Name: Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia colide Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin bakteri hareketliliğini incelemek için üç yerleşik teknik kullanarak Escherichia coli'de flagella odaklı hareketliliği. Bu yöntemler bireysel ve kolektif hareketlilik analizinde güçlü araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri gm118085 ve kısmen Robert Welch Vakfı (R.M.H.'ye F-1811 hibesi) tarafından desteklendi.

1. Hareketlilik eksikliği olan suşlarda baskılayıcı mutantların izolasyonu
NOT: Hareketlilik kusurunun genel doğasını tanımlamak için bu yöntemi geniş bir 'catch-all' olarak kullanın.
<ol><li>Yumuşak-agar plaka hazırlığı NOT: Yumuşak-agar, motility- veya yüzme-agar olarak da adlandırılır, düşük yüzdeli bir agardır (~0.2-0.35% w / v), uzun zamandır kemotaksi31,32'yi test etmek için kullanılır.<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 3 g bacto-agar (%0,3 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O (çift damıtılmış su) ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki çubuk/ plakayı kullanarak hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Sıcaklık yaklaşık 50 ° C'ye ulaştığında, steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve erimiş agarın 16 saat içinde kullanılmak üzere en az 1 saat boyunca kapakla ayarlanabilmesini sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Baskılayıcı mutantların kültür hazırlığı, aşılanması ve izolasyonu NOT: Yumuşak agar ile katılaşmış besin zengini medyanın merkezinde aşılanan E. coli, besinleri yerel olarak tüketerek takip ettikleri bir besin gradyanı oluşturur. Dışa doğru ilerledikçe, bakterilerin yanıt verdiği belirli kemoattantlarla ilişkili tanımlanmış 'halkalar' ortaya çıkar (Şekil 1A). Kemotaksi sistemindeki veya flagella motorunun yapısal bileşenlerindeki kusurlar bu testte performansı tehlikeye atabilir. Genellikle, hareketlilik avantajı olan mutantlar tarama sırasında ortaya çıkar ve halkanın çevresi boyunca tek veya birden fazla noktadan, 'alevlendikleri' yerden ortaya çıktığı görülebilir (Şekil 1C). Yüzme cephesinin en dış kenarının, kavunlanmamış bakire yumuşak agar'a karşı kolayca zıt olduğunu fark edecektir.<ol>
<li>Yatay sallama (220 r.p.m.) ile 30 °C'de 5 mL Lennox Suyunda (LB; 10 g/L tripto, 5 g/L maya özü ve 5 g/L NaCl, Malzeme Masası)istenen hareketlilik eksikliği olan suşun geceleme kültürlerini büyütün. Ertesi gün, taze LB'de alt kültür (1:100 seyreltme), üstel faza aynı koşullar altında büyür(OD 600 / 0.6).</li>
		<li>Kültürün 6 μL'sini pipet kullanarak yumuşak bir agar plakasının (1.1) ortasına aşılayın, yüklü steril ucu içeriği hafifçe dışarı çıkarmak için ağar içine itin. 30 °C'ye aktarın ve kuluçkaya yatırın (Şekil 1B), hareketlilik 'parlamaları' belirgin olana kadar, aşılama noktasından veya hareketlilik halkalarının çevresinden, tipik olarak 24-36 saat(Şekil 1C)olarak yayılana kadar. NOT: Hareketlilik tahlillerinde, karşılaştırma için mutant izolelerinin yanında vahşi tip bir suşu aşılar. Bu vahşi tip suş karakteristik eşmerkezli kemotaktik halkaları gösterecektir (Şekil 1A) ve plakayı 8-10 saat içinde dolduracaktır.</li>
		<li>Hücreleri 'parlama' bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri bir LB sert agar plakasına arındırmak için çizgi kullanın (LB yukarıdaki gibi hazırlanmış, 15 g/L bacto-agar ile katılaştırılmış).</li>
		<li>Steril bir tel halkası kullanarak çizgi plakasından tek kolonileri seçin ve 'saf' bir koloni izolesinin izolasyonu için tek koloniler için çizgi çizerek yeniden arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bastırıcı mutantların onaylanması ve karakterizasyonu
	<ol>
<li>İzole bastırılmış mutantların hareketliliği geri yüklediğini onaylayın. Yumuşak agar plakaları (1.1) ve kültürleri, vahşi tip ve karşılaştırma için başlangıç 'hareketlilik eksikliği' suşu da dahil olmak üzere ilgi suşları (1.2.1'de olduğu gibi) için hazırlayın.</li>
		<li>Plakaları aşılayın (1.2.2'de olduğu gibi) ve 8-10 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>En dıştaki halkanın çapını (dairenin kenarı) kaydedin ve hangi izolelerin hareketliliği önemli ölçüde geri yüklediğini belirlemek için karşılaştırın. NOT: Plakaların deneyin zaman dilimi boyunca fotoğraf edilmesi önerilir. En iyi sonuçlar için, yüzme kolonisinin çapını ölçmek ve sömürgeleştirilmemiş agardan ayırt etmek için daha iyi aydınlatma için bir ışık kaynağının üzerine dijital kamera monte edildiği bir "ışık kovası" cihazı30kullanın.</li>
		<li>Denek, WGS'ye gerektiği gibi izole edilerek, vahşi tip fonksiyonu geri getiren mutasyonları pozitif olarak tanımlamak için yeterli 'sıra kapsamı' sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Flagella motor davranışını hücre bağlama ile ölçme
NOT: Normal çalıştırma-takla davranışı (kemotaksi) tehlikeye atılmış gibi göründüğünde bu yöntemi kullanın.
<ol><li>
Kültür hazırlama ve flagella makaslama
	<ol>
<li>Adım 1.2.1'de açıklandığı gibi, ilgi gerginliğinin üstel bir faz kültürünü hazırlayın.</li>
		<li>Pellet 10 mL hücre, 10 mL filtre sterilize Motility Buffer (MB) ile yeniden canlandırmadan önce 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleme ile hücre; 10 mM potasyum fosfat tamponu [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOT: MB hareketliliğidestekler, ancak bakteri üremeyi desteklemez</li>
		<li>Son peletin 1 mL MB olarak yeniden sünülene kadar 2.1.2 adımını iki kez daha yineleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 1 mL şırıngaya aktarın ve sonuna 23G iğne takın. Aynı şırınga/iğne aparatını monte edin ve ikisini her iğne ucuna sıkıca sarılmış 6 inç polietilen boru (iç çapı 0,58 mm) ile birbirine takın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu bir şırıngandan diğerine 50x'e hafifçe geçirerek flagellayı kesin (kırılgandırlar ve kolayca kırılırlar) ve her 10 geçiş arasında 1 dakika duraklama olur.</li>
		<li>Yamulmuş hücreleri 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj edin ve 500 μL MB'lık son hacimde yeniden biriktirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slayt hazırlama ve hücre bağlama
	<ol>
<li>Çift taraflı bantla ayrılmış 3 inç x 1 inç x 1 mm cam mikroskop kaydırağı üzerine 18 mm x 18 mm kapak örtüsü istifleyerek bir hücre sabitleme odası hazırlayın (Şekil S1).</li>
		<li>Haznenin üstüne uygulayarak hazneyi %0,01 (w/v) polilizin çözeltisi ile yıkayın. Çözeltinin hazneden(Şekil S1)çiz çekilmesine yardımcı olmak için alt kenarı (kapak altlığı mikroskop kaydırağıyla yıkama) bir görev silecekine (kağıt mendil) eğin. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>2.2.2 adımında açıklandığı gibi 40 μL MB ile hazneyi üç kez yıkayın</li>
		<li>Odanın üstüne 40 μL yamluk hücre süspansiyonu ekleyin (yukarıda hazırlanmıştır) ve hücrelerin kapak kapağına takılmasını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Eklenmemiş hücreleri çıkarmak için hazneyi 2.2.3'te olduğu gibi 40 μL MB ile hafifçe yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre dönüşü kaydı ve nicelleştirme
	<ol>
<li>Bağlı hücrelerle yüklenen mikroskop kaydırağı mikroskop aşamasına aktarın.</li>
		<li>Faz kontrastlı mikroskopi ve 100x hedefi kullanarak, popülasyonu yerinde sabitlenmiş hücreler için tarayın ve tek bir eksende döndürün, yani hücrenin odak içinde ve dışında hareket ettiği bir açıda sunmak yerine sabit bir noktada düzgün dönüşler (Video 1).</li>
		<li>Ticari bir mikroskop ve ilişkili kamera kullanın. İlişkili yazılımı açın, ilgi çekici hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika (saniyede 10 kare veya daha yüksek) kaydetmek için video alımını tıklayın.</li>
		<li>Video oynatmadan, dakikadaki tam döndürme sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını (anahtarlama sıklığı) ölçün. NOT: Dönme hızları ve anahtarlama frekansı gözle ölçülemeyecek kadar hızlı olabilir, bu nedenle yavaş / ince oynatma sunan veya dönme modellerini ölçmek için otomatik bir yazılım sistemi benimseyen video yazılımı kullanılması önerilir33. Bir alternatif, daha hızlı bakterilerin dönüşünü yavaşlatmaya ve çözmeye yardımcı olmak veya düşük kare hızlarına sahip kameralar kullanımda olduğunda telafi etmek için metil selüloz (veya benzeri bir ajan) kullanarak MB'nin viskozitesini artırmak olacaktır.</li>
		<li>İlgi popülasyonunun bir temsilini derlemek için biyolojik çoğaltmalarla 2.3.2 adımını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sınır kapısında sürülerin hazırlanması
NOT: Bir mutasyonun veya durumun grup hareketliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için bu yöntemi kullanın. Swarm-agar, yüzdenin genellikle yumuşak agardan daha yüksek olduğu agarı ifade eder. Yumuşak agarda (%0.3), hücreler agarın içinde ayrı ayrı yüzer. Sürü agarında (%0,5 ve üzeri), hücreler yüzeyde bir grup olarak hareket eder. Sürü plakalarının burada ayrıntılı olarak kullanılması gerekirken, yüzme plakaları daha uzun raf ömrüne sahiptir ve birkaç gün kullanılabilir. Kişisel tercihimiz 1-2 gün içinde kullanmaktır.
<ol><li>
Sürü agar hazırlanması
	<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 5 g Eiken agar (%0,5 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki gibi çubuğu / plakayı kullanarak hava kabarcıklarını önlemek için hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Yaklaşık 50 °C olduğunda, % 0,5'lik son konsantrasyon için filtre sterilize edilmiş glikoz ekleyin.</li>
		<li>Steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve oda sıcaklığında en az 14 saat ve en fazla 20 saat ayarlayın. İleride kullanmak üzere saklamayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sürü plakalarının aşılanması ve inkübasyonu
	<ol>
<li>Asgarın üzerine tespit larak orta üssel bir kültürün (1.2'de olduğu gibi hazırlanan) 6 μL'yi aşıla.</li>
		<li>Kapağı 5-10 dakika bekletin ve inoculum agar yüzeyine kuruduğu zaman değiştirin.</li>
		<li>8 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın. Agarın kurumasına katkıda bulunacağı ve kaynamayı bozacağı için kapağı çıkararak sürü ilerlemesini inceleme cazibesinden kaçının. NOT: Kuluçka süresi gerinim fenotipine bağlı olarak değişebilir. Bazı izole mutasyonlar kaynama yeteneğini engelleyebilir ve daha az agar yüzdesi veya daha uzun bir kuluçka süresi gerektirecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sınır geçişi tahlil plakalarının hazırlanması NOT: Bu tahlil, plastik bir bölmenin (kenarlık) bir yerine iki odacık oluşturduğu modifiye edilmiş bir Petri kabı kullanır (Şekil 2A). Her oda diğer odadan bağımsız olarak hazırlanabilir ve ikisini 'bağlamadan' önce kaynama için farklı koşullar sunar. Deneysel tasarıma bağlı olarak, ilk oda (solda belirtilen) yüzme agarı (%0,3 w/v) veya sürü agar (%0,5 w/v) ile hazırlanabilir, burada bakteriler sınır boyunca sürü agar +/- gerekli herhangi bir takviye veya zorluk (örneğin, antibiyotikler) içeren sağ odaya göç edebilir. Her iki agar üzerindeki göç tipik olarak, orijinal aşılama noktasından en geniş bakteri kolonizasyonu çapı (kenardan kenara) kaydedilerek ölçülür/karşılaştırılır.<ol>
<li>Gerekirse 1.1'de açıklandığı gibi yüzme agarı hazırlayın.</li>
		<li>3.1'de açıklandığı gibi sürü agar hazırlayın.</li>
		<li>Çift bölmeli petri kabının (100 mm x 15 mm) sağ odasına, odalar arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olan, ancak sola taşmayan noktaya kadar ~30 mL sürü agar (gerekirse istenen takviye ile) dökün (Şekil 2B).</li>
		<li>Agar sertleştikten sonra, sol odayı ~ 30 mL yüzme veya sürü agar ile doldurun, yine plastik bölme ile temas noktasına (Şekil 2C). Ayarlmadan önce, iki tarafı bölmenin tüm uzunluğunu kapsayan ~1 mm yüksekliğinde bir agar köprüsüne bağlamak için agar'ı yavaşça sınır boyunca sürüklemek için steril bir pipet ucu kullanın (Şekil 2D).</li>
		<li>Plakanın oda sıcaklığında (3,1) kurumasını bekleyin. NOT: Köprü oluşturmanın alternatif bir yöntemi, sol oda agarının kurumasına ve daha sonra iki oda arasında köprü oluşturmak için plastik bölücü boyunca ~100 μL erimiş sürü agarının yavaşça pipetlemesine izin vermektir (3,4). Yüzme (1.2.2) veya sürü (3.2) agar için yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmış olarak, 12-16 saat boyunca 30 ° C'de kuluçkaya yatırmadan önce veya sürüler ilgi gerginlikleri arasında karşılaştırmalara izin vermek için sağ oda üzerinde yeterli ilerleme sağlayana kadar sol odadaki plakaları aşılayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Baskılayıcı mutasyonların izolasyonu ve karakterizasyonu, kemotaksi sistemi 35,36,37'nin ve motor makinelerinin kendisinin38,39,40'ıntemel bileşenlerinin tanımlanmasına başarıyla katkıda bulunmuştur. Protokol 1'i kullanırken, hareketlilik kaybını telafi edebilecek büyük bir olası mutasyon spektrumunun izolasyonu sağlamak için birden faz...

Bakteriler ekolojik nişlerinde hareket ve dağılım için birçok uzantılar istihdam eder1. Flagella tahrikli hareketlilik bunların en hızlısıdır, çevre sinyallerine yanıt olarak elverişli yerellerin kolonileşmesini teşvik eder ve bazı türlerin patojenik yeteneğine önemli ölçüde katkıda bulunan2,3. Flagellated bakteriler toplu sıvı içinde ayrı ayrı yüzebilir veya yarı katı bir yüzey üzerinde kolektif olarak sürünebilir4. Hücre dışıflagella, dönüş1, 2 ,4,5,6,7,8'e neden olan tork oluşturmak için iyongradyanlarınıngücünden yararlanan membrana gömülü döner motorlara takılır ve tahrik edilir. Motorları sabit tork9'daçalışan E. coli'demotor çıkışı, dönme hızı ve rotorun saat yönünün tersine (CCW) ve saat yönünde (CW) yönler arasında değiştirilmesi açısından kategorize edilebilir. CCW dönüşü, hücreyi ileriye doğru iten tutarlı bir flagellar demetin oluşumunu teşvik ederken (çalıştır), dönme yönünde (CW) geçici bir anahtar, demetin kısmen veya tamamen10'usökmesine ve hücrenin yüzme yönünü yeniden yönlendirmesine (yuvarlanma) neden olur. E. coli genellikle bir saniye koşar ve saniyenin onda biri için yuvarlanır. Rotorun veya 'takla önyargısının' anahtarlama frekansı kemotaksi sinyal sistemi tarafından kontrol edilir, burada transmembran chemoreceptors harici kimyasal sinyalleri algılar ve çekicilere yanıt olarak çalıştırmaları uzatmak veya toksik kimyasallara yanıt olarak bastırmak için fosforelay ile flagellar motora iletir11,12. Yüzme hareketliliği% 0.3 yumuşak agarda test edilir.
Kaynama sırasında bakteriler, bakteri paketlerinin sürekli dönen bir hareketle aktığı yoğun bir kolektif olarak yarı katı bir yüzeyde gezinirken2,13,14,15. E. coli sürüleri, dökme sıvıda yüzen hücreler üzerinde değiştirilmiş kemosentezör fizyoloji (daha düşük yuvarlanma önyargısı), daha yüksek hızlar ve antimikrobiyallere karşı daha yüksek tolerans sergiler16,17. Swarmers, yüzey aktif madde üretimi, hiperflagellasyon ve hücre uzaması2dahil olmak üzere harekete yardımcı olan çok sayıda stratejinin dağıtımında değişir. Swarming bakterilere hem ekolojik hem de klinik ortamlarda rekabet avantajı sunar18,19,20. Kaynayan bakterilerin iki kategorisi vardır: sadece% 0.5-0.8 agar ile katılaşmış medyaya sürülebilen ılıman sürüler ve daha yüksek agar konsantrasyonlarında gezinebilen sağlam sürüler21.
Yüzme hareketliliğini ve düzenlemesini sorgulamak için çeşitli tahliller mevcuttur. Mutasyonlar veya çevresel koşullar nedeniyle bozulduğunda, hareketliliğin kendisi fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonları tanımlamak için güçlü bir seçim sunar. Bu bastırıcılar, orijinal mutasyonun gerçek geri dönüşleri veya ikinci bir mutasyonun işlevselliği geri yüklediği sözde geri dönüşler olabilir. Bu tür mutantlar tüm genom dizilimi (WGS) ile tanımlanabilir. Tarafsız baskılayıcı seçimine bir alternatif, önyargılı hedefli bir mutajensis stratejisidir (örneğin, PCR mutajensis). Bu metodolojiler genellikle hareketlilik aparatının işlevine veya çevre düzenlemesine ışık tutar. Amaç motor fonksiyonu incelemekse, yumuşak agarda ölçülen vahşi tip hareketliliğin restorasyonu mutlaka vahşi tip motor çıkışının restorasyonunu göstermeyebilir. Hücrelerin tek bir flagellum tarafından cam yüzeye tutturulduğu ve hücre gövdesinin dönüşünün daha sonra izlendiği hücre bağlama tahlili, motor davranışı değerlendirmek için tercih edilen ilk test olabilir. Motor özelliklerini izlemek için artık daha sofistike metodolojiler mevcut olsa da, hareket analizi için gerekli yüksek hızlı kamera kurulumu ve yazılım paketlerinin uygulanması yaygın kullanımlarını sınırlar22,23,24,25. Hücre bağlama tahlili sadece flagellanın yamumasını gerektirir, bu da kısa filamentlerin cam bir slayda bağlanmasına izin verir ve ardından hücre gövdesinin dönüşünü videoya ekler. Kaydedilen motor hızları, hücre gövdesinin flagellum üzerinde uyguladığı yüksek yük nedeniyle bu testte düşük olsa da, bu test yine de kemotaktik yanıtlar26 , 27,28,29hakkında değerli içgörülere katkıda bulunmuştur ve aşağıda tartışıldığı gibi geçerli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir.
Kaynayan hareketlilik araştırmacılar için farklı zorluklar doğurur. fonksiyon kazancı bastırıcıların seçimi sadece bol miktarda yüzey aktif madde üreten ve kolayca sürü13. E. coli gibi yüzey aktif olmayan üreticiler, agar seçimi, medya bileşimi ve ortamın nemi ile ilgili titizdir2,13,14,21. Kaynama koşulları belirlendikten sonra, sınır geçişi tahlil17, bir sürünün yeni / zorlu koşullarda gezinme yeteneğini sorgulamak için yararlı bir metodolojidir. Aşağıda sunulan protokoller E. coliile ilgili olsa da, diğer türlerde uygulama için kolayca uyarlanabilirler.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bacto Susuz Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodyum Tuzu, Dihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japonya</td><td>E-MJ00</td><td>E. coli kaynaşması için gerekli</td></tr><tr><td>Glikoz D (+)</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (Lennox) Et Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin Çözeltisi (% 0.1)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat monobazik (KH2PO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat dibazik (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzeme ve Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense mikroskop görüntüleme yazılımı (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Veya mikroskop için eşdeğer yazılım kullanılan</td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri Scotch 666 Çift Taraflı Bant</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu mikroskop slaytları 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Herhangi bir dik veya ters faz mikroskobu kullanılabilir</td></tr><tr><td>Petri kapları (100 mm çap)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Yumuşak agar tahlilleri için</td></tr><tr><td>Polietilen Nebulizatör Kılcal Boru (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>9908265</tr><tr><td>2 Bölmeli Yuvarlak Petri Kabı</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>Sınır geçiş tahlilleri için</td></tr><tr><td>Güvenlik Hipodermik İğneler (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Steril Şırınga - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Görev/Doku mendilleri</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Veya eşdeğer tek kullanımlık mendiller</td></tr><tr><td>VWR mikro kapaklı cam 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 kamera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Veya eşdeğeri mikroskop kamera</td></tr></tbody></table>

bir seride Üç yerleşik teknik uygulayarak escherichia coli'de flagella odaklı hareketliliği araştırmak

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Hareketlilik birçok bakteri türünün hayatta kalması ve başarısı için çok önemlidir. Sinyal yollarını anlamak, flagellar parçaların işlevini ve montajını aydınlatmak ve hareket kalıplarını incelemek ve anlamak için hareketlilik yararlanmak için birçok metodoloji vardır. Burada bu metodolojilerden üçünün bir kombinasyonunu gösteriyoruz. Yumuşak agardaki hareketlilik en eskidir ve hareketliliğin ikinci bir mutasyonla geri yüklendiği hareketlilik bozulmuş suşlarda fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonlarını izole etmek için güçlü bir seçim sunar. İlk olarak flagellar motorun döner doğasını göstermek için kullanılan hücre bağlama tekniği, sinyal efektörlerinin motor hızı üzerindeki etkisini ve dönme yönünü değiştirme yeteneğini değerlendirmek için kullanılabilir. "Sınır geçişi" tahlilleri, yüzme bakterisinin topluca sürü olarak hareket etmeye geçiş için astarlanabileceği daha yenidir. Birlikte, bu protokoller hareketlilik makinelerinin bileşenlerini tanımlamak ve yüzme ve kaynaşma farklı fasetlerindeki rollerini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Diğer bakteri türlerinde hareketliliği incelemek için kolayca uyarlanabilirler.

Hareketlilik sinyal molekülü c-di-GMP'nin yüksek seviyeleri tarafından bozulan bir E. coli suşundaki sözde geri dönüşlerin izolasyonu, laboratuvarımızdan yapılan son çalışmalarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır34. Bu suş (JP1442) iki mutasyon barındırır:Δ yhjH ve ΔycgR. YhjH, E. coli'dec-di-GMP'yi düşüren en aktif fosfodiesterazdır. YhjH'nin yokluğu c-di-GMP seviyelerinin yükselmesine ve hareketliliğin inhibisyona yol açar. YcgR bir c-di-GMP efektörüdür. C-di-GMP...

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Bu videoda gösterilen protokoller dünyadaki herhangi bir laboratuvarda çoğaltılabilir. Kombinasyon halinde, bakteriyel flagellum motilitesini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil ederler. Motilite, bakteri yayılımı ve hayatta kalmasının çok önemli bir yönüdür ve bu üç yöntem, hem bireysel hem de kolektif motilitenin analizi için yararlı ve güçlü araçlardır.Burada açıklanan teknikler, doğada patojenik olarak sınıflandırılanlar da dahil olmak üzere bir dizi bakteriyi incelemek için kolayca uygulanabilir. Bu prosedürü ilk kez denerken, sürü plakaları yanlış hazırlanırsa, kolektif hareketi taklit eden ancak gerçekten yansıtmayan tutarsız davranış veya kalıpların gözlemlenebileceğini unutmayın. Yatay çalkalama ile 30 santigrat derecede beş mililitre Lennox suyunda istenen motilite eksikliği olan suşun gece boyunca kültürlerini büyütün, daha sonra aynı koşullar altında taze LB'de üstel faza kadar alt kültür oluşturun.Kültürün altı mikrolitresini yumuşak bir agar plakasının ortasına aşılayın ve içeriği nazikçe dışarı atmak için yüklenen pipet ucunu agarın içine itin. Plakayı, aşılama noktasından veya motilite halkalarının çevresinden yayılan motilite parlamaları belirginleşene kadar 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri parlama bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri saflaştırmak için bunları bir LB sert agar plakasına sürün.İzole edilmiş baskılayıcı mutantların motiliteyi geri kazandığını doğrulamak için, ilgilenilen suşlar için onları yumuşak agar plakaları üzerinde kültürleyin. Karşılaştırma için vahşi tip ve başlangıç motilite eksikliği olan suşu dahil edin. Kültür plakalarını sekiz ila 10 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, izolatlardan hangisinin motiliteyi büyük ölçüde geri kazandığını belirlemek için en dıştaki halkanın çapını kaydedin.İlgilenilen suşun üstel faz kültürünü hazırlayın. Daha sonra, üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleme ile 10 mililitre hücreyi peletleyin ve bunları 10 mililitre filtreyle sterilize edilmiş motilite tamponu veya MB içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri MB'de iki kez daha yıkayın ve son santrifüjlemeden sonra bir mililitre MB'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir mililitrelik şırıngaya aktarın ve ucuna 23 gauge bir iğne takın.Aynı şırınga ve iğne aparatını monte edin ve ikisini, her bir iğne ucunun üzerine sıkıca kaplanmış altı inçlik polietilen boru ile birbirine takın. Hücre süspansiyonunu bir şırıngadan diğerine 50 kez nazikçe ileri geri geçirerek, her 10 geçiş arasında bir dakikalık duraklamalarla flagella'yı kesin. Daha sonra, kesilmiş hücreleri üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin ve 500 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin MB.To bir hücre sabitleme odası hazırlayın, çift taraflı bantla ayrılmış bir cam mikroskop lamı üzerine 18 x 18 milimetrelik bir kapak kızağı istifleyin.Yıkamak için haznenin üstüne %0.01 polilisin çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi hazneden çekmek için alt kenarı bir görev mendilinin üzerine eğin, ardından 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Hazneyi 40 mikrolitre MB ile üç kez yıkayın ve haznenin üstüne 40 mikrolitre kesilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.Hücrelerin 10 dakika boyunca kapak kızağına yapışmasına izin verin, ardından bağlanmamış hücreleri çıkarmak için hazneyi 40 mikrolitre MB ile hafifçe yıkayın. Slaytı mikroskop aşamasına aktarın ve yerine sabitlenmiş ve tek bir eksen üzerinde dönen hücreler için popülasyonu taramak için faz kontrast mikroskobu ve 100X objektif kullanın. Mikroskop yazılımını açın, hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika boyunca kaydetmek için video alımına başlayın.Video oynatmadan, dakikadaki tam dönüş sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını ölçün. Orta üstel bir kültürün altı mikrolitresini agarın üstünde tespit ederek aşılayın. Kapağı beş ila 10 dakika kapalı bırakın ve aşı agar yüzeyine kuruduğunda değiştirin.Daha sonra plakayı sekiz saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Çift bölmeli bir petri kabının sağ haznesine yaklaşık 30 mililitre sürü agar dökün, hazneler arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olduğundan, ancak sola taşmadığından emin olun. Agar sertleştikten sonra, sol hazneyi yaklaşık 30 mililitre yüzme veya sürü agar ile doldurun.Sertleşmeden önce, agarı nazikçe sınırın üzerinden sürmek için steril bir pipet ucu kullanın ve iki tarafı, bölmenin tüm uzunluğu boyunca uzanan bir milimetre yüksekliğinde bir agar köprüsü ile birleştirin. Plakanın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Agarı dökerken derinliğine dikkat edin.Çok yüksekse taşar. Çok düşükse, iki oda arasında köprü kuramazsınız. Bu protokol, bozulmuş motiliteye sahip bir çift mutant E.coli suşunda yalancı revertant fişekleri izole etmek için kullanıldı.Bu geri döndürücülerden biri, vahşi tipe yakın hareketlilik gösterdi. Kontrol olarak çift mutant ebeveyn ve izojenik vahşi tip suş kullanıldı. Video çekimleri, dakikadaki dönüşleri ve motorların saat yönünde döndüğü sürenin kesirini veya yuvarlanma sapmasını hesaplamak için analiz edildi.YhjH mutantı, beklendiği gibi vahşi tip E.coli'ye kıyasla dakikada birkaç dönüş ve daha düşük bir takla yanlılığı gösterdi. Hem çift mutant hem de baskılayıcısı, vahşi tipe benzer motor davranış gösterdi. Sınır geçiş testi, vahşi tip ve baskılayıcı izolatın sürü oluşturma yeteneklerini karşılaştırmak ve daha sonra sınır boyunca hareket etmek ve kanamisin ile takviye edilmiş agar üzerinde sürü halinde hareket etmek için kullanıldı.Her iki suş da aynı aşılama noktasından benzer kaynama oranları gösterdi, ancak sürünün antibiyotik odasına geçişi, vahşi tip için baskılayıcıdan sürekli olarak daha büyüktü. İki suş arasındaki fark, daha yüksek kanamisin konsantrasyonlarında daha belirgindi. Sürü tahlillerinin kurulumu zor olabilir.Ortam hazırlama sırasında laboratuvar koşullarının yanı sıra, ilgilendiğiniz bakterilere uyacak şekilde çizim koşullarını optimize etmek için biraz zaman harcamanız gerekebilir. Bu protokoldeki teknikler bir dizi kamçılı bakteriye uygulanmıştır ve muhtemelen çok sayıda denenmemiş türe uygulanabilir.

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Kaynak: Morales-Soto, N. ve ark., Bakteriyel Yüzey Hareketlilik Testlerinin Hazırlanması, Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, yumuşak agar üzerinde yüzey hareketliliğini gözlemlemek için yeşil floresan proteini eksprese eden bakterileri kullanan bir oğul testini göstermektedir. Hızlandırılmış görüntüleme, koordineli genişlemeyi ve dal oluşumunu yakalayarak bakteriyel yüzey hareketliliğini vurgular.

Bakteriyel Yüzey Hareketliliğini Görselleştirmek için Oğul Verme Testi

Kaynak: Pioli, R., ve diğerleri, Sıralı Kılcallık Destekli Montaj Yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, karbonsuz bir süspansiyon ve kontrollü akış kullanarak mikroakışkan tuzaklarda tek floresan etiketli Escherichia coli (E. coli) hücrelerini yakalama yöntemini ve ardından mikrokolonilerin büyümesini ve floresan görüntülemesini tetiklemek için besin ilavesini göstermektedir.

Tek Hücreli Bakteri Büyümesinin Mikroakışkan Desenleme ve Floresan Tabanlı İzlenmesi

Kaynak: Scheidweiler, D. ve diğerleri. Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilerek Gözenekli Ortamlarda Mikrobiyal Taşınımı Mekansal Ölçeklerde İncelemek. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, rastgele düzenlenmiş sütunlardan oluşan gözenekli bir matriks aracılığıyla bakteri hareketliliğini ölçmek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Fluoresan etiketli bakteriler cihaza dahil edilir, gözenekli matriksin içinden gözlem kanalına ilerlerken mikroskopi ile...

Mikrofluidik Cihaz Kullanarak Bakteriyel Hareketliliğin Değerlendirilmesi

Sürü hareketliliği fiziksel ve çevresel faktörlerden etkilenir. Sürü tahlili hazırlama ve veri toplama ile yaygın olarak ilişkilendirilen zorlukları aşmak için iki aşamalı bir protokol ve yönergeler açıklıyoruz. Mevcut analiz tekniklerinin sağlamadığı sürü davranışı hakkında ayrıntılı bilgi elde etmek için makroskopik bir görüntüleme tekniği kullanılmaktadır.

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Son bulgular, bakteriyel kamçı motorlarının çeşitli çevresel sinyalleri algıladığını ve yanıt olarak yeniden şekillendiğini göstermektedir. Burada tartışılan boncuk tahlillerinin, çevresel stres faktörlerine hücresel adaptasyonda yeniden şekillenmenin rolünü açıklamaya yardımcı olması beklenmektedir.

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Burada, bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel motiliteyi tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin temel avantajları, değerlendirilmesi kolay ve daha doğru olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.

Bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel hareketliliğin görselleştirilmesi

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'da çeşitli motilite tiplerinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.

Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

Keşfedin bakteri hareketliliğini incelemek için üç yerleşik teknik kullanarak Escherichia coli'de flagella odaklı hareketliliği. Bu yöntemler bireysel ve kolektif hareketlilik analizinde güçlü araçlar sunar.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Daha fazla video keşfet