İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Lazer mikrodiseksiyon, böbrek dokusu örnekleri içinde mekansal olarak tanımlanmış bölgelerin transkriptomik analizine izin verir. Bu bize, hastalık kaynaklı değişiklikler meydana geldikten sonra bile ilgilenilen yapıları tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu metodolojinin temel avantajları, tek hücreli RNA dizilimi gibi diğer omik teknolojilere tamamlayıcılığıdır.

Dikkate değer bir doku ekonomisi sağlar ve hatta düşük ifade edilen transkriptlerin tespit edilmesine izin verir. Doku örneğini aldıktan sonra, örneği 12 mikrometre kalınlığa kadar kesmek için eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kullanın ve örneği özel bir lazer mikrodiseksiyon slaydına sabitlemek için kayar adaptörü kullanın. Kriyoseksiyondan sonraki 10 gün içinde, PBS'de 89.2 mikrolitre RNaz içermeyen% 10 BSA'yı dört mikrolitre FITC phalloidin, 1.5 mikrolitre DAPI, iki mikrolitre doğrudan Alexa Fluor 546'ya konjuge edilmiş ilgili antikor ve 3.3 mikrolitre RNase inhibitörü ile karıştırın.

Slaytı eksi 20 santigrat derece %100 asetonda bir dakika yıkayın ve slaytı bir nem odasına yerleştirin. Sürgünün üst kısmını, yıkama başına 30 saniye boyunca taze RNaz içermeyen PBS ile iki kez yıkayın, ardından RNaz içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 saniyelik iki yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, RNaz içermeyen PBS'de% 10 BSA ile iki kez daha yıkamadan önce numuneyi hazırlanan antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında beş dakika

İkinci yıkamadan sonra, slaytı lazer mikrodiseksiyon kesme platformuna yüklemeden önce slaytı bir doku kültürü başlığında beş dakika havayla kurutun. Bir RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu içeren, PCR çalışmasına uygun, otoklavlanmış 500 mikrolitrelik mikro santrifüj toplama tüplerini cihaza takın. Yüklemeden sonra, numune içindeki ilgili bölgeleri boyama, morfoloji ve konuma göre belirleyin.

İlgilenilen en az 500.000 mikrometre karelik segmentleri özetlemek için immünofloresan kullanın. Ardından, 40'tan büyük bir lazer gücü kullanarak bölgeyi eksize etmek için lazer mikrodiseksiyonunu başlatın. Lazer mikrodiseksiyon işleminin tamamlanmasının ardından, mikrosantrifüj toplama tüplerini kapatın ve içeriğin kapaklardan tüplerin dibine doğru hareket etmesini sağlamak için tüpleri kuvvetlice hafifçe vurun.

Santrifüjlemeden sonra, tüpleri tekrar santrifüjlemeden önce tüpleri 42 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra süpernatanları eksi 80 santigrat derece depodan yeni 500 mikrolitrelik tüplere aktarın. Böbrekteki tübüler alt segmentlerin tanımlanması, hücre morfolojisi ve yapısal işaretlere ek olarak benzersiz tübüler belirteçlerin antikor boyaması ile gerçekleştirilir.

Morfolojik doku özellikleri ve görüntü yapılarının uzamsal konumlandırılması ile bağlantılı olarak floresan etiketleme, böbrek alt segmentlerinin yüksek derecede güvenle görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu temsili aşağı akış dizileme analizinde, minimum diseksiyon alanı girdisini karşılamanın başarı oranı %90'dan fazlaydı ve bu da gen tespiti için mevcut olan yüksek bir toplam mRNA miktarı ile sonuçlandı. Bu analizde, örneklerin% 100'ü en az 10.000 genin minimum tespit eşiğini karşıladı.

Lazer mikrodiseksiyondan sonra, bilinen belirteçlerin gen ekspresyonunun zenginleştirme analizi, diğer bölmelerden gelenlerle karşılaştırılabilir. Bu analizde, lazer mikrodiseksiyon bölgesel transkriptomikleri ile her bir alt segment için bir belirteç tanımlandı ve bu da karşılık gelen nefron alt segmentinin spesifik bir immünohistokimyasal boyamasını verdi. Lazer mikrodiseksiyonun, diseke edilecek ilgili yapıları kesin olarak tanımlamak için büyük ölçüde kullanıcının uzmanlığına dayandığına dikkat etmek önemlidir.

Bu teknik, sağlıklı dokunun biyolojisinin yanı sıra hastalığın ilerlemesinde rol oynayan potansiyel yolları değerlendirmek için kullanılabilecek spesifik bölgesel gen ekspresyon imzalarının incelenmesine izin verir.