmadığını onaylayın ve dönüştürücü, MRG'de bir hedefleme kılavuzunun merkezinin göründüğü noktaya yerleştirilene kadar dönüştürücüyü ön-arka yönde 10.56 milimetre ileri çevirin. Ardından, sanal dönüştürücünün merkezinden hedeflenen bölgeye olan mesafeyi belirleyin ve dönüştürücüyü bu koordinatlara taşımak için çerçeveyi kullanın.

Enjeksiyon çözeltisini hazırlamak için, 800 mikrolitre salin ve 100 mikrolitre MRI kontrast maddesini karıştırarak 1.5 mililitrelik bir tüpe yükleyin. Daha sonra, mikro kabarcıkları bir mikro kabarcık aktivasyon cihazında 45 saniye boyunca etkinleştirmeden önce, aktive edilmemiş bir mikro kabarcık çözeltisini oda sıcaklığına getirin. Aktivasyondan sonra, çözeltinin ortasından 100 mikrolitre mikro kabarcıkları 21 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik tüberkülin şırıngasına yavaşça yükleyin ve kontrast madde çözeltisine 80 mikrolitre mikro kabarcık ekleyin.

Yüzdürmeyi önlemek için 1,5 mililitrelik tüpü 15 saniye boyunca hafifçe ters çevirerek hazırlanan çözeltiyi karıştırın. Karıştırmanın sonunda, 200 mikrolitre mikro kabarcık çözeltisini iğnesiz bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı ters çevirin. Hala ters çevrilmişken şırıngayı karıştırmak ve 30 kalibrelik bir iğneyi karıştırmak ve takmak için pistonu bastırın ve geri çekin.

Ardından, iğnenin ucunda damlacıklar görünene kadar mikro kabarcık çözeltisini yavaşça dışarı itin. Mikro kabarcıklar hazır olur olmaz, insonasyon için nabız süresini 10 milisaniyeye, her saniye 120 tekrarla, kafatasında 0,3 ila 0,45 mega paskal basınçla ayarlayın. Hedefleme kılavuzunu çıkarın ve kabarcıkları önlemek için fare kafasına gazı alınmış ultrason jeli uygulayın.

Dönüştürücüyü doğrudan kulak çubuğu tutucusunun düz kısmına yerleştirilene kadar indirin ve koordinatları stereotaksik aletlere çevirin. İlgilenilen adeno ile ilişkili virüsü, vücut ağırlığı konsantrasyonunun gramı başına 0.5 ila 2 kez 10 ila 10. viral partiküle seyreltin ve virüs partiküllerini 30 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Solüsyonu kuyruk ven kateterine enjekte edin ve 80 mikrolitre mikro kabarcık solüsyonunu fareye enjekte edin.

Kan-beyin bariyerinin açılmasını MRI ile değerlendirmek için, gösterildiği gibi hızlı, düşük açılı bir çekim dizisi kaydedin. DREADD stimülasyonu için, klozapin N-oksidi steril salin içinde mililitre konsantrasyonda bir miligramda çözün ve intraperitoneal olarak enjekte edin. Doğumdan 15 ila 45 dakika sonra, hayvanın davranışsal aktivitesini kaydetmeye başlayın.

Nöronal aktivasyon analizi için beyin dokusunu kullanın. Gösterildiği gibi protokolü takiben, hipokampal bölgede ve beynin diğer bölgelerinde bir T1 sinyal artışı elde edilebilir. Gözlemlendiği gibi, mCherry'ye karşı immün boyama, DREADD ekspresyonunun daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesine yol açar Bu prosedürde, mikro kabarcıkları nazikçe tutmayı ve MRI görüntüleme ve insonasyon sırasında hayvanın stabil olduğundan emin olmayı unutmayın.