İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması
9 Haziran 2020
Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.
Lazer mikrodiseksiyon, böbrek dokusu örnekleri içinde mekansal olarak tanımlanmış bölgelerin transkriptomik analizine izin verir. Bu bize, hastalık kaynaklı değişiklikler meydana geldikten sonra bile ilgilenilen yapıları tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu metodolojinin temel avantajları, tek hücreli RNA dizilimi gibi diğer omik teknolojilere tamamlayıcılığıdır.
Dikkate değer bir doku ekonomisi sağlar ve hatta düşük ifade edilen transkriptlerin tespit edilmesine izin verir. Doku örneğini aldıktan sonra, örneği 12 mikrometre kalınlığa kadar kesmek için eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kullanın ve örneği özel bir lazer mikrodiseksiyon slaydına sabitlemek için kayar adaptörü kullanın. Kriyoseksiyondan sonraki 10 gün içinde, PBS'de 89.2 mikrolitre RNaz içermeyen% 10 BSA'yı dört mikrolitre FITC phalloidin, 1.5 mikrolitre DAPI, iki mikrolitre doğrudan Alexa Fluor 546'ya konjuge edilmiş ilgili antikor ve 3.3 mikrolitre RNase inhibitörü ile karıştırın.
Slaytı eksi 20 santigrat derece %100 asetonda bir dakika yıkayın ve slaytı bir nem odasına yerleştirin. Sürgünün üst kısmını, yıkama başına 30 saniye boyunca taze RNaz içermeyen PBS ile iki kez yıkayın, ardından RNaz içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 saniyelik iki yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, RNaz içermeyen PBS'de% 10 BSA ile iki kez daha yıkamadan önce numuneyi hazırlanan antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında beş dakika
tedavi edin.İkinci yıkamadan sonra, slaytı lazer mikrodiseksiyon kesme platformuna yüklemeden önce slaytı bir doku kültürü başlığında beş dakika havayla kurutun. Bir RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu içeren, PCR çalışmasına uygun, otoklavlanmış 500 mikrolitrelik mikro santrifüj toplama tüplerini cihaza takın. Yüklemeden sonra, numune içindeki ilgili bölgeleri boyama, morfoloji ve konuma göre belirleyin.
İlgilenilen en az 500.000 mikrometre karelik segmentleri özetlemek için immünofloresan kullanın. Ardından, 40'tan büyük bir lazer gücü kullanarak bölgeyi eksize etmek için lazer mikrodiseksiyonunu başlatın. Lazer mikrodiseksiyon işleminin tamamlanmasının ardından, mikrosantrifüj toplama tüplerini kapatın ve içeriğin kapaklardan tüplerin dibine doğru hareket etmesini sağlamak için tüpleri kuvvetlice hafifçe vurun.
Santrifüjlemeden sonra, tüpleri tekrar santrifüjlemeden önce tüpleri 42 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra süpernatanları eksi 80 santigrat derece depodan yeni 500 mikrolitrelik tüplere aktarın. Böbrekteki tübüler alt segmentlerin tanımlanması, hücre morfolojisi ve yapısal işaretlere ek olarak benzersiz tübüler belirteçlerin antikor boyaması ile gerçekleştirilir.
Morfolojik doku özellikleri ve görüntü yapılarının uzamsal konumlandırılması ile bağlantılı olarak floresan etiketleme, böbrek alt segmentlerinin yüksek derecede güvenle görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu temsili aşağı akış dizileme analizinde, minimum diseksiyon alanı girdisini karşılamanın başarı oranı %90'dan fazlaydı ve bu da gen tespiti için mevcut olan yüksek bir toplam mRNA miktarı ile sonuçlandı. Bu analizde, örneklerin% 100'ü en az 10.000 genin minimum tespit eşiğini karşıladı.
Lazer mikrodiseksiyondan sonra, bilinen belirteçlerin gen ekspresyonunun zenginleştirme analizi, diğer bölmelerden gelenlerle karşılaştırılabilir. Bu analizde, lazer mikrodiseksiyon bölgesel transkriptomikleri ile her bir alt segment için bir belirteç tanımlandı ve bu da karşılık gelen nefron alt segmentinin spesifik bir immünohistokimyasal boyamasını verdi. Lazer mikrodiseksiyonun, diseke edilecek ilgili yapıları kesin olarak tanımlamak için büyük ölçüde kullanıcının uzmanlığına dayandığına dikkat etmek önemlidir.
Bu teknik, sağlıklı dokunun biyolojisinin yanı sıra hastalığın ilerlemesinde rol oynayan potansiyel yolları değerlendirmek için kullanılabilecek spesifik bölgesel gen ekspresyon imzalarının incelenmesine izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, insan böbrek dokusu içindeki spesifik alt segmentlerin, glomerül ve proksimal tübül dahil, lazer mikrodiseksiyonu için bir protokol sunar. Bu bölmelerdeki izole edilen RNA, farklı böbrek yapıları ile ilişkili gen ekspresyon paternlerindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için transkriptomik analizi sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Transkriptomik analiz
- Böbrek biyolojisi
- Hastalık ilerlemesi araştırması
Arka Plan
- Böbrek alt segmentlerinin incelenmesinin önemi
- Hastalık sonrası mekansal olarak tanımlanmış yapıların analizinde karşılaşılan zorluklar
- Diğer omics teknolojileri ile tamamlayıcılık
Kullanılan Yöntemler
- Lazer mikrodiseksiyon
- İnsan böbrek doku örnekleri
- RNA izolasyonu ve sekanslama
Ana Sonuçlar
- Diseksiyon ve RNA kurtarma işlemlerinde yüksek başarı oranı
- Böbrek alt segmentleri için gen ekspresyon belirteçlerinin tanımlanması
- Hastalık ilerlemesiyle ilgili potansiyel yolakların gösterilmesi
Sonuçlar
- Bu protokol, böbrekte bölgesel gen ekspresyonunu incelemek için etkili bir yöntem gösterir.
- Bulgular, renal biyolojiyi ve potansiyel hastalık mekanizmalarını anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved transcriptomic profiling of human kidney tissue, addressing a critical gap in discovery biology where dissociation-based methods lose anatomical context. This approach supports target validation by linking gene expression signatures to defined nephron sub-segments, enhancing mechanistic de-risking in renal disease models. The method provides predictive confidence for pathway interrogation and portfolio prioritization in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping gene expression to anatomically defined kidney compartments.
- Operational Value: Supports biological de-risking through spatially anchored transcriptomic signatures that maintain tissue context.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by correlating regional marker expression with functional sub-segment identity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by isolating high-integrity RNA from microdissected regions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through QC parameters assessing specimen adequacy and dissection success rates.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative, spatially resolved transcriptomic outputs for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant system modeling using human kidney sub-segments.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by identifying compartment-specific gene expression profiles detectable in tissue.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical decision-making by revealing pathway activity in anatomically precise disease-affected regions.
Pipeline & Workflow Integration
Laser microdissection fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling spatially resolved molecular profiling that bridges imaging and omics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene expression to structural landmarks in kidney tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through high-success-rate dissection (>90%) and sufficient RNA yield for sequencing applications.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (gene detection thresholds ≥10,000 genes) enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by preserving spatial context lost in dissociation-based methods.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across tissue types via antibody marker substitution, supporting platform-wide adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined workflow parameters and QC checkpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling risk-adjusted prioritization based on sub-segment-specific biology.
- Portfolio Impact: Supports capital efficiency through early de-risking of renal targets using spatially resolved evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining and morphological identification of renal sub-segments.
- Dependent on laser microdissection platforms and RNA isolation kits compatible with low-input samples.
- Necessitates cross-team standardization for staining protocols, dissection thresholds, and QC metrics.
- Adaptation across models requires validation of antibody markers and structural landmarks in target tissues.
- Practical limitations include user-dependent precision in region identification and RNA integrity maintenance during processing.
