Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak
10 Mayıs 2020
Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.
Bu videoda gösterilen protokoller dünyadaki herhangi bir laboratuvarda çoğaltılabilir. Kombinasyon halinde, bakteriyel flagellum motilitesini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil ederler. Motilite, bakteri yayılımı ve hayatta kalmasının çok önemli bir yönüdür ve bu üç yöntem, hem bireysel hem de kolektif motilitenin analizi için yararlı ve güçlü araçlardır.
Burada açıklanan teknikler, doğada patojenik olarak sınıflandırılanlar da dahil olmak üzere bir dizi bakteriyi incelemek için kolayca uygulanabilir. Bu prosedürü ilk kez denerken, sürü plakaları yanlış hazırlanırsa, kolektif hareketi taklit eden ancak gerçekten yansıtmayan tutarsız davranış veya kalıpların gözlemlenebileceğini unutmayın. Yatay çalkalama ile 30 santigrat derecede beş mililitre Lennox suyunda istenen motilite eksikliği olan suşun gece boyunca kültürlerini büyütün, daha sonra aynı koşullar altında taze LB'de üstel faza kadar alt kültür oluşturun.
Kültürün altı mikrolitresini yumuşak bir agar plakasının ortasına aşılayın ve içeriği nazikçe dışarı atmak için yüklenen pipet ucunu agarın içine itin. Plakayı, aşılama noktasından veya motilite halkalarının çevresinden yayılan motilite parlamaları belirginleşene kadar 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri parlama bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri saflaştırmak için bunları bir LB sert agar plakasına sürün.
İzole edilmiş baskılayıcı mutantların motiliteyi geri kazandığını doğrulamak için, ilgilenilen suşlar için onları yumuşak agar plakaları üzerinde kültürleyin. Karşılaştırma için vahşi tip ve başlangıç motilite eksikliği olan suşu dahil edin. Kültür plakalarını sekiz ila 10 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, izolatlardan hangisinin motiliteyi büyük ölçüde geri kazandığını belirlemek için en dıştaki halkanın çapını kaydedin.
İlgilenilen suşun üstel faz kültürünü hazırlayın. Daha sonra, üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleme ile 10 mililitre hücreyi peletleyin ve bunları 10 mililitre filtreyle sterilize edilmiş motilite tamponu veya MB içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri MB'de iki kez daha yıkayın ve son santrifüjlemeden sonra bir mililitre MB'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir mililitrelik şırıngaya aktarın ve ucuna 23 gauge bir iğne takın.
Aynı şırınga ve iğne aparatını monte edin ve ikisini, her bir iğne ucunun üzerine sıkıca kaplanmış altı inçlik polietilen boru ile birbirine takın. Hücre süspansiyonunu bir şırıngadan diğerine 50 kez nazikçe ileri geri geçirerek, her 10 geçiş arasında bir dakikalık duraklamalarla flagella'yı kesin. Daha sonra, kesilmiş hücreleri üç dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin ve 500 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin MB.To bir hücre sabitleme odası hazırlayın, çift taraflı bantla ayrılmış bir cam mikroskop lamı üzerine 18 x 18 milimetrelik bir kapak kızağı istifleyin.
Yıkamak için haznenin üstüne %0.01 polilisin çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi hazneden çekmek için alt kenarı bir görev mendilinin üzerine eğin, ardından 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Hazneyi 40 mikrolitre MB ile üç kez yıkayın ve haznenin üstüne 40 mikrolitre kesilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
Hücrelerin 10 dakika boyunca kapak kızağına yapışmasına izin verin, ardından bağlanmamış hücreleri çıkarmak için hazneyi 40 mikrolitre MB ile hafifçe yıkayın. Slaytı mikroskop aşamasına aktarın ve yerine sabitlenmiş ve tek bir eksen üzerinde dönen hücreler için popülasyonu taramak için faz kontrast mikroskobu ve 100X objektif kullanın. Mikroskop yazılımını açın, hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika boyunca kaydetmek için video alımına başlayın.
Video oynatmadan, dakikadaki tam dönüş sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını ölçün. Orta üstel bir kültürün altı mikrolitresini agarın üstünde tespit ederek aşılayın. Kapağı beş ila 10 dakika kapalı bırakın ve aşı agar yüzeyine kuruduğunda değiştirin.
Daha sonra plakayı sekiz saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Çift bölmeli bir petri kabının sağ haznesine yaklaşık 30 mililitre sürü agar dökün, hazneler arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olduğundan, ancak sola taşmadığından emin olun. Agar sertleştikten sonra, sol hazneyi yaklaşık 30 mililitre yüzme veya sürü agar ile doldurun.
Sertleşmeden önce, agarı nazikçe sınırın üzerinden sürmek için steril bir pipet ucu kullanın ve iki tarafı, bölmenin tüm uzunluğu boyunca uzanan bir milimetre yüksekliğinde bir agar köprüsü ile birleştirin. Plakanın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Agarı dökerken derinliğine dikkat edin.
Çok yüksekse taşar. Çok düşükse, iki oda arasında köprü kuramazsınız. Bu protokol, bozulmuş motiliteye sahip bir çift mutant E.coli suşunda yalancı revertant fişekleri izole etmek için kullanıldı.
Bu geri döndürücülerden biri, vahşi tipe yakın hareketlilik gösterdi. Kontrol olarak çift mutant ebeveyn ve izojenik vahşi tip suş kullanıldı. Video çekimleri, dakikadaki dönüşleri ve motorların saat yönünde döndüğü sürenin kesirini veya yuvarlanma sapmasını hesaplamak için analiz edildi.
YhjH mutantı, beklendiği gibi vahşi tip E.coli'ye kıyasla dakikada birkaç dönüş ve daha düşük bir takla yanlılığı gösterdi. Hem çift mutant hem de baskılayıcısı, vahşi tipe benzer motor davranış gösterdi. Sınır geçiş testi, vahşi tip ve baskılayıcı izolatın sürü oluşturma yeteneklerini karşılaştırmak ve daha sonra sınır boyunca hareket etmek ve kanamisin ile takviye edilmiş agar üzerinde sürü halinde hareket etmek için kullanıldı.
Her iki suş da aynı aşılama noktasından benzer kaynama oranları gösterdi, ancak sürünün antibiyotik odasına geçişi, vahşi tip için baskılayıcıdan sürekli olarak daha büyüktü. İki suş arasındaki fark, daha yüksek kanamisin konsantrasyonlarında daha belirgindi. Sürü tahlillerinin kurulumu zor olabilir.
Ortam hazırlama sırasında laboratuvar koşullarının yanı sıra, ilgilendiğiniz bakterilere uyacak şekilde çizim koşullarını optimize etmek için biraz zaman harcamanız gerekebilir. Bu protokoldeki teknikler bir dizi kamçılı bakteriye uygulanmıştır ve muhtemelen çok sayıda denenmemiş türe uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, çevresel navigasyon ve kolonizasyonun bir yolu olarak kamçı kaynaklı harekete odaklanarak bakteriyel motiliteyi incelemektedir. Araştırma, yerleşik metodolojileri kullanarak hem bireysel hem de kolektif motilite davranışlarında yer alan temel bileşenleri ve yolakları tanımlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Bakteriyel hareketlilik
- Kamçı mekaniği
- Bakterilerde kolektif davranış
Arka Plan
- Hareketlilik, bakterilerin hayatta kalması ve yayılması için hayati önem taşır.
- Çalışma, hem bireysel hem de kolektif hareketlilik analizlerini içermektedir.
- Protokoller, patojenler dahil olmak üzere çeşitli bakterilere uygulanabilir.
Kullanılan Yöntemler
- Hareketliliğin bir seçim aracı olarak kullanılması
- Yumuşak agar plaklarının ve swarm analizlerinin kullanımı
- Hücre gözlemi için faz kontrast mikroskopisi
Ana Sonuçlar
- İzole edilen baskılayıcı mutantlarda motilitenin geri kazanıldığı görüldü.
- Yabani tip ile mutantlar arasındaki sürüm (swarming) yeteneklerinin karşılaştırılması, antibiyotiklere verilen yanıtlarda önemli farklılıklar olduğunu gösterdi.
- Nicelleştirilen motor rotasyonları, motilite paternleri hakkında bilgiler sağladı.
Sonuçlar
- Bu çalışma, bakteriyel motilitenin karakterizasyonu için çok aşamalı protokollerin etkinliğini göstermektedir.
- Bulgular, patojenik davranışın ve motilite mekaniklerinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bakteriyel hareketlilik mekanizmalarının anlaşılması, patojen virülansı ve konak kolonizasyon stratejileri hakkında kritik bilgiler sağlayarak anti-enfektif geliştirme için hedef doğrulama süreçlerini bilgilendirir. Hareketlilik deneylerinin kombine uygulaması, genetik perturbasyonları hem bireysel hem de kolektif hareketteki fonksiyonel fenotiplerle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sistematik olarak riskten arındırılmasını sağlar. Bu yaklaşım, hedef önceliklendirme ve mekanistik takipteki öngörü güvenini artıran nicel, tekrarlanabilir veriler üreterek erken keşif iş akışlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Validasyonu
- Bilimsel Değer: Motilite restorasyonunu baskılayıcı mutasyonlarla ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar, kamçı montajı ve sinyalizasyonundaki gen fonksiyonunu netleştirir.
- Operasyonel Değer: İşlev kazandıran (gain-of-function) mutantların izolasyonu için güçlü bir seçilim sistemi sunarak motilitesi bozulmuş suşlarda kompanse edici yolakların tanımlanmasını kolaylaştırır.
- Öngörücü Değer: Motilite geri kazanımını nicelendirerek fenotipik taramayı destekler, genetik modifiyelerin ve yolak etkileşimlerinin değerlendirilmesine yardımcı olur.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hücre bağlama tekniği, motor hızının ve yönsel geçişlerin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayarak, iyon akışı veya sinyal modülasyonu ile ilişkili hedefle ilgili mekanistik risklerin azaltılmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kesilmiş hücrelerin ve fiksasyon odacıklarının standartlaştırılmış hazırlığı, faz kontrast mikroskobu altında tekrarlanabilir tutunma ve görselleştirmeyi sağlar.
- Analiz Hazırlığı: Dakika başına rotasyonlar ve takla eğilimi gibi nicelendirilebilir çıktılar üreterek, tarama uygulamaları için farklı suşlar ve koşullar arasında karşılaştırmayı kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Sınır geçiş testi, bireysel motiliteyi kolektif sürümleme davranışı ile ilişkilendirerek, patojenlerin stres altında yayılmadan yüzey kolonizasyonuna nasıl geçiş yaptıklarını modeller.
- Operasyonel Değer: Antibiyotik direncinin sürüm göçü üzerindeki etkisi gibi çevresel adaptasyonların değerlendirilmesine olanak tanıyarak, translasyonel biyobelirteç ilgisi hakkında bilgi sağlar.
- Öngörü Güveni: Baskılayıcı mutasyonların sürüm-antibiyotik geçişini nasıl değiştirdiğini ortaya koyarak, preklinik ortamlarda adaptif direnç mekanizmalarını incelemek için bir model sunar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, genetik taramayı fonksiyonel motilite fenotipleriyle ilişkilendirerek erken keşif sürecine entegre olur ve hedef hit doğrulamasından, aday madde belirlemesi öncesindeki mekanistik risk azaltma aşamasına kadar olan ilerlemeyi destekler.
- Keşif Biyolojisi: Genetik değişikliklerin kamçı motor fonksiyonu ve sürü yeteneğini nasıl etkilediğini nicelendirerek hipotez testlerini destekler ve hedef doğrulamadaki belirsizliği azaltır.
- Tarama: Mutant kütüphaneleri veya kimyasal pertürbasyonlar arasında güvenilir karşılaştırmalara olanak tanıyan standartlaştırılmış, kantitatif okumalar (rotasyon hızları, yönelim yanlılığı, sürü çapı) sağlar.
- Analizler: Patojenik modellerde ekiplerin genotipi fenotipik riskle ilişkilendirmelerine yardımcı olan takla yanlılığı ve sürü genişleme hızları gibi ölçülebilir çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Bireysel motor davranışını seçici baskı altındaki kolektif hareketle ilişkilendirerek enfeksiyon dinamikleriyle ilgili fenotipik adaptasyonu modeller.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Üç teknik, kamçılı patojenler genelinde uygulanabilir modüler ve uyarlanabilir bir platform oluşturarak projeler arası standardizasyonu ve reaktif paylaşımını teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Motiliteyi motor fonksiyonu, yön değiştirme ve kolektif davranış bileşenlerine ayırarak mekanik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Yumuşak agar inokülasyonu, hücre kesme ve hazne hazırlığı için standartlaştırılmış protokoller aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlayarak laboratuvarlar arası değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonunu, virülansla ilişkili motilite özelliklerindeki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek go/no-go (devam/tamam) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hedeflerin, motilite kaynaklı yayılım ve konakçıya tutunmadaki rolleri üzerinden riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Tutarlı motilite analizleri sağlamak için bakteriyel kültür teknikleri, mikroskopi ve aseptik çalışma konularında uzmanlık gerektirir.
- Sürüme (swarm) ve yumuşak agar analizleri için faz kontrast mikroskopisine, mikromanipülasyon araçlarına ve kontrollü inkübasyon ortamlarına erişime bağlıdır.
- Sürüme sınır geçiş analizlerinde artefaktları önlemek için agar konsantrasyonunun, plak kuruma sürelerinin ve inokülasyon hacimlerinin standardize edilmesini gerektirir.
- Hücre bağlama (cell-tethering) yöntemini farklı bakteri türlerine veya mutant arka planlarına uygularken tampon bileşiminin ve kayma (shear) parametrelerinin uyarlanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, yanlış negatif veya yanıltıcı kolektif hareket okumalarını önlemek için optimize edilmesi gereken sürüme agar derinliğine ve köprüleme tekniğine olan duyarlılık yer alır.
