Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Bu protokolün temel özelliği, çok çeşitli demir-demir oksit nanomalzemelerine uygulanabilmesidir. Ayrıca, demir-altın nanoteller gibi çok segmentli nanomalzemeler üzerine de uygulanabilir. Bu protokol herhangi bir standart biyolojik laboratuvarda güvenle gerçekleştirilebilir.

Bu biyoişlevselleştirme tekniğinin ana avantajları, nanotel ve antikorlar arasındaki güçlü bir kovalent bağa dayalı olarak özel olarak hedeflenmiş bir nanomalzeme üretme yeteneğidir. Alüminyum diskleri tek kenarlı bir bıçak ve küçük bir çekiçle küçük parçalar halinde keserek başlayın. Kesilen parçaları iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüm alüminyum parçalarının kaplandığından emin olarak bir mililitre bir molar sodyum hidroksit ile doldurun.

Tüpü oda sıcaklığında kimyasal çeker ocakta 30 dakika bekletin. İnkübasyondan sonra, alüminyum parçaları bir cımbızla çıkarın ve salınan nanotelleri 30 dakika daha sodyum hidroksit içinde tutun. Tüpü manyetik kuru bir rafa yerleştirin, iki dakika bekleyin ve çözeltiyi taze sodyum hidroksit ile değiştirin.

İki mililitrelik tüpü nanotellerle 30 saniye boyunca sonikasyon yapın ve kimyasal bir davlumbaz içinde bir saat bekletin. Bu adımı en az dört kez tekrarlayın. Bittiğinde, iki mililitrelik tüpü manyetik rafa yerleştirin, sodyum hidroksiti atın ve bir mililitre mutlak etanol ile değiştirin.

Nanotelleri 30 saniye boyunca sonikleştirin, tüpü manyetik rafa yerleştirin ve etanolü değiştirin. Etanol yıkamayı en az dört kez tekrarlayın. Nanotelleri yıkadıktan sonra, bir mililitrelik bir pipetle beş mililitrelik bir cam tüpe aktarın.

Nanotel çözeltisine 100 mikrolitre APTES ekleyin ve cam tüpü 20 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü ultrasonik bir banyoya yerleştirin ve bir saat boyunca sonikleştirin. Daha sonra tüpü banyodan çıkarın ve 400 mikrolitre deiyonize su ve 20 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin.

Bir saatlik sonikasyonu tekrarlayın. Cam tüpü ultrasonik banyodan çıkardıktan sonra, nanotelleri toplamak için bir mıknatısın yanına yerleştirin. Süpernatanı bir mililitre taze mutlak etanol ile değiştirin ve tüpü 10 saniye boyunca sonikleştirin.

Etanol yıkama ve sonikasyonu iki kez tekrarlayın. İki mililitrelik bir tüpte 0.4 miligram EDC ve 1.1 miligram Sulfo-NHS ve bir mililitre MES çözün. Başka bir iki mililitrelik tüpte, 960 mikrolitre 0.1 molar PBS ekleyin ve buna 30 mikrolitre anti-CD44 antikoru ekleyin.

Daha sonra, önceden hazırlanmış EDC / Sulfo-NHS karışımından 10 mikrolitre bu tüpe ekleyin. Antikor tüpünü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10 kez G'de çalkalayın. Bu arada, APTES kaplı nanotellerin bulunduğu tüpün yanına iki dakika boyunca bir mıknatıs yerleştirin, etanolü atın ve PBS ile değiştirin.

Nanotelleri 10 saniye boyunca sonikleştirin. PBS ile son yıkamadan sonra, nanotelleri toplayın ve aktive edilmiş antikor çözeltisini nanotellerin tüpüne aktarın. Sonra 10 saniye boyunca sonikleştirin.

Döndürücüdeki tüpü gece boyunca dört santigrat derecede değiştirin. Ertesi gün, nanotelleri mıknatısla toplayın ve süpernatanı atın. Bir mililitre% 2 BSA ekleyin ve reaksiyonu engellemek için tüpü dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Elektron enerji kaybı spektroskopisi veya EELS haritaları, nanotel yüzeyindeki silikon atomlarını görselleştirmek ve APTES kaplamasının varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Kaplanmamış nanotellerde, demir atomları koyu mavi görünür ve demir ve oksijen karışımı atomlar açık mavidir. Kaplanmamış nanotellerin karşılık gelen EELS haritalaması, merkezdeki oksijene karşı yüzeyden daha yüksek bir demir yoğunluğu gösterir ve bu da bir demir-demir oksit yapısını gösterir.

Haritalama, demir oksit tabakasının demir(III)oksitten daha fazla demir(II, III)oksit içerdiğini gösterdi. Bağlı antikorların antijenitesi, immünopresipitasyon ve western blot testleri kullanılarak doğrulandı. BCA testi, nanotellerdeki antikorların sayısını ölçmek için kullanıldı.

Yüzey fonksiyonelleşmesini aydınlatmak için zeta potansiyelinin ölçümü kullanıldı. APTES üzerindeki terminal amin grubu, kaplanmamış nanotellere kıyasla negatif yükü azalttı. Antikor işlevselleştirmesi yükü daha da azalttı.

Antikorla işlevselleştirilmiş nanotellerin spesifik hücre hedeflemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulandı. Şekil A ve B, sırasıyla numune C ve D'nin parlak alan mikroskobu görüntülerini temsil eder. Kırmızı renk, hücre zarının tasvirine karşılık gelir, mavi çekirdeği temsil eder ve yeşil kümeler, bağlı, hedeflenmiş CD44 nanotellerin varlığını gösterir.

Ayrıca, hücre canlılığı testi, kaplanmamış, APTES kaplı ve antikor kaplı nanotellerin biyouyumlu olduğunu doğrulamak için kullanıldı. APTES proses kaplamasında, APTES molekülü ile nanoteller arasındaki bağı güçlendirmek için deiyonize suyun sodyum hidroksit çözeltisinden önce eklenmesi çok önemlidir. Ayrıca, biyofonksiyonelleştirme işlemi sırasında, antikor ve nanoteller arasındaki kovalent bağı arttırmak için nanotelin PBS tamponu ile birkaç kez yıkanması gerekir.