Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bu videoda gösterilen protokoller dünyadaki herhangi bir laboratuvarda çoğaltılabilir. Kombinasyon halinde, bakteriyel flagellum motilitesini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil ederler. Motilite, bakteri yayılımı ve hayatta kalmasının çok önemli bir yönüdür ve bu üç yöntem, hem bireysel hem de kolektif motilitenin analizi için yararlı ve güçlü araçlardır.

Burada açıklanan teknikler, doğada patojenik olarak sınıflandırılanlar da dahil olmak üzere bir dizi bakteriyi incelemek için kolayca uygulanabilir. Bu prosedürü ilk kez denerken, sürü plakaları yanlış hazırlanırsa, kolektif hareketi taklit eden ancak gerçekten yansıtmayan tutarsız davranış veya kalıpların gözlemlenebileceğini unutmayın. Yatay çalkalama ile 30 santigrat derecede beş mililitre Lennox suyunda istenen motilite eksikliği olan suşun gece boyunca kültürlerini büyütün, daha sonra aynı koşullar altında taze LB'de üstel faza kadar alt kültür oluşturun.

Kültürün altı mikrolitresini yumuşak bir agar plakasının ortasına aşılayın ve içeriği nazikçe dışarı atmak için yüklenen pipet ucunu agarın içine itin. Plakayı, aşılama noktasından veya motilite halkalarının çevresinden yayılan motilite parlamaları belirginleşene kadar 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri parlama bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri saflaştırmak için bunları bir LB sert agar plakasına sürün.

İzole edilmiş baskılayıcı mutantların motiliteyi geri kazandığını doğrulamak için, ilgilenilen suşlar için onları yumuşak agar plakaları üzerinde kültürleyin. Karşılaştırma için vahşi tip ve başlangıç motilite eksikliği olan suşu dahil edin. Kültür plakalarını sekiz ila 10 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, izolatlardan hangisinin motiliteyi büyük ölçüde geri kazandığını belirlemek için en dıştaki halkanın çapını kaydedin.

İlgilenilen suşun üstel faz kültürünü hazırlayın. Daha sonra, üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleme ile 10 mililitre hücreyi peletleyin ve bunları 10 mililitre filtreyle sterilize edilmiş motilite tamponu veya MB içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri MB'de iki kez daha yıkayın ve son santrifüjlemeden sonra bir mililitre MB'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir mililitrelik şırıngaya aktarın ve ucuna 23 gauge bir iğne takın.

Aynı şırınga ve iğne aparatını monte edin ve ikisini, her bir iğne ucunun üzerine sıkıca kaplanmış altı inçlik polietilen boru ile birbirine takın. Hücre süspansiyonunu bir şırıngadan diğerine 50 kez nazikçe ileri geri geçirerek, her 10 geçiş arasında bir dakikalık duraklamalarla flagella'yı kesin. Daha sonra, kesilmiş hücreleri üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin ve 500 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin MB.To bir hücre sabitleme odası hazırlayın, çift taraflı bantla ayrılmış bir cam mikroskop lamı üzerine 18 x 18 milimetrelik bir kapak kızağı istifleyin.

Yıkamak için haznenin üstüne %0.01 polilisin çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi hazneden çekmek için alt kenarı bir görev mendilinin üzerine eğin, ardından 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Hazneyi 40 mikrolitre MB ile üç kez yıkayın ve haznenin üstüne 40 mikrolitre kesilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücrelerin 10 dakika boyunca kapak kızağına yapışmasına izin verin, ardından bağlanmamış hücreleri çıkarmak için hazneyi 40 mikrolitre MB ile hafifçe yıkayın. Slaytı mikroskop aşamasına aktarın ve yerine sabitlenmiş ve tek bir eksen üzerinde dönen hücreler için popülasyonu taramak için faz kontrast mikroskobu ve 100X objektif kullanın. Mikroskop yazılımını açın, hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika boyunca kaydetmek için video alımına başlayın.

Video oynatmadan, dakikadaki tam dönüş sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını ölçün. Orta üstel bir kültürün altı mikrolitresini agarın üstünde tespit ederek aşılayın. Kapağı beş ila 10 dakika kapalı bırakın ve aşı agar yüzeyine kuruduğunda değiştirin.

Daha sonra plakayı sekiz saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Çift bölmeli bir petri kabının sağ haznesine yaklaşık 30 mililitre sürü agar dökün, hazneler arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olduğundan, ancak sola taşmadığından emin olun. Agar sertleştikten sonra, sol hazneyi yaklaşık 30 mililitre yüzme veya sürü agar ile doldurun.

Sertleşmeden önce, agarı nazikçe sınırın üzerinden sürmek için steril bir pipet ucu kullanın ve iki tarafı, bölmenin tüm uzunluğu boyunca uzanan bir milimetre yüksekliğinde bir agar köprüsü ile birleştirin. Plakanın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Agarı dökerken derinliğine dikkat edin.

Çok yüksekse taşar. Çok düşükse, iki oda arasında köprü kuramazsınız. Bu protokol, bozulmuş motiliteye sahip bir çift mutant E.coli suşunda yalancı revertant fişekleri izole etmek için kullanıldı.

Bu geri döndürücülerden biri, vahşi tipe yakın hareketlilik gösterdi. Kontrol olarak çift mutant ebeveyn ve izojenik vahşi tip suş kullanıldı. Video çekimleri, dakikadaki dönüşleri ve motorların saat yönünde döndüğü sürenin kesirini veya yuvarlanma sapmasını hesaplamak için analiz edildi.

YhjH mutantı, beklendiği gibi vahşi tip E.coli'ye kıyasla dakikada birkaç dönüş ve daha düşük bir takla yanlılığı gösterdi. Hem çift mutant hem de baskılayıcısı, vahşi tipe benzer motor davranış gösterdi. Sınır geçiş testi, vahşi tip ve baskılayıcı izolatın sürü oluşturma yeteneklerini karşılaştırmak ve daha sonra sınır boyunca hareket etmek ve kanamisin ile takviye edilmiş agar üzerinde sürü halinde hareket etmek için kullanıldı.

Her iki suş da aynı aşılama noktasından benzer kaynama oranları gösterdi, ancak sürünün antibiyotik odasına geçişi, vahşi tip için baskılayıcıdan sürekli olarak daha büyüktü. İki suş arasındaki fark, daha yüksek kanamisin konsantrasyonlarında daha belirgindi. Sürü tahlillerinin kurulumu zor olabilir.

Ortam hazırlama sırasında laboratuvar koşullarının yanı sıra, ilgilendiğiniz bakterilere uyacak şekilde çizim koşullarını optimize etmek için biraz zaman harcamanız gerekebilir. Bu protokoldeki teknikler bir dizi kamçılı bakteriye uygulanmıştır ve muhtemelen çok sayıda denenmemiş türe uygulanabilir.