Name: İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Keşfedin, insan böbrek dokusunda lazer mikrodispeksiyon ile bölgesel transkriptomik analizi yapma yöntemini. Glomerül ve proksimal tübül gibi alt bölümlerden RNA izolasyonu ve sekanslama ile gen ifadesi değişikliklerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Genel: Yazarlar, Böbrek Hassas Tıp Projesi (www.kpmp.org) araştırmacılarına nazik destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür eder.
Finansman: Bu çalışma için destek NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Bu yazıda bildirilen araştırmalar, U2CDK114886 ödül numarası altında Ulusal Diyabet ve Sindirim Enstitüsü (NIDDK) Böbrek Hassas Tıp Projesi (KPMP), (www.kpmp.org) tarafından desteklenmiştir.
Veri ve malzeme kullanılabilirliği: Veriler Omnibus Gen İfadesi'nde arşivlenmiştir (GEO # beklemede)

Çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından kullanılmak üzere onaylandı.
NOT: Bu protokolü, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiminde korunmuş ve -80 °C'de depolanan böbrek nefrektomi dokusuyla (hem X hem de Y boyutlarında 2 cm'ye kadar) kullanın. Tüm çalışmaları RNA kontaminasyonini sınırlayan bir şekilde gerçekleştirin, temiz tek kullanımlık eldivenler ve yüz maskesi kullanın. Tüm yüzeylerin temizliğini sağlayın. Bu protokolün optimize edildiği ekipman, darbeli UV lazer içeren bir lazer mikrodiseksiyon sistemidir.
1. Kriyoseksiyon
<ol><li>Kriyoseksiyondan hemen önce 30 dakika boyunca 1,2 μm LMD PPS-membran (poli (p-fenilen sülfit) slaytlarını UV ışığına (doku kültürü laminer akış davlumbazında) maruz bırakın. Optimum doku yapışağı için slaytları oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Kriyostatı -20 °C'ye soğutun. Çalışma yüzeylerini temizleyin ve yeni bir kesme bıçağı takın.</li>
	<li>Slaytları taze kesilmiş dokuyla saklamak için kriyostat odasının içine küçük bir slayt kutusu (RNase yüzey dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenir) yerleştirin.</li>
	<li>OCT'deki numuneyi bir doku tutucuya yapıştırın ve oda sıcaklığına ulaşmak ve OCT bloğu ile tutucu arasındaki yapışma kuvvetini güçlendirmek için birkaç dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bir ısı çıkarıcı kullanarak işleme yardımcı olmak.</li>
	<li>Numuneyi 12 μm kalınlıkta kesin ve slayt adaptörünü kullanarak özel LMD slaydına yapıştırın. Her slaytta slayt başına bir nefrektomi bölümü veya slayt başına en fazla iki böbrek biyopsisi bölümü vardır. Slayt kutusunun içinde fazla nemin birikmesini önlemek için slaytları -80 °C'de kurutucu bir kartuşla ve sıkıca kapalı bir plastik torbanın içinde saklayın.</li>
	<li>Her slaydı örnek kimliği, tarih ve slayt numarasıyla etiketleyin.</li>
	<li>İlk kriyoseksiyon tarihinden itibaren 10 gün içinde örnekleri içeren slaytları kullanın.</li>
</ol>2. Lazer mikro disseksiyon
<ol><li>Boyamadan hemen önce, antikor karışımını (Ab-Mix) RNase içermeyen PBS'de% 10 BSA'da aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antikor doğrudan Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitörü ve PBS'de % 10 BSA'nın 89,2 μL'si (100 μL hacme ulaşmak için). NOT: THP antikorunun yerine alternatif antikorlar kullanılabilir. Örneğin, doğrudan Alexa Fluor 568'e konjuge edilen 2 μL megalin/LRP2 antikoru proksimal tübül etiketlemek için kullanılabilir. Ab-Mix LRP2 veya THP antikoru içerir (sırasıyla proksimal tübülleri veya kalın yükselen uzuvları görselleştirmek için). Diğer antikorlar kullanıcı ihtiyaçlarına göre doğrulanabilir.</li>
	<li>Kaydırağı buz gibi (-20 °C) %100 asetonda 1 dakika yıkayın ve nem odasına taşıyın.</li>
	<li>Slastanın üst kısmını RNase içermeyen PBS ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Ab-Mix'i 5 dakika uygulayın.</li>
	<li>Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Kaydırağı 5 dakika boyunca havayla kurulayın ve lazer mikroseksiyon kesme platformuna yükleyin.</li>
	<li>RNA izolasyon kitinden 50 μL Ekstraksiyon Tamponu içeren PCR çalışması için uygun toplama tüplerini (otomatik olarak kapatılmış 0,5 mL mikrosantrifüj tüpler) takın.</li>
	<li>LMD ile devam edin. Her LMD oturumunu en fazla 2 saat içinde tamamlayın.<ol>
<li>Operatörler arası değişkenliğin yanı sıra arşivleme amaçları, gerçekleştirilen protokolün eğitimi ve kalite değerlendirmesi için diseksiyonu doğrulamak için mikroskop kamerayı kullanarak LMD öncesi ve sonrası immünofluoresans görüntülerini toplayın. 0,5 – 1 ng RNA elde etmek için en az 500.000 μm2 alan gereklidir. Bu genellikle tüm alt ilgi segmentleri için yeterli miktarda malzeme elde etmek için 8 x12 μm kalınlıkta bölümlerin kullanılmasını gerektirir.</li>
		<li>Boyama, morfoloji ve konum olarak ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve 40'tan büyük lazer gücü kullanarak bunları çıkarın. NOT: İşte diseksiyon kriterleri. Proksimal tübül FITC-Phalloidin ve LRP2 etiketlemesi ile tanımlanır. Kalın yükselen uzuv THP etiketleme ile tanımlanır. Toplama kanalı nükleer morfoloji (DAPI) ve diğer lekelerin olmaması ile tanımlanır. Glomerulus FITC-Phalloidin ve morfoloji ile tanımlanır. Intersitium lekeli tübüller arasındaki alan olarak tanımlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMD slaydına iki adet 12 μm bölüm yapıştırarak ve tüm bölümleri ayıklama arabelleğine keserek toplu kesitsel ifade imzası elde edin.</li>
	<li>LMD işlemi tamamlandıktan sonra, toplama mikrosantrifüj tüplerini kapatın ve içeriğin kapaktan tüpün altına taşındığından emin olmak için kuvvetlice kaydırın</li>
	<li>Tüpleri 30 s için 3.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Tüpleri 42 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpleri 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatant'ı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. RNA izolasyonu
NOT: Bu RNA yalıtım protokolü için, ticari bir RNA yalıtım kitinden bir protokol uyarladık. Üreticinin protokolü, proje için belirlenen kalite kontrol gereksinimlerini karşılayacak şekilde değiştirilmiştir.
<ol><li>Her RNA arıtma sütununa (PC) 250 μL Şartlandırılmış Tampon (CB) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüm bilgisayarları 16.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Doku örnekleri ile tüplere %70 etanol (Kit'te bulunur) 50 μL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak numuneleri iyice karıştırın. Girdap yapmayın. Santrifüj yapmayın.</li>
	<li>Karışımı 100 x g'da 2 dakika boyunca şartlandırılmış pc'lere ve santrifüje aktarın (RNA'yı bağlamak için), 16.000 x g'da 30 s santrifüjleme ile hızla takip edin (akışı kaldırmak için). Herhangi bir alt segment için doku örnekleri içeren 1'den fazla tüp varsa bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Pc'lere 100 μL Yıkama Tamponu 1 (WB1) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Her numune başına 40 μL DNase hazırlayın (35 μL RDD arabelleğe 5 μL DNase ekleyin). Daha sonra doğrudan PC'nin zarı üzerine 40 μL karışım ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PC'nin zarına 40 μL WB1 ekleyin ve 8.000 x g'da15 s için santrifüj ekleyin.</li>
	<li>PC'nin zarına 100 μL Yıkama Tamponu 2 (WB2) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>PC'nin zarına 100 μL WB2 ekleyin, 16.000 x g'da2 dakika santrifüj , hemen ardından 16.000 x g'da1 dakika santrifüjleme.</li>
	<li>Bilgisayarı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Membrana 12 μL Elution Buffer (EB) ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika kuluçkaya yatırın. Böylece, havuza alınan tüm diseksiyonlu doku örneklerinin son hacmi alt segment başına 12 μL'dir.</li>
	<li>Numuneleri 1.000 x g'da 1 dakika ve ardından 16.000 x g'da 2 dakika santrifüj. </li>
	<li>Biyoanalyzer analizi için 2 μL'yi taze bir tüpe aktarın (donma-çözülme olaylarını önlemek için).</li>
	<li>Tüm tüpleri daha fazla işleme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. RNA dizilimi
<ol><li>Ticari bir Biyoanalyzer ve küçük miktarlarda RNA ölçmeye adanmış bir çip kullanarak kalite için sıralamaya yönelik her numuneyi değerlendirin.</li>
	<li>Kütüphane hazırlığı ve dizilemesi öncesinde aşağıdaki kalite kontrol (QC) parametreleri gereklidir: Toplu olarak 4 ng'den ve her alt segment için 0,5 – 1 ng'den büyük RNA miktarı; 200 nükleotitten (DV200) uzun transkriptlerin yüzdesinin LMD örnekleri için %25'ten büyük olması gerekir (optimal > %75).</li>
	<li>Küçük miktarlarda bozulmuş RNA için tasarlanmış ticari bir cDNA kütüphane hazırlama kiti ile kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. Ekte listelenen ticari kit için, minimum DV200% 25 ve parçalanma gerektirmeyen Seçenek 2'yi kullanmanızı öneririz. Bazı sıralama teknolojileri% 307gibi daha yüksek minimum DV200 eşikleri gerektirebilir.</li>
	<li>cDNA bağdaştırıcıları ve dizinleri ekleyin.</li>
	<li>Manyetik boncuk teknolojisini kullanarak RNAseq kitaplıklarını arındırın.</li>
	<li>RNAseq kitaplık amplifikasyon adımından önce ticari bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ribozomal cDNA'yı tükenmesi.</li>
	<li>2 ng/μL cDNA kütüphane konsantrasyonundaki manyetik boncuk teknolojisini kullanarak son RNAseq kütüphanesini arındırın.</li>
	<li>Toplu olarak 30 milyon okuma/örnek ve alt segmental bölümler için 100 milyon okuma/örnek ile ticari bir sıralama sisteminde 75 bp eşleştirilmiş uç RNA dizilimini gerçekleştirin.</li>
	<li>Toplu iş efektinin kontrolüne izin vermek için her sıralama çalıştırmasıyla bir Referans RNA (25 μg) kullanın. Referans RNA'mızın ilk konsantrasyonu 1 μg/μL iken, sıralamada kullanılan son konsantrasyon 25 ng/μL'dir.</li>
	<li>Sıralama, interjenik ve mitokondriyal okumaların kalitesini değerlendirmek ve bir gene atfedilen okumaları belirlemek için FastQC uygulamasını kullanarak veri analizi yapın.</li>
	<li>Hizalama için Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) ve transkript ifade ölçümleri için edgeR/rbamtools kullanın.</li>
	<li>100.000'den az okuma ile örnekleri kaldırın. Quantile, kullanıcı tanımlı bir eşikte düşük ifade edilen genleri filtreledikten sonra veri kümesindeki ham okumaları normalleştirir.</li>
	<li>İfadeyi, ilgili alt segmentin diğer tüm alt segmentlerin ortalamasına bir oranı olarak ölçün ve log2 dönüşümü yapın. Aynı genin bağıl ekspresy edilmesi alt segmentler ve örnekler arasında karşılaştırılabilir; bununla birlikte, genler ve RNA türleri arasındaki potansiyel bozulma farklılıkları nedeniyle iki farklı gen arasındaki bağıl ifadeyi karşılaştırmak ideal değildir.</li>
	<li>Referans RNA örnekleri partiler arasında karşılaştırılırken, her nefron alt segmentine özgü bir dizi üretici için gen ekspresyonını karşılaştırmak için bir zenginleştirme analizi gerçekleştirin. R değeri > 0.9 olan ortalama ifadenin 1 standart sapması içindeki bir toplu iş efekti kabul edilebilir olarak kabul edilir. Daha yüksek bir toplu iş efekti puanı için ek normalleştirme gereklidir. Kabul edilen toplu iş efektinden sapan herhangi bir çalıştırma işaretlenebilir. Q30, her sıralama çalıştırması için >%90'dan büyük olmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li>
<li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016).</li>
<li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Aided+Laser+Dissection%3A+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

LMD tabanlı transkriptomik, gen ekspresyonını doku içindeki belirli alanlara tutturan yararlı bir teknolojidir. Bu teknolojinin temeli ve böbrekteki potansiyel uygulaması daha önce tanımlanmıştır8. Bununla birlikte, özellikle aşağı akış RNA dizilimi için yüksek doğruluk diseksiyonunu amaçlayan floresan bazlı diseksiyonun optimizasyonu, modernizasyonu ve düzene sokulması daha az yaygındır. Bu metodoloji doku içinde mekansal olarak topraklandığı için, doku yapılarında, özellikle hastalık durumlarınd...

Doku örneklerinin incelenmesindeki teknolojik gelişmeler, çeşitli organlardaki sağlık ve hastalık durumunun anlaşılmasını geliştirlemiştir. Bu tür gelişmeler, patolojinin sınırlı bölgelerde veya belirli hücre tiplerinde başlayabileceğinin altını çizmiştir, ancak tüm organ üzerinde önemli etkileri vardır. Bu nedenle, kişiselleştirilmiş tıbbın mevcut çağında, biyolojiyi sadece küresel olarak değil, hem hücre hem de bölgesel düzeyde anlamak önemlidir1. Bu, özellikle patolojik stresi farklı olarak başlatan ve / veya yanıt veren çeşitli özel hücre ve yapılardan oluşan böbrekte geçerlidir. Çeşitli insan böbrek hastalığı türlerinin patogenezi hala iyi anlaşılamamıştır. İnsan böbreğindeki interstiyumun belirli tübüler segmentlerinde, yapılarında veya alanlarında gen ifadesindeki değişiklikleri incelemek için bir metodoloji oluşturmak, hastalığın patogenezini bilgilendirebilecek bölgeye özgü değişiklikleri ortaya çıkarma yeteneğini artıracaktır.
İnsan böbrek biyopsisi örnekleri sınırlı ve değerli bir kaynaktır. Bu nedenle, böbrek dokusundaki transkriptomiyi sorgulayan teknolojiler dokuyu ekononize etmek için optimize edilmelidir. Hücre ve bölgesel düzeyde transkriptomikleri incelemek için mevcut yöntemler arasında tek hücreli RNA dizilimi (scRNaseq), tek nükleer RNaseq (snRNaseq), in situ mekansal hibridizasyon ve lazer mikrodiseksiyon (LMD) sayilebilir. İkincisi, aşağı akış RNA dizilimi ve analizi 2 ,3,4,5için doku bölümlerindeki bölgelerin veya ilgi çekici yapıların hassas izolasyonu için çok uygundur. LMD, diseksiyon sırasında floresan bazlı görüntüleme kullanılarak doğrulanmış belirteçlere dayalı belirli hücre tiplerinin veya yapılarının tanımlanmasına dayanarak benimsenebilir.
Lazer mikroseksiyon destekli bölgesel transkriptominin benzersiz özellikleri şunlardır: 1) hücrelerin histolojik olarak değil ifade ile tanımlandığı tek hücre teknolojilerini tamamlayan hücre ve yapıların mekansal bağlamının korunması; 2) bir antikor işaretçisi ifade imzalarını tanımladığı için teknoloji diğer görüntüleme teknolojilerini bilgilendirir ve bilgilendirir; 3) hastalıkta belirteçler değiştiğinde bile yapıları tanımlama yeteneği; 4) yaklaşık 20.000 gende düşük eksprese transkriptlerin tespiti; ve 5) olağanüstü doku ekonomisi. Teknoloji, yeterli RNA alımı için gerekli olan bir çekirdeğin 100 μm kalınlığından daha az olan bir böbrek biyopsisi için ölçeklenebilir ve büyük depolarda veya akademik merkezlerde yaygın olarak bulunan arşivlenmiş donmuş dokunun kullanılmasını sağlar6.
Devam eden çalışmada, insan böbrek dokusu ile kullanılmak üzere yeni bir hızlı floresan boyama protokolü ile optimize edilmiş bölgesel ve toplu transkriptomik teknolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yaklaşım klasik LMD keşifleri üzerinde geliştirir, çünkü toplama tubulointerstitial ifadenin aksine interstiyum ve nefron alt segmentleri için ayrı ifade verileri sağlar. Titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan kalite güvence ve kontrol önlemleri dahildir. Protokol, hücrelerin ve ilgi alanlarının görselleştirilmesini sağlar ve bu da aşağı akış RNA dizilimine izin vermek için bu yalıtılmış alanlardan RNA'nın tatmin edici bir şekilde alınmasına neden olur.

<table><tbody><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>AMPure Boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu Kartuş</td><td>Bel-Art</td><td>F42046-0000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>RDD tamponu, lazer</td></tr><tr><td>mikrodiseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Megalin/LRP2 Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab76969</td><td>Alexa Fluor 568 Mikrosantrifüj tüplerine doğrudan konjuge edilmiştir</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kamerası</td><td>Leica</td><td>DFC700T</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( RNAse İçermez)</td><td>VWR</td><td>K812-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td><td>ThermoFisher</td><td>O7466</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA İzolasyon Kiti</td><td></td> PPS-membran slaytlar KIT0204 <td></td><td>Uygulanan Biyosistemler</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>11505268</td><td></td></tr><tr><td>qPCR İnsan Referansı Toplam RNA 25 ve mikro; g</td><td>Takara Clontech</td><td>636690</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Ökaryot Toplam RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000</td><td></td></tr><tr><td>RNAse İnhibitörü</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Sequencer (HiSeq veya NovaSeq)</td><td>Illumina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Örgülü Toplam RNAseq Pico Girişi v2</td><td>Takara Clontech</td><td></td><td></td>634411</tr><tr><td>Tamm-Horsfall Protein Antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF5144</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr><tr><td>Doku-Tek & reg; OCT Bileşik</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr> ile doğrudan konjuge</tbody></table>

İnsan böbrek dokusunda bölgesel transkriptomikleri ortaya Çıkarmak İçin lazer mikrodispeksiyon uygulaması

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

İnsan böbrek dokusunun gen ekspresyon analizi homeostaz ve hastalık patofizyolojisini anlamak için önemli bir araçtır. Bu teknolojinin çözünürlüğünün ve derinliğinin arttırılması ve doku içindeki hücre seviyesine kadar genişletilmesi gerekir. Tek nükleer ve tek hücreli RNA diziliminin kullanımı yaygınlaşmış olsa da doku ayrışmasından elde edilen hücrelerin ifade imzaları mekansal bağlamı korumamaktadır. Belirli floresan belirteçlere dayanan lazer mikrodiseksiyon (LMD), bilinen lokalizasyon ile belirli yapıların ve hücre gruplarının izolasyonuna izin verecek ve böylece böbrek dokusunda mekansal bağlantılı transkriptomik imzaların elde edilmesini sağlayacaktır. hızlı floresan bazlı bir leke tarafından yönlendirilen bir LMD metodolojisini, insan böbreği içindeki beş ayrı bölmeyi izole etmek ve değerli insan böbrek dokusu örneklerinden sonraki RNA dizilimini yapmak için optimize ettik. Ayrıca, toplanan numunelerin yeterliliğinin değerlendirilmesini sağlamak için kalite kontrol parametreleri sunuyoruz. Bu yazıda özetlenen iş akışı, alt segmental transkriptomik imzaları yüksek güvenle izole etmek için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermektedir. Burada sunulan metodolojik yaklaşım, ilgili antikor belirteçlerinin ikame edilmesi ile diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Örnekleri
Böbrek nefron segmentlerini ve interstisyel alanları izole etmek için hızlı floresan boyama protokolünü kullanarak dokuz referans nefrektomiden (Indiana Üniversitesi'nde elde edilen 3 örnek ve Böbrek Hassas Tıp Projesi ile elde edilen 6 örnek) verileri sunuyoruz. Bu süreçte kullanılan bölümler vefat eden böbrek donörlerinden veya etkilenmemiş tümör neforektomilerinden elde edildi. Bu örneklerde bitişik bölümlerden alınan H&amp;E lekesinde görselleştirildiği gibi pato...

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Lazer mikrodiseksiyon, böbrek dokusu örnekleri içinde mekansal olarak tanımlanmış bölgelerin transkriptomik analizine izin verir. Bu bize, hastalık kaynaklı değişiklikler meydana geldikten sonra bile ilgilenilen yapıları tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu metodolojinin temel avantajları, tek hücreli RNA dizilimi gibi diğer omik teknolojilere tamamlayıcılığıdır.Dikkate değer bir doku ekonomisi sağlar ve hatta düşük ifade edilen transkriptlerin tespit edilmesine izin verir. Doku örneğini aldıktan sonra, örneği 12 mikrometre kalınlığa kadar kesmek için eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kullanın ve örneği özel bir lazer mikrodiseksiyon slaydına sabitlemek için kayar adaptörü kullanın. Kriyoseksiyondan sonraki 10 gün içinde, PBS'de 89.2 mikrolitre RNaz içermeyen% 10 BSA'yı dört mikrolitre FITC phalloidin, 1.5 mikrolitre DAPI, iki mikrolitre doğrudan Alexa Fluor 546'ya konjuge edilmiş ilgili antikor ve 3.3 mikrolitre RNase inhibitörü ile karıştırın.Slaytı eksi 20 santigrat derece %100 asetonda bir dakika yıkayın ve slaytı bir nem odasına yerleştirin. Sürgünün üst kısmını, yıkama başına 30 saniye boyunca taze RNaz içermeyen PBS ile iki kez yıkayın, ardından RNaz

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için...

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Burada, transkripsiyonel profilleme için belirli bitki hücre tiplerinin lazer destekli mikrodiseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol farklı türler ve hücre tipleri için uygun olsa da, odak noktası, turpgil cinsi Boechera'da eşeyli ve apomiktik üreme için önemli olan dişi germ hattının son derece erişilemez hücreleridir.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.

Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, tüm böbrek, izole kortikal tübül ve medüller proteomların proteomik analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Çalışma ayrıca diyabetik bir fare modelinde ve diyabetik olmayan farelerde bölgesel proteomları karşılaştırır.

Farelerde Böbrek Hasarının Diyabetik Patogenezinde Tüm Böbrek, Medulla ve Kortikal Tübüllerin Karşılaştırmalı Proteomik Analizi

Bu makale, insan renal arter dallarının izolasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için adım adım bir protokol sunmakta ve farmasötik geliştirme için klinik öncesi çalışmaları kolaylaştırmaktadır.

İnsan Renal Arteriyel Dallarının Çok Düzeyli Mikrodiseksiyonu ve Fonksiyonel-Yapısal Profillemesi

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Keşfedin, insan böbrek dokusunda lazer mikrodispeksiyon ile bölgesel transkriptomik analizi yapma yöntemini. Glomerül ve proksimal tübül gibi alt bölümlerden RNA izolasyonu ve sekanslama ile gen ifadesi değişikliklerini inceleyin.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Daha fazla video keşfet