Pulmoner Ortamda İmmün Hücrelerin ve Proinflamatuar Mediatörlerin Karakterizasyonu

Bu protokol, iskemik inme sonrası pulmoner ortamdaki değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, akış sitometrik analizi ile aynı farede 13 akciğer bağışıklık hücresi tipinin ve 13 farklı sitokin ve kemokinin tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, iskemik inme sonrası pulmoner ortamdaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılmıştır.

Bununla birlikte, alerjik yanıt veya enfeksiyon sırasındaki değişiklikleri araştırmak için de hizmet edebilir. Tüm vücut transkardiyal perfüzyonunu gerçekleştirmek için, anestezi uygulanmış bir farede pedal yansımasına yanıt eksikliğini onaylayın ve fareyi cerrahi bir platforma sabitleyin. Kürkün vücut boşluğuna dağılımını azaltmak için kürkü %70 etanol ile ıslatın ve sağlam peritonu ortaya çıkarmak için dikey bir orta hat cilt kesisi yapın ve göğüs boşluğuna ulaşılır ulaşılmaz kesiyi durdurun.

Daha önce göğüs boşluğunda durarak peritonun orta hat insizyonunu yapmak için ince diseksiyon makası kullanın ve sternumun distal ucunu kavramak için forseps kullanın. Kalbe, akciğerlere veya damar sistemine zarar vermeden diyaframı kesmek için makası kullanın. Alttaki dokular göründüğünde, göğüs kafesinden bir kesi yapın ve kaburgaların yanlarını kalp ve akciğerler tamamen açıkta kalacak şekilde sabitleyin.

Perfüzyon için çıkış akışı görevi görmesi için aort kemerinin yakınındaki sağ atriyumda dikkatlice küçük bir kesi yapın ve sol ventrikülün distal üst yüzeyine hızlı ama nazikçe 25 gauge bir iğne yerleştirin. İğne yerleştirildikten sonra, 10 mililitre soğuk PBS'yi kalbe nazikçe akıtın. Doku kandan temizlenmeye başlamalıdır.

Tüm hacim verildiğinde, karaciğer açık kahverengi bir görünüm sergileyene ve akciğerler kırmızımsı pembeden çoğunlukla beyaz renge geçene kadar ikinci bir 10 mililitrelik soğuk PBS alikotu perfüze edin. Forseps ve ince diseksiyon makası kullanarak, akciğer loblarını ayırmadan ve bunları bir ila iki mililitre soğuk akciğer hücresi içeren bir Petri kabına yerleştirmeden önce çevredeki tüm dokuları dikkatlice çıkarın. Akciğer dokusunu multipleks boncuk dizileri için hazırlamak için, üç steril 2.3 mililitre Zirkonya / Silika boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpe 200 mikrolitre soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin ve ilgilenilen akciğer lobunu tartın.

50 ila 100 miligram akciğer dokusunu önceden soğutulmuş boncuk tüpüne ve homojenizasyon tamponuna aktarın ve en az iki dakika boyunca dakikada 4.000 dönüşte boncuk bazlı bir homojenizatör kullanarak lobu homojenize edin. Doku tamamen homojenize edildiğinde, dokuyu çökeltmek için tüpü santrifüjleyin ve süper natanı buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın. Akciğer dokusunun ayrışması için, akciğer hücresi ortamını kalan akciğer lobundan dikkatlice boşaltın ve dokuya 25 gauge bir iğne yerleştirin.

Her bir lob iki ila üç kez enjekte edilene kadar akciğerleri şişirmek için her bir akciğer lobuna 200 ila 250 mikrolitre hacimde ayrışma tamponu enjekte edin. Oda sıcaklığında iki dakikalık bir inkübasyondan sonra, akciğerleri küçük parçalara ayırmak için ince diseksiyon makası kullanın ve doku solüsyonunu 15 mililitrelik kronik tüpe aktarın. Numuneye altı mililitre ek ayrışma tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca kuvvetlice girdap yapın.

Daha sonra, doku parçalarını her yedi ila sekiz dakikada bir girdap yaparak 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numuneyi bir dakika boyunca kuvvetlice girdaplayın ve kalan istenmeyen bağ ve interstisyel dokuyu çıkarmak için numuneyi 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Dokuyu santrifüjleme ile toplayın ve beş mililitre soğuk akciğer ortamı ile peletlere yeniden süspanse edin.

Numuneyi tekrar santrifüjleyin ve peleti hafif girdaplama ile bir mililitre soğuk akciğer ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, saymadan önce hücreleri 100 mikronluk bir süzgeçten süzün. İzole edilmiş akciğer dokusu içindeki bağışıklık hücresi popülasyonlarını değerlendirmek için, 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt plaka ile uygun sayıda oyuğa yerleştirilmiş bir ila iki kez 10 ila altıncı güç hücresi antikorunu tohumlayın ve hücreleri santrifüjleme ile plakanın dibine atın.

Her bir kuyucuğa soğuk FACS tamponunda 25 mikrolitre uygun antikor kokteyli ekleyin ve hafif boru sevişme ile karıştırın. 20 dakika sonra, hücreleri oyuk başına 100 mikrolitre soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri, tüp başına 150 mikrolitre ek FACS tamponu içeren beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Ardından, numuneleri standart akış sitometrik analiz protokollerine göre hemen bir akış sitometresinde analiz edin.

Bu temsili analizde, akciğerlerde beş ila yedi antikor kombinasyonundan oluşan üç set kullanılarak 13 farklı bağışıklık hücresi popülasyonu tanımlandı. Ölü hücreler canlı bir ölü leke kullanılarak dışlandı ve farklı bağışıklık hücresi tipleri, tabloda listelenen antikorlar ve belirteçler kullanılarak ayırt edildi. Birinci sette alveoler ve interstisyel makrofajlar, CD103 pozitif ve CD11B pozitif dendritik hücreler ve eozinofiller tanımlandı.

İkinci sette proinflamatuar monositler ve nötrofiller tanımlandı ve üçüncü sette CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücreleri, B hücreleri, plazmositoid dendritik hücreler, NK hücreleri ve NKT hücreleri tanımlandı. CD45 pozitif hücrelerin toplam canlı hücre sayısı, yüzdesi ve elde edilen toplam CD45 pozitif hücre sayısı, gösterildiği gibi izole edilen hücre popülasyonları ile ticari olarak temin edilebilen bir doku ayrıştırıcısı kullanılarak izole edilen hücre popülasyonları arasında benzerdi. Ek olarak, CD45 pozitif hücreler arasındaki hücre ölümü yüzdesi her iki protokol için% 10'dan azdı, bu da gösterilen protokolün otomatik bir doku ayrıştırıcısının yardımı olmadan yüksek verim, yüksek hücre kalitesi geri kazanımını kolaylaştırdığını düşündürmektedir.

Ayrıca, akış sitometrik analizi ile birlikte ticari olarak temin edilebilen bir multipleks testin kullanılması, miligram doku başına her numunedeki kemokin konsantrasyonunun belirlenmesine izin verir. Tek hücre izolasyonu sırasında kullanılan kollajenaz D konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve sıcaklığı, bağışıklık hücresi iyileşmesini kritik derecede etkiler.