Name: Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Keşfedin demir nanotellerin antikorlarla biyofonksiyonelleştirilmesi protokolünü ve kanser hücrelerine özgü hedefleme yöntemini. Bu teknik, hedefe yönelik ilaç taşıma sistemleri için biyouyumlu nanomalzemeler geliştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayında bildirilen araştırma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (KAUST) tarafından desteklenmiştir.

DİKKAT: Kullanmadan önce daima ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) bakın. Tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın (koruyucu gözlükler, eldivenler, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolonlar, burnu kapalı ayakkabılar). Tüm biyolojik reaksiyonları biyolojik çeker ocakta gerçekleştirin.
NOT: Bu protokolün, 3 x 104 antikor/KB yoğunluğa sahip anti-CD44 antikorları ile kaplanmış 0.36 mg demir/mL'ye eşdeğer 2 x 10 10 biyofonksiyonelleştirilmiş NW/mL üretmesi amaçlanmıştır. Demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) KB'leri 2.5 μm uzunluğunda ve 41.5 nm çapındadır.
1. Demir nanotellerin serbest bırakılması
NOT: Demir/demir oksit NW'lerin üretim süreci önceki bir yayında ayrıntılı olarak açıklanmıştır59.
<ol><li>Bir kesme matı üzerinde, alüminyum (Al) diskleri (Şekil 2A) tek kenarlı bir bıçak ve 2 mL'lik bir tüpe sığacak şekilde küçük bir çekiç kullanarak küçük parçalara (Şekil 2B) kesin. Küçük Al parçalarını tüpe aktarmak için cımbız kullanın.</li>
	<li>Küçük Al parçalarını içeren 2 mL'lik tüpü 1 mL 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile doldurun. Tüm Al parçalarının NaOH ile kaplandığından emin olun.</li>
	<li>Çözeltiyi kimyasal çeker ocak içinde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.</li>
	<li>Cımbız kullanarak sadece Al parçalarını çıkarın ve serbest kalan NW'leri (siyah kümeler, Şekil 3A) 30 dakika daha NaOH solüsyonunda tutun. NaOH çözeltisini değiştirmeyin.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik bir rafa yerleştirerek NW'leri toplayın ve eski 2 M NaOH çözeltisini çıkarmadan önce 1 dakika bekleyin. Taze NaOH çözeltisi ile değiştirin.</li>
	<li>NW'leri içeren 2 mL'lik tüpü 30 saniye boyunca sonikasyon yapın ve kimyasal bir davlumbaz içinde 1 saat bekletin.</li>
	<li>1.5-1.6 adımlarını en az dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik rafa yerleştirerek NW'leri yıkayın ve 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>NaOH çözeltisini atın ve 1 mL mutlak etanol ile değiştirin.</li>
	<li>Tüpü 30 saniye boyunca sonikleştirin.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik rafa yerleştirin ve 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>Eski mutlak etanol çözeltisini atın ve 1 mL taze mutlak etanol ile değiştirin ve 30 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>Adım 1.11 ve 1.12'yi en az dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>NW'leri ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında 1 mL mutlak etanol içinde tutun.</li>
	<li>Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) kullanarak demir konsantrasyonunu ve dolayısıyla NW'leri ölçün. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ancak, uzun süreli depolama için, gerekli olana kadar NW'leri Al şablonundan serbest bırakmayın. Serbest bırakılan NW'lerin etanolde sık sonikasyon olmadan uzun süre çökeltilmesi, ayrılması için daha uzun sonikasyon sürelerine ihtiyaç duyacak kümelenmeler yaratacaktır.</li>
</ol>2. Nanotellerin APTES ile kaplanması
NOT: Bu protokolde, 100 μL APTES çözeltisi (yoğunluk 0.946 g/mL61), 1.6 x 107 m2/g NW'leri kaplamak için yeterlidir. Nanomalzemenin oranında veya kütlesinde bir değişiklik varsa, APTES hacmi buna göre ayarlanmalıdır.
<ol><li>NW'leri 1.14 mL'lik bir pipet kullanarak 5. adımdan 1 mL'lik bir cam tüpe aktarın.</li>
	<li>2 mL'lik tüpte kalan NW'leri toplamak için, boş 2 mL'lik tüpü 1 mL mutlak etanol ekleyerek iki kez yıkayın ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik cam tüpe aktarın.</li>
	<li>Pipeti kullanarak 100 μL APTES alın ve doğrudan KB çözeltisine ekleyin.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü cl üzerine ayarlayınamp bir laboratuvar imbik standının.</li>
	<li>5 mL cam tüpün yarısını ultrasonik banyo suyunun içine yerleştirin ve 1 saat boyunca sonikasyon yapın.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü ultrasonik banyodan çıkarın ve 400 μL deiyonize (DI) su ve ardından 20 μL 1 M NaOH (temel kataliz) ekleyin. DİKKAT: Önce DI suyunun eklenmesi önemlidir.</li>
	<li>2.5-2.6 adımlarında açıklandığı gibi 5 mL cam tüpü ayarlayın ve 1 saat daha sonikasyon yapın.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü ultrasonik banyodan çıkarın.</li>
	<li>NW'leri toplamak için cam tüpün yanına 5 dakika boyunca bir mıknatıs yerleştirin.</li>
	<li>Süpernatanı 1 mL taze mutlak etanol ile değiştirin ve 10 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>2.10-2.11 arasındaki adımları dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüm NW'lerin süspansiyon etanolünü 1 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik yeni bir cam tüpe aktarın. NOT: APTES kaplı NW'ler, ihtiyaç duyulana kadar etanol içeren bir cam tüp içinde saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>3. Nanotellerin biyofonksiyonelleştirilmesi
<ol><li>Antikorların aktive edilmesi NOT: Yaklaşık 3 x 104 kısım antikor/KB elde etmek için, 0.1 mg demir başına 30 μL antikor (1 mg/mL) kullanın.<ol><li>2 mL'lik bir tüpte, 0.4 mg 3-3-dimetil-aminopropil karbodiimid (EDC) ve 1.1 mg sülfo-N-hidroksisülfosüksinimid (Sulfo-NHS) 1 mL 2-N-morfolino etansülfonik asit hidrat (MES) (pH 4.7). NOT: EDC/sülfo-NHS karışımı kullanılmadan önce taze ve hazırlanmış olmalıdır.</li>
		<li>Yeni bir 2 mL'lik tüpte, sırasıyla 30 μL anti-CD44 antikoru (1 mg / mL), 960 μL 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7) ve 10 μL EDC / sülfo-NHS karışımı (adım 3.1.1'de hazırlanır) ekleyin.</li>
		<li>2 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10 x g'lık bir tüp çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>APTES kaplı nanotellerin hazırlanması<ol><li>Adım 3.1.3'teki 15 dakikalık inkübasyon sırasında, NW'leri toplamak için APTES kaplı NW tüpünün (adım 2.13'ten itibaren) yanına bir mıknatıs yerleştirerek NW'leri 2 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Etanolü atın ve 1 mL 0.1 M PBS (pH 7) ile değiştirin ve ardından 10 saniye boyunca sonikasyon yapın.</li>
		<li>3.2.1-3.2.2 adımlarını dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Adım 3.2.1'de açıklandığı gibi NW'leri toplayın ve 0.1 M PBS'yi atın. NW'leri herhangi bir çözelti olmadan tüpte tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikorların bağlanması<ol><li>Tüm aktive edilmiş antikor çözeltisini (adım 3.1.3'te hazırlanan) NWS tüpüne (3.2.4'te hazırlanan) aktarın ve 10 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
		<li>Cam tüpü gece boyunca 4 °C'de döndürücüye yerleştirin.</li>
		<li>Adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak NW'leri toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Reaksiyonu bloke etmek için 4 ° C'de 1 saat boyunca 1 mL% 2 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi eklenmesi.</li>
		<li>Antikor ile işlevselleştirilmiş NW'lerin antijenisitesini kontrol edin, örneğin, immünopresipitasyon (IP) ve western blot (WB) tahlilleri kullanarak. NOT: Daha iyi sonuçlar için, engelleme adımından hemen sonra IP, WB veya biyouyumluluk tahlilinde biyoişlevselleştirilmiş NW'leri kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Biyouyumluluk testi
NOT: NW'lerin biyouyumluluğunu incelemek için çeşitli hücre canlılığı deneyleri ve farklı hücre hatları kullanılabilir. Burada kullanılan NW'lerin konsantrasyonu önceki bir yayınadayanmaktadır 16. Hücre tohumlaması, KB biyofonksiyonelizasyonundan bir gün önce yapılmalıdır.
DİKKAT: Aşağıdaki adımların tümü biyogüvenlik kabini altında yapılmalıdır.
<ol><li>96 oyuklu bir plakada, McCoy'un hücre kültürü ortamında (100 μL/oyuk) süspanse edilmiş 4 x 104 kolon kanseri hücresi (HCT116 hücre hattı) ile dokuz kuyucuğu tohumlayın ve gece boyunca 37 °C ve %5 karbondioksitte (CO2) inkübatörün içine yerleştirin.</li>
	<li>NW'leri (adım 3.3.4'ten itibaren) adım 3.2.1'de olduğu gibi bir mıknatıs kullanarak toplayarak PBS ile yıkayın ve eski çözeltiyi 1 mL 0.01 M PBS (pH 7) ile değiştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>NW'leri (adım 4.2'den itibaren) adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak toplayarak ısıtılmış McCoy's ortamıyla yıkayın ve eski PBS'yi 1 mL ısıtılmış McCoy's ortamıyla değiştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak NW'leri (adım 4.3'ten itibaren) toplama ve 1 mL ısıtılmış McCoy's ortamını 900 μL ısıtılmış McCoy's ortamıyla değiştirin. NW konsantrasyonu mL başına 0.02 mg NW olmalıdır.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı (adım 4.1'den itibaren) inkübatörden biyogüvenlik kabinine alın.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininin altında, eski ortamı hücrelerden atın ve 100 μL asılı NW'lerle değiştirin (adım 4.4'te hazırlanmıştır).</li>
	<li>Plakayı (adım 4.6'da hazırlanan) elle çalkalayın ve ardından inkübatörün içinde 37 °C ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, inkübatörden 96 oyuklu plakayı (adım 4.7'de hazırlanan) çıkarın. Biyogüvenlik kabininin altına, çok duvarlı pipeti kullanarak her bir oyuğa 11 μL hücre canlılığı reaktifi (Malzeme Tablosu) ekleyin.</li>
	<li>Plakayı plaka çalkalayıcı ile 10 s boyunca 10 x g hızında sallayın.</li>
	<li>Plakayı inkübatörde 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı (adım 4.10'da hazırlanan) inkübatörden çıkarın. Hücre canlılığı reaktifinin (uyarma 540 nm, emisyon 590 nm) absorbansını ölçerek mikroplaka okuyucudaki (Malzeme Tablosu) plakayı okuyun.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Herhangi bir nanomalzeme imalat ve kaplama yönteminde olduğu gibi, kullanılan çözeltilerin yüksek kalitede olması gerekir. Serbest bırakma (1 M NaOH) ve işlevselleştirme (MES) çözeltileri birkaç kez yeniden kullanılabilir. Bununla birlikte, yeni bir işleme başlamadan önce pH değerlerini kontrol etmek çok önemlidir. Serbest bırakma adımında, NW'lerin NaOH ile yıkanması en az dört kez yapılmalıdır. Yıkama ne kadar iyi olursa, NW'lerin stabilitesi o kadar iyi olur ve o kadar az agrega olurlar. Oksit tabakası, etanol veya suya daldırıldığında NW'lerin stabilitesini arttırır63.
NW'lerin çapı ve uzunluğu, APTES ve antikorlarla kaplandıktan sonra etkilendi. Burada, çap 41.5 nm'den 70 nm'ye yükseldi ve NW'leri kıran sonikasyon adımları nedeniyle uzunluk 2.5 μm'den 1.6 μm'ye düştü. Bu nedenle, biyoişlevselleştirme adımından sonra KB'lerin morfolojisini karakterize etmek esastır.
Antikorların NW'lere bağlanması, amin grubu (APTES üzerinde) ve karboksil grubu (antikor üzerinde) arasındaki kovalent etkileşime dayanır. Bu nedenle, APTES kaplamasının varlığını doğrulamak, EELS haritalamasını kullandığımız önemli bir adımdır. Kaplama yöntemi güvenli ve basittir. Yüksek sıcaklıklara veya uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duymaz. Ayrıca APTES kaplama, bir karboksil grubuna sahip diğer antikorların veya proteinlerin kovalent bağlanmasını sağlamak için bir bağlayıcı görevi görür.
NW'lerin bir antikorla biyofonksiyonelleştirilmesi durumunda, biyofonksiyonelleştirme işleminden sonra antikorların bağlanma bölgelerinin antijenikliği etkilenebilir. Bu sorunu araştırmak için IP ve WB yöntemi kullanılabilir. Bu protokolde bahsedilen biyofonksiyonelleştirme yönteminin kullanılması, antikorların belirli bir hücre reseptörüne yüksek antijeniteye sahip NW'lere bağlanmasına izin verecektir. Ayrıca, NW'lerin antikorlarla biyofonksiyonelleştirilmesi, burada ilgilenilen reseptör olan CD44 ile hücreleri hedefleme yeteneğini ekledi. Bu konfokal mikroskopi ile doğrulandı. Kaplamasız NW'lerin biyouyumluluğu yüksek olmasına rağmen (%>95), NW'lere APTES kaplama veya antikorların eklenmesi biyouyumluluklarını %100 artırmıştır.
Ayrıca, kaplama ve biyofonksiyonelleştirme protokolü verimli, ekonomik ve tekrarlanabilirdir. Diğer herhangi bir demir-demir oksit nanomalzemesine uygulanabilir olmalıdır, bu sayede hem kaplamanın hem de bağlı antikorların konsantrasyonu, nanomalzemenin yüzey alanına ve kütlesine göre optimize edilmelidir. Bu protokol genel laboratuvarda ortam koşullarında güvenle yapılabilir. Biyoişlevselleştirme, nanomalzemenin biyouyumluluğunu ve hedefleme yeteneklerini önemli ölçüde artırmıştır. Genel olarak, NW'ler nanomedikal uygulamalar için son derece umut verici malzemelerdir (çok modlu veya kombinatoryal tedaviler, hücre tespiti veya rehberliği ve biyolojik algılama dahil). Burada açıklandığı gibi biyoişlevselleştirme ile birlikte, daha fazla hassasiyet ve etkinlik için spesifik hücre hedeflemesi elde edilebilir.

Manyetik nanomalzemelerin benzersiz bir özelliği, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ile de izlenebildikleri gibi, onları birçok yönden harekete geçirmek için faydalı bir şekilde kullanılabilen manyetik alanlara1 yanıt verme yetenekleridir. Yüksek frekansta alternatif bir manyetik alan uygularken, hipertermiye neden olabilecek ısı üretebilirler ve terapötik bir seçenek1 sağlarlar. Diğer bir yaklaşım, yakın kızılötesi (NIR) lazer 2,3 ile gerçekleştirilebilen fototermal tedavidir.
Çok sayıda manyetik nanomalzeme arasında demir oksit, manyetik ayırma, hipertermi 2,4, hücre rehberliği5, ilaç dağıtımı 6,7,8 ve MRG 9,10'da kontrast madde olarak biyolojik uygulamalarda en büyük ilgiyi görmüştür. Bunun nedeni, yüksek biyouyumlulukları 11,12, büyük manyetizasyon 11,12, kaplanabilme 9,13,14,15, ilaç taşıma yetenekleri 2,16, ilaçlarla işlevselleştirilebilmeyetenekleri 2,16 ve/veya hedefleme ajanları 12,13,17,18 ve optik enerjiyi ısıya dönüştürme yeteneği2. Son zamanlarda, MagForce, hipertermi tedavisi için demir oksit nanopartikülleri kullanan kanser hastaları üzerinde klinik deneylere başladı19.
Son zamanlarda, manyetik nanoteller (NW'ler) biyomedikal uygulamalar için giderek daha fazla kullanılmaktadır 3,11,16,20,21,22. Manyetik nanoboncuklarla benzer özelliklere sahiptirler, ancak anizotropik bir şekil ve çok büyük bir manyetik moment sunarlar, bu da manyeto-mekanik etkileri indüklemek için düşük frekanslı çalıştırma da dahil olmak üzere bir manyetik alan23,24 tarafından çok verimli bir uzaktan kumanda sağlar 25,26,27,28,29 . Sonuç olarak, NW'ler eksozom izolasyonu 30 hücre takibi 21, kanser tedavisi 3,11,16, ilaç dağıtımı 16,31,32 ve MRI kontrast maddesi 33 gibi farklı biyolojik uygulamalar için uygulanmıştır.
Spesifik hücre hedefleme yeteneğine sahip biyofonksiyonelleştirilmiş manyetik nanomalzemeler, biyomedikal uygulamalar ve hassas tıpta büyük potansiyele sahiptir34,35. Bu hedefleme ajanlarını eklemek için, nanomalzemeler üzerinde bir yüzey modifikasyonu gereklidir. Tipik olarak, tedavi edici ajanların bağlanmasını kolaylaştıran fonksiyonel bir grup sağlayan bir kaplamaya ihtiyaç duyarlar. Literatürde, manyetik nanomalzemeler için çok sayıda organik ve inorganik kaplama vardır. Nanomalzemeye immobilize edilebilen fonksiyonel gruba bağlı olarak, bu kaplamalar dört ana grupta kategorize edilebilir: karboksilik asit gruplarına dayalı moleküller, polimerler, histidin ve silan gruplarına dayalı moleküller.
Karboksilik asit gruplarına dayalı moleküller, yüzey modifikasyon yöntemlerinden biridir. Yüksek afiniteyi kullanır kaplama üzerindeki negatif karboksilik asit grubu ile manyetik nanomalzemeler üzerindeki pozitif yükarasında 36,37,38. Bir karboksilik asidin metal bir yüzeye bağlanma işlemi, metal-karboksilat tuzlarının oluşumunu veya karboksil grubunun metale yapışmasını içerebilir. Bununla birlikte, biyo-uygulamalar için üstün özelliklere sahip demir/altın veya nikel/altın KB'ler gibi çok segmentli KB'ler için39,40, bu tür kaplamalar kolayca uygulanamaz. Aynı anda iki farklı kaplama gerektirir: altın segmentlerini değiştirmek için tiyol grupları ve manyetik segmentler (demir veya nikel) için karboksil grupları38. Karboksil gruplarına dayalı bazı molekül örnekleri hematoporfirin, pimelik asit, palmitik asit ve 3-[(2-aminoetil) ditio] propiyonik asittir (AEDP)38. Polimerler kullanılarak manyetik nanomalzemelerin yüzey modifikasyonları bazı belirgin avantajlar sunar. Polimerlerin büyük moleküler ağırlığı nedeniyle, bir çözelti38 içindeki manyetik nanomalzemenin stabilitesini arttırır. Bununla birlikte, nanomalzemenin boyutunu önemli ölçüde artıracaktır38. Polivinilpirolidon (PVP), polietilenimin (PEI), arginin-glisin-D aspartik asit (RGD) ve polietilen glikol (PEG), yüzey modifikasyonları için en yaygın kullanılan polimerlerin bazı örnekleridir. Her birinin kendine has özellikleri vardır ve38 kullanır. Üçüncü yüzey modifikasyon yöntemi, bir histidin kaplama kullanmaktır. Histidin, nikel38 gibi sınırlı sayıda manyetik nanomalzemeye yüksek afiniteye sahip histidin amino asit yan zincirine sahip bir proteindir. Protein saflaştırma işlemleri için kullanılabilir 38,41,42. Nikel/altın NW'ler38 gibi çok segmentli NW'lere bir histidin kaplama da uygulanabilir. Bir nanomalzeme yüzeyinin silanizasyonu köklü bir süreçtir 38,43,44. Herhangi bir metal oksit yüzeyine üç tekli bağ yoluyla bağlanan bir silikon atomuna dayanır ve aynı zamanda bu silikon atomu, bir alkil zinciri38,43,44 aracılığıyla sonunda fonksiyonel gruba bağlanır. Bu kaplamanın avantajı serbest amin grupları sağlamasıdır ve sırasıyla nikel ve altın gibi hem manyetik hem de manyetik olmayan malzemeleri38,45 kaplama kabiliyetine sahiptir. Bu nedenle, salin grubuna dayalı moleküllerin kullanılması, çok segmentli NW'leri biyoişlevselleştirmek için pratik bir yoldur. Silan gruplarına dayalı bazı molekül örnekleri (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) ve (3-aminopropil) trimetoksisilan (APTMS)38,45'tir.
Kaplamaya bir hedefleme maddesinin eklenmesi, hastalıklı hücrelerin hem tanı hem de tedavisinde önemli bir rol oynayabilir ve aynı zamanda sağlıklı dokular üzerindeki yan etkileri en aza indirebilir46,47. Nanomalzemelerin yüzeyine bir hedefleme maddesinin eklenmesi, endositoz reseptörleri7 yoluyla hem hücresel seçici bağlanmayı hem de içselleştirmeyi arttırır. Bu hedefleme ligandları olmadan, nanomalzemeler, ligandlarla nanomalzemelere kıyasla daha düşük bir oranda bağlanan hücre zarları ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girer48. Kanser dokularını hedeflemenin zorluklarından biri, sağlıklı dokulara karakteristik benzerlikleridir. Bu nedenle, hedeflemenin başarısı esas olarak biyolojik hedef olarak kullanılacak uygun ligandın belirlenmesine bağlıdır49,50. Nanomalzemeleri kanser hücrelerine yönlendirmek için çeşitli hedefleme ajanları kullanılmıştır48,51 (örneğin, CD44, sağlıklı hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde yüksek ekspresyonunedeniyle 52,53,54,55).
Hedefleme ajanları, yapıldıkları bileşenlere ve karmaşıklıklarına göre üç ana gruba ayrılabilir: aptamer tabanlı hedefleme, ligand tabanlı hedefleme ve antikor tabanlı hedefleme. Aptamerler, iki ve üç boyutlu yapılara katlanan ve onları belirli bir antijeni, çoğunlukla proteinleri hedefleyebilmelerini sağlayan, kimyasal olarak sentezlenmiş kısa DNA veya RNA-oligonükleotid zincirleridir56. Ligand bazlı hedefleme, peptitleri ve kısa amino asit zincirlerini içerir57. Antikor tabanlı hedefleme, tek zincirli değişken fragmanlar veya antijen bağlayıcı fragmanlar gibi tüm antikorun veya antikor fragmanlarının kullanılmasını içerir51. Bu yöntemin kullanılması, spesifik hedef antijenine yüksek bağlanma afinitesine sahip iki bağlanma bölgesine sahip olma avantajına sahiptir, bu da ona son derece yüksek bir seçicilik verir58. Bağlanma bölgeleri bir kilide ve antijen bir anahtarabenzer 58.
Bu çalışmada, kullanılan NW'ler, önceki bir yayında ayrıntılı olarak açıklanan bir yöntem olan alüminyum oksit membranlar üzerine elektrodepozisyon yoluyla üretilmiştir59. Buradaki odak noktası, bu demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) NW'leri membranlardan salmak ve bir hedefleme yeteneği sağlamak için bunları spesifik antikorlarla biyofonksiyonelleştirmektir. Antikorlar doğrudan demir-demir oksit NW'lere bağlanamaz ve bir bağlayıcı gerektirir. NW'lerin APTES ile kaplanması, antikorlar üzerindeki karboksil grubu aracılığıyla kovalent bağlanmayı sağlayan serbest amin grupları sağlar (Şekil 1). APTES kaplamanın avantajı, demir/altın veya nikel/altın NW'ler45 gibi hem manyetik21 hem de manyetik olmayan60 malzemeler için çalışabilmesidir. Bu protokolde açıklanan tüm kaplama ve biyofonksiyonelleştirme adımları, genel olarak herhangi bir demir / demir oksit nanomalzemesi ile kullanılabilir. Burada örnek olarak demir/demir oksit KB'ler kullanılmıştır. Sonuçlar, antikorla işlevselleştirilmiş NW'lerin, farklı uygulamalar için kullanılabilen spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine karşı yüksek bir antijeniteye sahip olduğunu göstermektedir. Örnekler arasında hücre ayrımı, ilaç dağıtımı, fototermal ve/veya manyeto-mekanik tedaviler kullanılarak spesifik kanser hücresi tedavisi yer alır.

<table><tbody><tr><td>2 mL tüp (geçmeli kapaklı Mikrosantrifüj)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morpholino EtanSülfonik asit hidrat %99 (MES)</td><td>Thermscientific</td><td>AC172590250</td><td>Konsantrasyonu 0.1 M ve pH 4.7</td></tr><tr><td>3-3-Dimetil-aminopropil Karbodiimid (EDC)</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-AminoPropil-Tri-Etoksi-Silan (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>919302</tr><tr><td>5 mL cam tüp</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka (düz dipli)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>Klon 515, konsantrasyon 1 mg / mL</td></tr><tr><td>APTES ((3-Aminopropil) trietoksisilan,% 99</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>919-30-2</td><td>Konsantrasyon% 99</td></tr> <tr><td>BCA testi (Pierce BCA Protein Test Kiti)</td> <td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin çözeltisi (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Konsantrasyon% 35</td></tr> <tr><td>Hücre inkübatörü</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Hücre canlılığı reaktifi</td><td>AlamarBlue, Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Kolon kanseri hücreleri - HCT116 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Parke Çekiç</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir çekiç aleti kullanılabilir, belirli bir marka yoktur.</td></tr><tr><td>Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma Kütle Spektrometresi (ICP-MS)</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>Kullanılan yazılım "Elan cihaz kontrol oturumu"</td></tr><tr><td>dur.Kelepçeli Laboratuvar İmbik Standı</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>Bu, sonikatör banyosundaki 5 mL cam tüpü işlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Manyetik raf (DynaMag-2 Mıknatıs)</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A Orta 1x</td><td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu (Bio-Rad xMark Absorbans Spektrofotometresi)</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 yazılımı (#168-9520)</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) 10x</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>Konsantrasyonu 0.1 M (Hesaplama yok, magnezyum yok)</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Konsantrasyonu 0.01 M (Hesaplama yok, magnezyum yok)</td></tr><tr><td>Plaka çalkalayıcı (Mikroplaka Genie)</td><td>Bilimsel Endüstriler (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kenarlı Tıraş Bıçağı</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodum hidrikit (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Konsantrasyon 1 M, pH 13</td></tr><tr><td>Sülfo-N-HidroksiSülfosüksinimid (sülfo-NHS)</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Tüp döndürücü</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Tüp çalkalayıcı (Eppendorf Thermomixer R Mikser, 2.0 mL)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo (2510)</td><td>Branson</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

manyetik nanomalzemelerin biyofonksiyonelleştirilmesi

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Manyetik nanomalzemeler farklı biyomedikal uygulamalarda büyük ilgi görmüştür. Bu nanomalzemelerin spesifik hedefleme ajanları ile biyofonksiyonelleştirilmesi, yan etkileri en aza indirirken teşhis ve tedavilerdeki etkinliklerini artırmak için çok önemli bir husustur. Manyetik nanomalzemelerin manyetik olmayanlara kıyasla avantajı, manyetik alanlara temassız bir şekilde ve büyük mesafelerde yanıt verebilmeleridir. Bu, onları yönlendirmeye veya biriktirmeye izin verirken, aynı zamanda izlenebilirler. Son zamanlarda, biyomedikal uygulamalar için benzersiz özelliklere sahip manyetik nanoteller (NW'ler) geliştirilmiştir. Bu NW'lerin büyük manyetik momenti, hareketlerinin bir manyetik alan tarafından daha verimli bir şekilde uzaktan kontrol edilmesini sağlar. Bu, kanser tedavisinde, ilaç dağıtımında, hücre izlemede, kök hücre farklılaşmasında veya manyetik rezonans görüntülemede büyük başarı ile kullanılmıştır. Ek olarak, şablon destekli elektrokimyasal biriktirme yoluyla KB üretimi, KB özellikleri üzerinde sıkı kontrole sahip çok yönlü bir yöntem sağlar. Özellikle demir NW'ler ve demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) NW'ler, yüksek manyetizasyonları ve düşük toksisiteleri nedeniyle biyomedikal uygulamalar için uygundur.
Bu çalışmada, çok sayıda kanser hücresinde aşırı eksprese edilen belirli bir hücre yüzeyi belirtecine karşı yönlendirilmiş spesifik antikorlarla demir/demir oksit NW'leri biyoişlevselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Yöntem, demir oksit yüzeyinin özelliklerini kullandığından, süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerine de uygulanabilir. NW'ler ilk olarak, antikorların kovalent olarak bağlandığı bir bağlayıcı görevi gören 3-aminopropil-tri-etoksi-silan (APTES) ile kaplanır. APTES kaplaması ve antikor biyofonksiyonelleştirmesi, elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) ve zeta potansiyeli ölçümleri ile kanıtlanmıştır. Ek olarak, NW'ler üzerindeki antikorların antijenitesi, immünopresipitasyon ve western blot kullanılarak test edilir. Biyofonksiyonelleştirilmiş NW'lerin spesifik hedeflenmesi ve biyouyumlulukları, konfokal mikroskopi ve bir hücre canlılığı testi ile incelenmiştir.

Alüminyum (Al) disklerin (Şekil 2A) kullanılan tüpe sığması için küçük parçalara (Şekil 2B) kesilmesi önemlidir. Al parçalarına 1 M NaOH eklendikten sonra, kabarcıkların oluşturulmasıyla gözlemlenen bir reaksiyon hemen başlamalıdır. 1 dakika içinde herhangi bir reaksiyon meydana gelmezse veya reaksiyon çok hızlıysa ve çözelti beyaz bir bulutla tamamen bulanıklaşırsa, eski NaOH çözeltisini hemen çıkarın ve yeni bir çözelti ile değiştirin. NaOH çözeltisinin pH değerini kontrol edin. pH&gt;12 olmalıdır. NW'ler NaOH ile ilk 30 dakika içinde Al parçalarından serbest bırakıldığında, NW'ler (siyah kümeler, Şekil 3A) NaOH çözeltisi içinde yüzüyor olacaktır. NW'lerin serbest bırakılmasının son adımında, çözelti homojen olmalıdır. Orada hiçbir KB kümesi olmamalıdır (Şekil 3B). NW'ler 3 dakika boyunca bir mıknatısla toplandıysa, çözelti berrak olmalı ve NW peleti siyah olmalıdır (Şekil 3C). Pelet griyse, tüpü atın ve yeni bir Al numunesi ile tekrar başlayın.
Serbest bırakma işlemi sırasında, NW'ler, önceki raporlara benzer şekilde, yaklaşık 5 nm kalınlığında doğal bir demir oksit tabakası eldeeder 11,16,20. Bu oksit tabakasının KB'lerin biyouyumluluğuna 16, fonksiyonelleşmesine 16,18 ve manyetik özelliklerine20 önemli katkısı vardır. Bununla birlikte, NW'leri ihtiyaç duyulana kadar şablonlarında tutmak (yani serbest bırakmamak), üzerlerinde herhangi bir çevresel etki olmasını önleyecektir. Serbest bırakma işleminden sonra KB'lerin ortalama çapı ve uzunluğu sırasıyla 2.5 μm ve 41.5 nm idi. Tek bir KB'nin kütlesi Tablo 1'de açıklandığı gibi hesaplanabilir ve endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) ile doğrulanır. Burada, her alümina disk yaklaşık 0.3 mg demir içeriyordu.
NW'lerin serbest bırakıldıktan sonra toplanmasını azaltmak ve daha fazla işlevselleştirmeyi sağlamak için NW'ler APTES ile kaplandı. Bu kaplama, serbest amin grupları sağlar ve hem manyetik hem de manyetik olmayan malzemeleri39,45 kaplama kabiliyetine sahiptir, bu da onu demir/altın NW'ler gibi çok segmentli NW'lerin kaplanması için uygun hale getirir. Nanoteller kaplama sırasında iki şeye odaklanmak önemlidir. İlk olarak, NW'lerin yüzey alanına ve kütlesine bağlı olarak APTES moleküllerinden62 gerekli hacmi hesaplayın. Bu hesaplamalar Tablo 2'de sunulmuştur. İkinci olarak, topaklanmalarını ve KB yüzeylerinin bazı kısımlarının APTES kaplamasından tıkanmasını önlemek için nanotelleri sürekli hareket halinde tutun. Örneğin, bu protokolde, nanoteller sırasıyla APTES kaplama ve antikor fonksiyonelizasyonu sırasında ultrasonik banyo ve döndürücü altında inkübe edildi. Her APTES molekülü, bir silikon atomu ve bir terminal fonksiyonel amin grubu21 içerir. Bu nedenle, elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) haritaları, KB yüzeyinde silikon atomlarını (pembe renk) göstererek APTES kaplamasının varlığını doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 4A). Buna karşılık, kaplanmamış NW'ler, demir atomlarını kabuk mavisi (Şekil 4B) ve demir/oksijen karışımı atomlarını açık mavi (Şekil 4B) olarak gösterir. Kaplanmamış NW'lerin karşılık gelen EELS haritalaması (Şekil 4C,4D), merkezde (Şekil 4C) yüzeydekinden (Şekil 4D) daha yüksek bir demir-oksijen yoğunluğunu gösterir ve bu da bir demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) yapısını gösterir. EELS haritalaması (Şekil 4 C,4D), KB'ler üzerindeki demir oksit tabakasının Fe 3 O4 Fe2O3olduğundan daha fazla olduğu tespit edildi, bu da önceki bir yayın20'ye benzer.
Bağlı antikorların antijenisitesi, pozitif numune üzerinde bir bandın gözlenebildiği, ancak negatif kontrollerde gözlenemediği IP ve WB testleri kullanılarak doğrulanabilir (Şekil 5). Net bir bant gözlemlemek için 0.1 mg'dan az NW / 10 x 106 hücre kullanmayın. Tablo 3'te sunulan bazı hesaplamalarla birlikte BCA testi (Malzeme Tablosu), KB'deki antikor sayısını ölçmek için kullanıldı.
Ayrıca, yüzey fonksiyonelleşmesini aydınlatmak için zeta-potansiyel ölçümü kullanılmıştır. APTES üzerindeki terminal amin grubu, Şekil 6'da gösterildiği gibi, kaplanmamış NW'lerin negatif yükünü azaltmıştır. Antikorla işlevselleştirilmiş NW'ler, APTES kaplı NW'lere kıyasla yükü de değiştirdi (Şekil 6). Tüm zeta-potansiyel ölçümleri pH 7'de yapıldı.
Antikorla işlevselleştirilmiş NW'lerin spesifik hücre hedeflemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanabilir (Şekil 7). Herhangi bir yeni nanomalzemenin biyouyumluluğu, herhangi bir uygulamaya başlamadan önce test edilmelidir. Bu nedenle, hücre canlılığı testi kullanıldı ve kaplanmamış, APTES kaplı ve antikor kaplı NW'lerin yüksek konsantrasyonda bile biyouyumlu olduğunu doğruladı (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> Şekil 1: Şematik, nanotellerin kaplama ve biyofonksiyonelleştirme yöntemini temsil eder. (A) Demir NW'lerin APTES ile kaplanması. (B) Sonunda (C) antikor ile işlevselleştirilmiş bir nanotel elde etmek için EDC + Sulfo-NHS kullanarak antikorların aktive edilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> Şekil 2: Demir birikintili alüminyum disk. (A) Kesimden önceki alüminyum disk. (B) Kırmızı çizgiler diskin nerede kesileceğini gösteriyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> Şekil 3: Nanotel serbest bırakma adımları. (A) Nanotellerin kümeleri NaOH çözeltisi içinde yüzer. Görüntü, NaOH eklendikten 10 dakika sonra ve Al membranı çıkarıldıktan sonra çekildi. (B) Etanol içinde süspanse edilmiş nanoteller. Fotoğraf, sonikasyon adımından hemen sonra, son serbest bırakma adımında çekildi. (C) Bir mıknatıs tarafından toplanan siyah nanotel peleti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> Şekil 4: Elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) haritası. (A) APTES kaplı nanotel (APTES-NW). Mavi ve pembe renkler sırasıyla demir ve silikon atomlarını temsil eder. (B) Kaplanmamış nanotel (NW). Kabuk mavisi ve açık mavi renkleri, sırasıyla demir ve demir/oksijen karışımı haritalamasını temsil eder. Kaplanmamış KB'lerin çekirdeğinin ve (D) kabuğunun karşılık gelen EELS haritalaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> Şekil 5: Antikor konjuge nanotellerin işlevselleşmesinin ve aktivitesinin doğrulanması. CD44-NW'lerin antijenitesi immünopresipitasyon (IP) ve western blot (WB) kullanılarak doğrulandı. +Ve: pozitif kontrolü (tam hücre lizatı) temsil eder. -Ve: negatif kontrolü temsil eder (yalnızca kaplanmamış KB). – CD44 hücreleri: CD44 antijenini eksprese etmeyen hücreleri temsil eder; + CD44 hücreleri: CD44 antijenini eksprese eden kolon kanseri hücrelerini temsil eder. Bu, n = 3 bağımsız deneyin temsili bir lekesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> Şekil 6: NW'ler, APTES-NW'ler ve antikor için zeta potansiyel değerleri. Çubuklar ortalama ± standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> Şekil 7: Konfokal mikroskobik görüntüler spesifik hedeflemeyi göstermektedir. CD44-NW'ler ekli (A ve C) gösterilirken, İzotip-NW'ler (negatif kontrol) bağlanmadı (B ve D). Kırmızı, mavi ve yeşil renkler sırasıyla hücre zarını, çekirdeği ve CD44-NW kümesini temsil eder. A ve B, sırasıyla C ve D'nin parlak alan görüntüleridir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> Şekil 8: Farklı nanotel formülasyonları ile inkübe edilmiş kolon kanseri hücrelerinin (HCT116) hücre canlılığı çalışması. Hücreler, 24 saatlik inkübasyondan sonra NW'lerle muamele edildi ve daha sonra NW'lerle 24 saat inkübe edildi. Tüm deneyler 37 °C'de bir inkübatör içinde gerçekleştirildi. Çubuklar ortalama ± standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Birim</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>Fe KB uzunluğu (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Yarıçap (çap/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Fe yoğunluğu (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>g/cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB hacim (V)= π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB kütle = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>μg</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB yüzey alanı = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>μm2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Demir KB kütlesinin hesaplanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Birim</td>
		</tr><tr><td>APTES/100 μL'nin yoğunluğu*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>APTES'in molekül gücü (MW)</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>g/mol</td>
		</tr><tr><td>APTES mol sayısı = kütle/MW</td>
			<td>4.29E-03</td>
			<td>Mol</td>
		</tr><tr><td>APTES molekül sayısı/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>Molekül</td>
		</tr><tr><td>APTES boyutu ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>Nm</td>
		</tr><tr><td>APTES yüzey alanı</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>KB yüzey alanı****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>0.3 mg KB'deki NW sayısı ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>KB'ler</td>
		</tr><tr><td>KB çevresinde bir katman oluşturmak için gereken APTES moleküllerinin sayısı</td>
			<td>1,38E+06</td>
			<td>APTES molekülü</td>
		</tr><tr><td>0.3 mg NW için gereken APTES molekülü sayısı</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>APTES molekülü</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Referans numarası 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** Molekül sayısı = Mol sayısı*avogadro sayısı (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Referans numarası 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tablo 1'den</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: NW kaplaması için gerekli APTES moleküllerinin sayısının hesaplanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>Y-şekilli IgG antikoru</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>Bir antikor için kütle</td>
			<td>2.3E-13 μg</td>
			<td>1,8E-08 μg*</td>
		</tr><tr><td>Bir antikor için yüzey alanı</td>
			<td>23 deniz mili2</td>
			<td>2,6E+05 deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>BCA testine göre</td>
			<td colspan="2">1 mg başına 0.3 mg</td>
		</tr><tr><td>Bir mg KB başına 0.3 mg antikordaki antikor molekülünün ve KB'nin sayısı</td>
			<td colspan="2">~5.6E+10 NW başına ~1E+15 antikor **</td>
		</tr><tr><td>KB başına antikor molekülü sayısı</td>
			<td colspan="2">1 KB başına ~2E+04 antikor***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Tablo 1'den hesaplanmıştır</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**0.3 mg'daki antikor sayısı, BSA testinden aldığımız antikor sayısının (0.3 mg) Y-şekilli IgG antikorlarının ortalama moleküler ağırlığına (180 kDa = 3E-16 mg) bölünmesiyle hesaplandı.</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Y-şekilli IgG antikorlarının bir molekülünün (~23 nm2) yüzey alanına ve bir KB'nin (~2.6E+05 nm2) yüzey alanına bağlı olarak, KB üzerinde bir tek tabaka oluşturmak için yaklaşık 1E+04 antikoru yeterli olacaktır. Bizim olgumuzda antikor yoğunluğu beklenen miktardan iki kat daha fazlaydı. Bu, antikorların yüksek bağlanmasına izin veren daha fazla kol sağlayan APTES kaplaması ile ilgili olabilir. Bu durum, KB'nin antikorlarla tamamen kaplanmasını sağlar ve KB'lerin yöneliminden bağımsız olarak antikorun bir hücre yüzeyi antijenine bağlanma olasılığı yüksek olacaktır. Bununla birlikte, antikor yoğunluğu beklenen sayıdan (1E+04 antikor molekülü) düşükse, hücre ile NW'ler arasındaki bağlanma şansı daha düşük olacaktır.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Nanotel üzerindeki antikor sayısının hesaplanması.

Bu çalışmada, manyetik nanomalzemeleri spesifik hücre hedeflemesi için antikorlarla biyofonksiyonelleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Örnek olarak, kanser hücrelerini hedeflemek için demir nanoteller kullanıyoruz.

Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Bu protokolün temel özelliği, çok çeşitli demir-demir oksit nanomalzemelerine uygulanabilmesidir. Ayrıca, demir-altın nanoteller gibi çok segmentli nanomalzemeler üzerine de uygulanabilir. Bu protokol herhangi bir standart biyolojik laboratuvarda güvenle gerçekleştirilebilir.Bu biyoişlevselleştirme tekniğinin ana avantajları, nanotel ve antikorlar arasındaki güçlü bir kovalent bağa dayalı olarak özel olarak hedeflenmiş bir nanomalzeme üretme yeteneğidir. Alüminyum diskleri tek kenarlı bir bıçak ve küçük bir çekiçle küçük parçalar halinde keserek başlayın. Kesilen parçaları iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüm alüminyum parçalarının kaplandığından emin olarak bir mililitre bir molar sodyum hidroksit ile doldurun.Tüpü oda sıcaklığında kimyasal çeker ocakta 30 dakika bekletin. İnkübasyondan sonra, alüminyum parçaları bir cımbızla çıkarın ve salınan nanotelleri 30 dakika daha sodyum hidroksit içinde tutun. Tüpü manyetik kuru bir rafa yerleştirin, iki dakika bekleyin ve çözeltiyi taze sodyum hidroksit ile değiştirin.İki mililitrelik tüpü nanotellerle 30 saniye boyunca sonikasyon yapın ve kimyasal bir davlumbaz içinde bir saat bekletin. Bu adımı en az dört kez tekrarlayın. Bittiğinde, iki mililitrelik tüpü manyetik rafa yerleştirin, sodyum hidroksiti atın ve bir mililitre mutlak etanol ile değiştirin.Nanotelleri 30 saniye boyunca sonikleştirin, tüpü manyetik rafa yerleştirin ve etanolü değiştirin. Etanol yıkamayı en az dört kez tekrarlayın. Nanotelleri yıkadıktan sonra, bir mililitrelik bir pipetle beş mililitrelik bir cam tüpe aktarın.Nanotel çözeltisine 100 mikrolitre APTES ekleyin ve cam tüpü 20 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü ultrasonik bir banyoya yerleştirin ve bir saat boyunca sonikleştirin. Daha sonra tüpü banyodan çıkarın ve 400 mikrolitre deiyonize su ve 20 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin.Bir saatlik sonikasyonu tekrarlayın. Cam tüpü ultrasonik banyodan çıkardıktan sonra, nanotelleri toplamak için bir mıknatısın yanına yerleştirin. Süpernatanı bir mililitre taze mutlak etanol ile değiştirin ve tüpü 10 saniye boyunca sonikleştirin.Etanol yıkama ve sonikasyonu iki kez tekrarlayın. İki mililitrelik bir tüpte 0.4 miligram EDC ve 1.1 miligram Sulfo-NHS ve bir mililitre MES çözün. Başka bir iki mililitrelik tüpte, 960 mikrolitre 0.1 molar PBS ekleyin ve buna 30 mikrolitre anti-CD44 antikoru ekleyin.Daha sonra, önceden hazırlanmış EDC / Sulfo-NHS karışımından 10 mikrolitre bu tüpe ekleyin. Antikor tüpünü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10 kez G'de çalkalayın. Bu arada, APTES kaplı nanotellerin bulunduğu tüpün yanına iki dakika boyunca bir mıknatıs yerleştirin, etanolü atın ve PBS ile değiştirin.Nanotelleri 10 saniye boyunca sonikleştirin. PBS ile son yıkamadan sonra, nanotelleri toplayın ve aktive edilmiş antikor çözeltisini nanotellerin tüpüne aktarın. Sonra 10 saniye boyunca sonikleştirin.Döndürücüdeki tüpü gece boyunca dört santigrat derecede değiştirin. Ertesi gün, nanotelleri mıknatısla toplayın ve süpernatanı atın. Bir mililitre% 2 BSA ekleyin ve reaksiyonu engellemek için tüpü dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.Elektron enerji kaybı spektroskopisi veya EELS haritaları, nanotel yüzeyindeki silikon atomlarını görselleştirmek ve APTES kaplamasının varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Kaplanmamış nanotellerde, demir atomları koyu mavi görünür ve demir ve oksijen karışımı atomlar açık mavidir. Kaplanmamış nanotellerin karşılık gelen EELS haritalaması, merkezdeki oksijene karşı yüzeyden daha yüksek bir demir yoğunluğu gösterir ve bu da bir demir-demir oksit yapısını gösterir.Haritalama, demir oksit tabakasının demir(III)oksitten daha fazla demir(II, III)oksit içerdiğini gösterdi. Bağlı antikorların antijenitesi, immünopresipitasyon ve western blot testleri kullanılarak doğrulandı. BCA testi, nanotellerdeki antikorların sayısını ölçmek için kullanıldı.Yüzey fonksiyonelleşmesini aydınlatmak için zeta potansiyelinin ölçümü kullanıldı. APTES üzerindeki terminal amin grubu, kaplanmamış nanotellere kıyasla negatif yükü azalttı. Antikor işlevselleştirmesi yükü daha da azalttı.Antikorla işlevselleştirilmiş nanotellerin spesifik hücre hedeflemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulandı. Şekil A ve B, sırasıyla numune C ve D'nin parlak alan mikroskobu görüntülerini temsil eder. Kırmızı renk, hücre zarının tasvirine karşılık gelir, mavi çekirdeği temsil eder ve yeşil kümeler, bağlı, hedeflenmiş CD44 nanotellerin varlığını gösterir.Ayrıca, hücre canlılığı testi, kaplanmamış, APTES kaplı ve antikor kaplı nanotellerin biyouyumlu olduğunu doğrulamak için kullanıldı. APTES proses kaplamasında, APTES molekülü ile nanoteller arasındaki bağı güçlendirmek için deiyonize suyun sodyum hidroksit çözeltisinden önce eklenmesi çok önemlidir. Ayrıca, biyofonksiyonelleştirme işlemi sırasında, antikor ve nanoteller arasındaki kovalent bağı arttırmak için nanotelin PBS tamponu ile birkaç kez yıkanması gerekir.

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, biz güçlü bir manyetik an ve güçlü yakın kızılötesi (NIR) absorbanslı manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için bir protokol açıklar. Protokol moleküler özgü hedeflenmesini gerektiren çeşitli biyomedikal uygulamalar için Fc kısmının yoluyla nanopartiküllere antikor konjugasyonu içerir.

Immunotargeted sentezi Magneto-plasmonik nanoklastırlar

Bu protokol, biyoişlevselleştirilmiş Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezini ve bunların multimodal, moleküler görüntüleme ajanları olarak kullanımlarını açıklar. Nanopartiküller, nanopartikül çekirdeği içindeki gadolinyum veya manganez iyonlarının MRI kontrastı oluşturduğu bir çekirdek kabuk tasarımına sahiptir. Biyofonksiyonel kabuk, floresan görüntüleme için floroforlar ve moleküler hedefleme için hedefleme ligandları içerir.

Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

Burada, hasarlı kan damarı rekonstrüksiyonundaki uygulamalar için bakteriyel nanoselülozu (BNC) manyetik hale getirmek için bir protokol sunuyoruz. BNC, G. xylinus suşu ile sentezlendi. Öte yandan, BNC'nin manyetizasyonu, BNC ağı içinde Fe2+ ve Fe3+ demir iyonlarının yerinde çökeltilmesi yoluyla gerçekleştirildi.

Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

Hedeflenen hücre iletimi, çeşitli biyomedikal uygulamalarda yararlıdır.  Bu protokolün amacı, hücreleri etiketlemek için süperparamanyetik demir oksit nanopartikülleri (SPION) kullanmak ve böylece hücre iletimi ve lokalizasyonu üzerinde yüksek derecede kontrol için manyetik hücre hedefleme yaklaşımlarını mümkün kılmaktır.

Hücre Etiketleme ve Süperparamanyetik Demir Oksit Nanopartiküller ile Hedefleme

Kobalt katkılı manyetoferritinin sentezi ve katyizasyonu için bir protokolün yanı sıra kök hücreleri katyonlaştırılmış manyetoferritin ile hızlı bir şekilde manyetize etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu çalışma manyetik nano tanecikleri hazırlanması için protokolleri açıklar, SiO ile kaplama2, ile amin fonksiyonelleştirme takip (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ve bir bağlayıcı olarak bir süksinyl moiety kullanarak deferoksamin ile çekimi. Derin bir yapısal karakterizasyon açıklaması ve tüm ara nano tanecikleri ve son konjuge için Y. enterocolitica kullanılarak yakalanan bakteri tahlilleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

İşlevselleştirilmiş Manyetik Nano partiküllerin sentezi, Siderofor Feroksamin ile Konjugasyonu ve Bakteri Tespiti Için Değerlendirilmesi

Demir oksit nanopartiküller, zararsız bir sol jel prosedürü ile sentezlenir ve anionik kısa moleküller veya polimer ile kaplanır. İnsan kök hücrelerinin içindeki manyetik nanopartiküllerin birleştirilmesi ve biyotransformasyonlarını izlemek için manyetometri kullanımı titreşimli bir örnek manyetometre (VSM) kullanılarak gösterilmiştir.

Hücresel Kuruluş ve Daha Sonra Kimyasal Synthetized Demir Oksit Nanopartiküllerinin Biyobozunurluğunu İzlemek için ManyetometriNin Kullanılması

Bu çalışma, nöronal organizasyonun kontrolü için yerel manyetik kuvvetlerin mühendisliğine aşağıdan yukarıya bir yaklaşım sunun. Manyetik nanopartiküllerle (MNP) yüklenen nöron benzeri hücreler, dik manyetizasyonlu mikro desenli bir platform tarafından kaplanır ve kontrol edilir. Ayrıca manyetik karakterizasyon, MNP hücresel alım, hücre canlılığı ve istatistiksel analiz açıklanmaktadır.

Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı

Manganez ferrit kümelerinin (MFC' ler) malzeme boyutu ve bileşimi üzerinde bağımsız kontrol sağlayan tek potalı hidrotermal sentezini rapor ediyoruz. Manyetik ayırma hızlı saflaştırma sağlarken, sülfonated polimerler kullanılarak yüzey fonksiyonelleştirme, malzemelerin biyolojik olarak ilgili ortamda toplanmamasını sağlar. Elde edilen ürünler biyomedikal uygulamalar için iyi konumlandırılmıştır.

Ayarlanabilir Nano ölçekli Boyut ve Bileşime Sahip Manganez Ferrit Kümelerinin Kararlı Sulu Süspansiyonları

Keşfedin demir nanotellerin antikorlarla biyofonksiyonelleştirilmesi protokolünü ve kanser hücrelerine özgü hedefleme yöntemini. Bu teknik, hedefe yönelik ilaç taşıma sistemleri için biyouyumlu nanomalzemeler geliştirmeyi sağlar.

Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet