Name: Klamidya Trachomatiste Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Keşfedin, canlı hücre mikroskobisi ve floresan promotör-reporterler kullanarak Chlamydia trachomatis'in gelişimsel mutantlarını izole etme yöntemini. Bu ileri genetik yaklaşım, gelişim döngüsünü düzenleyen genleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Washington State Üniversitesi'nden Dr. Anders Omsland'a CIP-1 baltalı medyayı sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe R01AI130072, R21AI135691 ve R21AI113617 tarafından desteklenmiştir. Idaho Üniversitesi ve Merkezi Modelleme Karmaşık Etkileşimler için kendi NIH hibe P20GM104420 aracılığıyla başlangıç fonları tarafından ek destek sağlanmıştır.

<ol><li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chlamydial+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li>
<li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li>
<li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CF%8328+RNA+polymerase+regulates+hctB%2C+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li>
<li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li>
<li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).</li>
<li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).</li>
<li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li>
<li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817(2016).</li>
<li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
<li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li>
<li>Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdelstein%2C+A+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14-20 (2010).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Collaborative+data+science%22">Collaborative data science</a>. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li>
<li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li>
<li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Klamydial gelişim döngüsünü kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, mevcut genetik araçların sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. Canlı hücreli otomatik mikroskopi ile birlikte organizatör-muhabirkla Klamidya'yı istihdam eden bir sistem, 24 saatlik bir süre içinde bireysel içermelerde hücre tipi gelişimin izlenmesini sağlayan bir sistem inşa edilmiştir. Bu sistem, kimyasal mutagenez ve doğrudan dahil izolasyon ile birlikte hızlı ve klonsal klamidya değiştirilmiş gelişimsel profilleri ifade seçmek iç...

Klamidya trachomatis (Ctr) onun hayatta kalma ve proliferasyon için gerekli olan bir bifhasik gelişim döngüsü ile ilerler zorunlu bir hücre içipatojen1. Bu döngü iki gelişimsel formdan oluşur: temel gövde (EB) ve retikülat gövdesi (RB). EB çoğaltma yetersiz ama etkili veya indüklenen endocytosis2ile hücre invazyonu aracılık . Bir kez ana bilgisayarda, EB çoğaltıcı RB olgunlaşır. RB, sonraki enfeksiyon turlarını başlatmak için EB'ye geri dönmeden önce birden fazla çoğaltma turu yapar.
Genetik araçların sınırlı dizi biyokimyasal çalışmalar veya vekil sistemlerin kullanımı için klamydial araştırma çoğu kısıtlamıştır. Sonuç olarak, gen regülasyonu ve gelişim döngüsünün kontrolü açıklaması zor olmuştur3,4. Klamydial alanında daha önemli sorunlardan biri klamydial gelişim döngüsünün yüksek çözünürlüklü zamansal izleme ve onun düzenlenmesinde yer proteinlerin belirlenmesidir. Klamydial gelişim döngüsü sırasında gen ekspresyonu geleneksel RNAseq, qPCR ve sabit hücre mikroskobu5dahil yıkıcı "bitiş noktası" yöntemleri ile yapılmıştır 5,6. Bu yöntemler paha biçilmez bilgiler sağlasa da, kullanılan teknikler zahmetli dir ve düşük zamansal çözünürlüğesahiptir 5,6.
Son on yıl içinde, Ctr genetik manipülasyon plazmid dönüşüm ve mutagenesis,7,8,9için yöntemlerin giriş ile ilerlemiştir. Bu çalışma için, plazmid tabanlı bir sistem bir enfeksiyon boyunca gerçek zamanlı olarak bireysel inklütal gelişimi izlemek için geliştirilmiştir. Bir chlamydial transformant hem bir RB ve EB hücre tipi özel organizatör-muhabir ifade oluşturuldu. RB özel muhabiri floresan protein Yonca erken RB gen euo upstream organizatörü eriterek inşa edilmiştir. EUO geç EB ilişkili genlerin bir alt kümesi bastırır transkripsiyondüzenleyici10. HCTBorganizatörü , EB nükleoid yoğuşması dahil bir histon benzeri protein kodlar, doğrudan mKate2 (RFP) upstream EB özel muhabir oluşturmak için klonlandı11. hctBprom-mKate2/euoprom-Clover için omurga p2TK2SW27oldu. HctB ve euo organizatörleri Ctr-L2 genomik DNA'sından güçlendirilmiştir. Her organizatör dizisi belirtilen klamydial gen artı ilgili ORF ilk 30 nükleotit (10 amino asit) için öngörülen transkripsiyon başlangıç alanının yukarı ~ 100 baz çiftleri oluşuyordu. Floresan FP varyantları ticari olarak Ctr kodonu optimize gen blokları olarak elde edildi ve her bir klamydial gen ve promotör ilk 30 nükleotit ile çerçeve içinde klonlanmış. IncD terminatör doğrudan mKate2 aşağı klonlanmış oldu. İkinci organizatör-muhabir incD terminatör aşağı yerleştirildi. P2TK2SW2'deki ampisilin direnç geni(bla)pBam4'ten aadA geni (Spectinomycin direnci) ile değiştirildi. Bu son yapı p2TK2 sonuçlandı-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Şekil 1A) Ctr-L27dönüştürülmüştür . Bu RB/EB muhabiri, canlı hücre mikroskopisi kullanılarak tek dahil ler içinde gelişim döngüsünün gözlemlemesine olanak sağlar (Şekil 1B,C).
Organizatör-muhabir yapımımızı kimyasal mutagenez ile birlikte kullanan bir protokol, Ctr serovar L2'nin mutajenleşmiş popülasyonlarından gelişimsel anormallikler sergileyen bireysel klonları izlemek ve izole etmek için bir protokol geliştirildi. Bu protokol, tek tek klamydial inklüetlerin doğrudan izlenmesine, zaman içinde gen ekspresyonunun izlenmesine, değişmiş bir gelişimsel gen ekspresyonu deseni ifade eden klamyal klonların tanımlanmasına ve Klamidya'nın tek tek içermelerden klonal izolasyonuna olanak sağlar.
Bu protokol özellikle klamydial gelişime dahil olan genlerin tanımlanması için oluşturulmuş olsa da, herhangi bir sayıda kimydial genetik yolu sorgulamak için kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>24 oyuklu polistiren plakalar</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>İzolatların yeniden enfeksiyonu için hücre kültürü büyümesi</td></tr><tr><td>6 oyuklu cam alt plakalar</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Görüntüleme için hücre kültürü büyümesi</td></tr><tr><td>96 oyuklu cam alt plakalar</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>Görüntüleme için hücre kültürü büyümesi</td></tr><tr><td>Kalın çizgi CO2 Ünitesi</td><td>OKO Labs</td><td>CO2 ÜNITESI BL</td><td>Sahne inkübatörü CO2 kontrolü</td></tr><tr><td>Kalın çizgi T Ünitesi</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>Sahne inkübatörü sıcaklık kontrolü</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal borular</td><td>Sutter Enstrüman</td><td>B1005010</td><td>Kılcal borular</td></tr><tr><td>BrightLine bant geçiren emisyon filtresi (514/30nm)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>Fluoescent filtre küpü</td></tr><tr><td>BrightLine bant geçiren emisyon filtresi (641/75nm)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/ 75-25</td><td>Fluoescent filtre küpü</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Mikroenjektör</td></tr><tr><td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>Chlamydia trachomatis</td></tr><tr><td>CIP-1 ortamı</td><td>Kurum içi</td><td>NA</td><td>Axenic media. %1 FBS, 25 & mu ile desteklenmiş IPB; M amino asitler, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT ve 50 &mu; M GTP, UTP ve CTP. (Omsland, A. 2012) kendi bünyesinde yapılmıştır.</td></tr><tr><td>Cos-7 hücreleri (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Afrika yeşil maymun böbrek hücresi (konakçı hücreler)</td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>194527</td><td>Konak hücre büyüme inhibitörü</td></tr><tr><td>Etil metansülfonat, %99</td> <td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>Mutagen</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>İkizler Biyo-Ürünler</td><td>100-602</td><td>Baz büyüme ortamı için takviye</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Açık kaynak Görüntü analiz yazılımı. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Galaxy 170 S CO2 inkübatörü</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>Hücre kültürü inkübasyon</td></tr><tr><td>gblokları (Floresan FP varyantları: Yonca ve mKate2)</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td> P2TK2SW2 <td></td> Gentamisin 10mg/ml Gibco'ya <td>klonlama için Ctr optimize edilmiş FP varyanlarının NA gblock ORF'leri</td></tr><tr><td></td><td></td><td>15710-064</td><td>Büyüme ortamı için antibiyotik</td></tr><tr><td>HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi)</td> <td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>Konak hücreler durulanır</td></tr><tr><td>Heparin sodyum</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td>, <td>konak hücre ve EB'ler arasındaki erken elektrostatik etkileşimleri inhibe eder ve tersine çevirir</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>Büyüme ortamı için pH tamponu</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Mikromanipülatör</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>İnklüzyon izlerinin görselleştirilmesi. https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Aleti</td><td>LB10-3</td><td>Filtre tekerleği kontrol cihazı</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Bold line T ve CO2 Ünitesini kontrol etmek için</td><td>Oko Touch</td></tr><tr><td>Arayüzü Önceki XY aşaması</td><td>Önceki</td><td>H107</td><td>Motorlu XY mikroskop aşaması</td></tr><tr><td>PrismR Santrifüj</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>Sıcaklık kontrollü mikrosantrifüj</td></tr><tr><td>Problot Hibridizasyon fırını</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>Chlamydia Proscan II ile enfeksiyon için Sallanan İnkübatör</td></tr><tr><td></td><td>Önceki</td><td>H30V4</td><td>XYZ mikroskop kademe kontrol cihazı</td></tr><tr><td>Arıtıcı Sınıf 2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>Hücre kültürü çalışması</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (fenol kırmızısı yok)</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>Görüntüleme için baz büyüme ortamı</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (fenol kırmızısı)</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30027.01</td><td>Temel büyüme ortamı</td></tr><tr><td>kapsamıLED uyarma LED'leri (470nm, 595nm)</td><td>kapsamLED</td><td>F140</td><td>Uyarma ışığı</td></tr><tr><td>Sonik Ayırıcı Model 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>Sonikatör, klamidyal pelet yeniden askıya alma</td></tr><tr><td>Aşama inkübatörü</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Küme kuyusu plakası inkübasyon odası</td></tr><tr><td>sükroz-fosfat-glutamat tamponu 1X (SPG)</td> <td>Kurum içi</td><td>NA</td><td>Klamidyal depolama tamponu. (10 mM sodyum fosfat [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sükroz, 0.50 mM L-glutamik asit; pH 7.4)</td></tr><tr><td>T-75 Şişeler</td><td>Termo Bilimsel</td><td>156499</td><td>Hücre kültürü büyümesi</td></tr><tr><td>TE 300 ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>Beyaz ışık</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>Plakalara tohumlamak için konakçı hücreleri şişeden çıkarır</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td>görüntüleme kamerası</td></tr><tr><td>&mikro; Manager 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>Açık kaynak otomatik mikroskop kontrol yazılım paketi</td></tr></tbody></table>

klamidya trachomatis'te gelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için canlı hücre İleri genetik yaklaşım

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Hücre içi bakteriyel patojen Klamidya trachomatis iki morfolojik ayrık gelişim formundan oluşan bir gelişim döngüsünden geçer. Replikatif olmayan temel cisim (EB) konaklayıcının enfeksiyonunu başlatır. Bir kez içinde, EB reticulate vücut (RB) içine ayırt eder. RB daha sonra bulaşıcı EB formuna geri ayırt etmeden önce, çoğaltma birden fazla tur uğrar. Hücre türleri arasında geçiş başarısızlığı ya ana konak işgali veya çoğaltma önler gibi bu döngü klamydial sağkalım için gereklidir.
Klamidya'nın zorunlu hücre içi doğasınedeniyle genetik tekniklerde sınırlamalar hücre tipi gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını engellemiştir. Canlı hücre mikroskobu ile birlikte hücre tipi anahtarlamanın gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyan yeni bir çift promotör-muhabir plazmid sistemi tasarladık. Hücre tipi gelişimin düzenlenmesinde yer alan genleri belirlemek için, canlı hücre promotör-muhabir sistemi, çift muhabir in kimyasal mutagenezi birleştirerek ileri genetik bir yaklaşım geliştirilmesi için kaldıraçlı, görüntüleme ve altered gelişimsel kinetik ile Klamidya izleme, mutantların klonal izolasyon izledi. Bu ileri genetik iş akışı genetik yollar geniş bir yelpazede içine yönlendirilmiş sorgulama için değiştirilebilir esnek bir araçtır.

Organizatörümüzün-muhabir chlamydial zorlanmamızın direkt EMS mutagenezi, enfektelikte ~u azalma ile sonuçlandı. Açıklanan canlı hücre görüntüleme protokolü kullanılarak, ~600 dahil etme 24 saatlik bir süre boyunca görüntülendi ve izlendi. Her iki muhabirin floresan ifade kinetiği özel Python not defteri komut dosyaları kullanılarak görselleştirildi. İzolasyon için aday mutajenize Chlamydia belirlemek için iki görselleştirme yaklaşımı uygulanmıştır. İlk metodoloji (adım 3.3.8) euo ve hctB organ...

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Bu protokol, klamidyanın değiştirilmiş gelişimsel profillerle üretimi ve izolasyonu için benzersiz bir araç sağlar ve sonuçta gelişim döngüsünü düzenleyen genlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Bu yöntemin başlıca avantajları, klamidya hücre tipi gelişimini gerçek zamanlı olarak takip edebilme yeteneği ve klamidyayı izole edebilme yeteneğidir. Bir klamidya trachomatis muhabirini susturmak için, yedinci temel bedenlere yaklaşık üç kez 10.'yu içeren bir klamyan stoğu gördüm.İlgi ve pelet muhabir plazma ile dönüştürülmüş, düşünce santrifüj ile stoklanır. 10 saniye boyunca % 10 güçte sonication kullanın, kazara metabolizma tampon 100 mikrolitre temel organları yeniden askıya almak ve eşit olarak ortaya çıkan temel vücut süspansiyon bölünmüş, iki 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpler arasında. Mutagenez için klamidya aliquots içine taze hazırlanmış EMS metabolizma çözeltisi 50 mikrolitre ve sadece stok mutagenezi için chlamydial aliquot için vaccinic metabolizma tampon 50 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca her iki örnek kuluçka.EMS kullanım sırasında bilinen bir karsinojen eldiven giymek, ve tüm EMS kontamine ekipman ve orta, bir azı lı sodyum hidroksit için 24 saat boyunca ıslatın. Bir toptan kültür kurmak için, görüntüleme ve mutigenize klamidya trachometers izolasyon için. Tohum altı iyi cam alt plakalar, altı kez 10 beşinci maliyet yedi hücreleri, iyi başına tam orta iki mililitre ve tohum 24 iyi polistiren plaka ile 10 beşinci neden iyi başına tam orta bir mililitre yedi hücre.Mutagenized inkar klamidya trachomatis enfekte ile konak hücre kültürü enfekte etmek için, yaklaşık altı kez 10 ile cam dipli plaka beş Wells, mutajenize temel organların. Kuyu başına 1,5 mililitre buz gibi HBSS. ve kalan kuyuya yaklaşık iki kez 10 ile beşinci alay mutajenize ilköğretim organları ile 1.5 iyi başına buz soğuk HBSS mililitre, 37 santigrat derece bir 15 dakikalık kuluçka sonra, sallanan ile, 37 derece Santigrat HBSS heparin mililitre başına bir miligram ile takviye ile enfekte hücreleri yıkayın, hemen bir HBSS durulama takip.tekrar heparin ile hücreleri yıkayın, hemen sonra sadece HBSS ile iki durulama tüm heparin kaldırılır emin olmak için. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 37 santigrat derece görüntüleme ortamıdört mililitre ekleyin. Ve 37 santigrat derece deiyonize su ile inter kuyu boşluklarını doldurun sonra 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin.Kuluçka sonunda mikroskop evresi kuluçka makinesini %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarladı. Ve altı kuyu cam alt plaka, sahne kuluçka içine yerleştirin. Görüntüleme yazılımında, altı kuyu plakası şablonunu seçmek için yüksek içerik tarama eklentisini kullanın ve otomatik görüntüleme için odaklamayı ayarlamak için otofokus seçeneğini kullanın ve GFB kanalında %4 yoğunlukta 250 milisaniyeye ve RFP kanalında yoğunluğu %18'e ayarlamak için iyi görüş başına 12 alandan oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun.Yani 24 saat boyunca görüntüleme döngüsünde, 30 dakikalık aralıklarla, gelişim döngüsünün kinetik yakalamak ve inFocus dilimin her iki tarafında sona eren odak aralığı ile birden fazla Z yığınları içerecek şekilde görüntü yakalama ayarlamak için, sonra görüntüleme için göreli Z seçin, edinme penceresinde birden fazla dilim ve görüntü yığını dosyasını kullanın. görüntüleri TIFF yığın dosyaları olarak kaydedilecek şekilde ayarlamak için. Geliştirme profillerini değiştirerek dahil etme parçalarını belirlemek için, EMS ekranındaki alma hücresini, Python not defterini işaretlemeyi kullanarak izleme istatistiklerindeki noktalardan, CSV dosyalarını Panda'nın veri çerçevesine aktarın.Her parça için hem erken hem de geç muhabirler için maksimum ifadeye sahip olmak için zamanı hesaplamak için hesap hücresini kullanın ve yarım max plot hücresindeki bokeh çizim paketini kullanarak hctB baloya karşı iki yarım max ifadeden yarım maksimal ifadeye kadar görselleştirin. Sahte işlenmiş dağılım bulutunun dışında kalan mutant popülasyonundan gelen eklemeleri belirlemek için bokeh etkileşimli parça ID Explorer'ı kullanın. Animasyonlu kan hücresi grafiğinde organizatör ekspresyonu kinetiğindeki değişiklikleri dinamik olarak görselleştirmek için HCTB balosuna karşı EOU balosundaki ifade yoğunlukları.Ardından, ekletme bulucu hücresindeanimasyon grafiğinden anlık görüntü alın. Gelişimsel Newton'ları, ilginin dahil edilmesinden izole etmek için, görüş alanını tanımlanmış bir dahil etme ile bir kuyunun üzerine yerleştirin ve iğneyi faz diferansiyel girişim kontrastı beyaz ışık kanalı ışık kaynağının üzerinden geçirin, iğneyi görselleştirmek için, 595 nanometreyi, uyarma kanalını kullanarak temel gövdeleri ekstraksiyon için görselleştirin. Ve ince ayarı ve mikro manipülatör kullanın, dahil kılcal iğne manevra, iğne ile dahil rüptür, ve kılcal iğne ucu içine temel organları çizmek için mikro enjektör kullanın.Çıkarılan temel cisimleri, kılcal iğneden tek bir kuyuya, 24 kuyu polistiren plakada hazırlananlardan dışarı atın ve bir sonraki ekstraksiyon için yeni bir kılcal iğne kullanın. Her izole yeterli bir genişleme sonra, bir mililitre likit mikropipet ucu ile enfekte monolayer bozmak ve orta hücre enkaz transferi ve yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine klamidya serbest. Pelet santrifüj tarafından hasat klamidya, ve buz soğuk 75 mikrolitre pelet resuspend, sakaroz fosfat glutamat tampon, sonra eşit dahil süspansiyon bölünmüş, üç yeni 1.5 mililitre vidalı kapak mikro santrifüj tüpler arasında, ve eksi 80 santigrat okumak için tüpleri saklayın.Mutajen ISED görüntüleme için bir konak hücre kültürü kurmak için tohum izole 1.6 kez 10 ile dördüncü maliyet yedi hücreleri, kuyu başına tam orta 100 mikrolitre. Konak hücre monolayer bilgili mutant klonlar ve buz üzerinde yabani tip klamidya stokları çözülme ulaştıktan sonra ve gerçekleştirmek için izole başına bir sütun kullanın, her mutant izole iki kat seri seyreltme. Enfekte, yabani tip klamidya ile kalan sütun, yaklaşık 0,5 enfeksiyon çokluğu, ve kuluçka sonunda 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka bir plaka yerleştirin, az bir enfeksiyon çokluğu karşılık gelen mutant izole başına üç kuyu seçin, ve bir görüntüleme konum listesi oluşturmak.her kuyu için iki görüş alanından oluşur. Bu scatterplot, EOU ve hctB organizatörleri bireysel chlamydial izole gelen yarım maksimal ifade zamanı, eou organizatörü ve daha uzun kez dört hctB maksimal ifade için daha kısa kez üretilen olarak izolasyon için seçildi klonlar görülebilir. Değiştirilmiş kinetik içeren eklemeler, iki promotörün dinamik gen ekspresyonunun görselleştirilmesine, iki promotörün dinamik gen ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabilir ve ilgi nin dahil edildiğinin yerini belirlemek için animasyonlu grafiğin anlık görüntüsü kullanılabilir.Bu temsili görselleştirmelerde, 10'u diferansiyel kinetik sergilenen izolasyon için toplam 24 dahil lik tespit edilmiştir, üç farklı fenotipik kategoride yeniden test edildikten sonra, sekiz izole, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon sonrası azalmış EOU promotör ekspresyonu sergilenmiştir. A3667 klon tarafından gösterildiği gibi, B3858 izole, ayrıca azalmış bir EOU promotör ifadesi sergiledi, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon. Ama hctB promotör ekspresyonunda genel bir artış, B3662 izole ise, EOU organizatörü floresan artan düzeyde ifade her iki promotörler ifade ani bir kayıp izledi.Mutant B3662 için canlı hücre mikrograflarının analizi, konak hücre lisisinin bu mutantla enfekte olmuş hücrelerde, yabani tip enfekte hücrelerden çok daha erken meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Hücre tipi gelişimi eksik klamidya kurtarma, bu hücreler konak reinfect olamaz gibi, mümkün olmayabilir. Genom geniş ilişki çalışmaları izolasyondan sonra, gelişimsel genleri tanımlamak için, istatistiksel korelasyon yoluyla, alternatif organizatör muhabirlerin dahil edilmesi yle birlikte kullanılabilir.Bu yöntem, çok sayıda genetik yolların araştırılması, genetik devre mekanizmalarının diseksiyon içine, ve diğer hücre içi patojenler genişletilebilir.

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia içeren hücresel vakuolleri (inklüzyonlar) aydınlatmak için canlı hücre floresan proteini bazlı bir yöntem tanımlanmıştır. Bu strateji, numunelerde Chlamydia enfektivitesinin hızlı ve otomatik olarak belirlenmesini sağlar ve inklüzyon büyüme dinamiklerini kantitatif olarak araştırmak için kullanılabilir.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutantlar, temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlardır. Burada, yüksek verimde ölümcül mutantları üretme ve sınıflandırma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Virüsün neden olduğu gen susturma, bitkilerin konakçı olmayan direncinde yer alan genleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturuculu bitkilerin tanımlanmasında GFPuv eksprese eden bakteriyel patojenlerin kullanımını gösteriyoruz. Bu yaklaşım kolay, hızlıdır ve büyük ölçekli taramayı kolaylaştırır ve diğer çeşitli bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için benzer bir protokol uygulanabilir.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Keşfedin, canlı hücre mikroskobisi ve floresan promotör-reporterler kullanarak Chlamydia trachomatis'in gelişimsel mutantlarını izole etme yöntemini. Bu ileri genetik yaklaşım, gelişim döngüsünü düzenleyen genleri belirlemeye yardımcı olur.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Daha fazla video keşfet