Name: Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, hepatit E virüsü için yüksek titerli stok üretme yöntemini. Bu hücre kültürü protokolü, zarflı ve zarfsız viral parçiklerin elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hepatit E virüs p6 klon için Suzanne Emerson için müteşekkiriz. HEV'ye özgü tavşan hiperimmün serumu Almanya Friedrich Loeffler Enstitüsü'nde Rainer Ulrich tarafından sağlandı. Ayrıca Ruhr Üniversitesi Bochum Moleküler ve Tıbbi Viroloji Bölümü'nün tüm üyelerine destek ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Şekil 1-7 BioRender.com ile oluşturuldu.

NOT: Tüm deneyler BSL-2 koşulu altında gerçekleştirilir. Hepatit E virüsü RNA veya enfeksiyöz virüs ile temas eden tüm malzemeler, imha edilmeden önce kaputun içindeki bir atık kabından %4 Kohrsolin FF ile düzgün bir şekilde durulanmalıdır.
1. Plazmid hazırlığı
<ol><li>Dönüştürülmüş Escherichia coli JM109 ile 100 μg/mL ampisilin içeren 200 mL LB orta tam uzunlukta HEV gt3 Kernow-C1p6 dizisi için plazmid kodlama içeren (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 veya pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). 37 °C'de 16 saat boyunca kalıcı ajitasyon altında (170 rpm) kuluçka. NOT: Plazmid izolasyonu plazmid ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Üretim protokolünü takiben, 10 dk için 6.000 x g ve 4 °C'de 200 mL gece kültürü aşağı çevirin ve supernatant atın. Bakteriyel pelet dondurulabilir ve -20 °C'de saklanabilir.<ol>
<li>10 mL serolojik pipet ve bir pipet adam ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından Resuspension tampon 4 mL bakteriyel pelet resuspend. Ayrıca, girdap titizlikle.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış Lysis tampon (30-40 °C) 4 mL ekleyin. Birkaç kez hafifçe ters çevirin ve oda sıcaklığında kuluçka (RT) için 5 dakika.</li>
		<li>Nötralizasyon arabelleği 4,8 mL ekleyin, nazikçe ters çevirin ve lysate'nin niceliksel olarak nötralize olduğundan emin olun (üreticinin açıklamasına bakın). Sonra 11.000 x g ve 4 °C'de 20 dk santrifüj.</li>
		<li>1 mL filtre olmayan ucuiçine 2 cm x 2 cm mull parça yerleştirin, yük yeniden askıya alınmış, lysed ve nötralize supernatant içinde 10 mL serolojik pipet, serolojik pipet ucuna mull ile 1 mL ucu ekleyin ve yeni bir 50 mL tüp içinde supernatant filtre. NOT: Supernatant gerekirse 4 °C'de 30 dk'ya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Birkaç adımda filtrelenmiş süpernatantın 750 μL'sini toplam 4 filtre sütununa (kitte sağlanan) ve 30 s için 11.000 x g'de santrifüj uygulayın.</li>
		<li>Her filtre sütununa 500 μL önceden ısıtılmış (50 °C) ile iki kez yıkayın tampon AW'yi 11.000 x g'de 30 s'de yıkayın ve daha sonra akıştan geçen leri atın.</li>
		<li>Her filtre sütununu 600 μL yıkama tamponu A4 ile 30 s için 11.000 x g'de santrifüj ederek yıkayın. x g</li>
		<li>Her filtre sütunundaki plazmid DNA'sını, filtre sütunlarının ortasına 60 μL'lik elüsyon tamponu aktararak eute. 1 dk RT ve santrifüj 1 dk için 1 11.000 x g inkübat.</li>
		<li>Eluatları birleştirin ve spektrofotometre kullanarak çıkarılan plazmid DNA konsantrasyonu ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Doğrusallaştırma ve DNA arınması
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig01.jpg"> 
    Şekil 1: Plazmid lineerizasyonu ve DNA arınması için şematik deneysel kurulum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Doğrusallaştırma in vitro transkripsiyon sırasında RNA verimini artırır (adım 3)
<ol><li>Plazmid DNA'sını doğrusallaştırmak için(Şekil 1) şablon DNA'sının 10 μg'ını (adım 1'de çıkarılan), tamponun 10 μL'sini, 2 μL'lik MluI'yi karıştırın ve H2O ile 100°L'lik bir hacme ayarlayın.<ol>
<li>37 °C'de 1 saat kuluçka ve plazmidin agarose jel elektroforezi ile doğrusallaştırılmasını onaylayın (örneğin, sindirilmemiş ve sindirilmiş plazmid DNA'sını [her biri 1 μL] %1 agarose jel üzerinde ve 120 V sabit akımda elektroforez çalıştırın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üreticilerin DNA çıkarma protokolüne (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 1), kitte sağlanan 500 μL Bağlayıcı tamponu 100 μL doğrusaldna ile karıştırın. Örneği bir filtre sütununa uygulayın ve 30 s için 17.800 x g'de santrifüj uygulayın.<ol>
<li>Filtre sütununu 17.800 x g'de 650 μL Yıkama tamponu ve santrifüj ekleyerek yıkayın. Artık Yıkama tamponu kaldırmak için, 60 s için 17.800 x g kuru santrifüj ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp daha sonra her filtre sütunu yerleştirin.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 60 μL H2O (PCR sınıfı, 70 °C) filtrenin merkezine aktarılarak DNA'yı eleyin. 70 °C'de 1 dk, 1 dk.18.000 x g'da santrifüj için kuluçka. NOT: DNA'yı in vitro transkripsiyona kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tam uzunlukta HEV genotip 3 p6 DNA ve RNA saflaştırmainin in-vitro transkripsiyonu
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig2v2.jpg"> 
    Şekil 2: In vitro transkripsiyon ve RNA arınması için şematik deneysel kurulum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Plazmid DNA'sından viral genomik RNA üretmek için in vitro transkripsiyon gereklidir.
<ol><li>In vitro transkripsiyon karışımı için 20 μL 5x T7 transkripsiyon tampon, 10 mM DTT, 100 U ribonükleaz inhibitörü, 25 mM ATP, CTP ve UTP, 12.5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg doğrusaldna şablonu ve 80 U T7 RNA polimeraz. 100 μL'ye kadar nükleaz içermeyen H2O ile doldurun, iyice karıştırın ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. NOT: -20 °C'de kısa süreli depolama 3.1 ila 3.1.2 adımdan sonra mümkündür.<ol>
<li>2 μL T7 RNA polimeraz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>İlk DNA şablonu sindirmek için 7,5 μL DNase (RNase ücretsiz, 1 U/μL) ekleyin, iyi karıştırın ve 30 dakika 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Bozulmayı önlemek için RNA ile çalışırken tüm yüzeyleri ve pipetleri RNa için yüzey dekontaminantı ile temizleyin. Ayrıca, tüm reaksiyon tüpleri RNase içermeyen ve steril olduğundan emin olun. Sadece filtrelerle ipuçları kullanın ve sadece RNase içermeyen ve steril su ile seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA ekstraksiyonu için üretim protokolüne (Bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2), her in-vitro transkripsiyon reaksiyonu için 330 μL Lysis tamponu ve 330 μL'lik 100 etanol karıştırılarak Lysis tamponunun ve 0 etanolün premiksini hazırlayın. 110 μL RNA ve girdap için 660 μL Lysis tampon-etanol premixini ekleyin. Numuneyi bir filtre sütununa yükleyin ve 30 s için 8000 x g'de santrifüj yükleyin.<ol>
<li>30 s için 8000 x g'de 600 μL Yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. Kalan yıkama tamponu kaldırmak için 2 dakika için 8000 x g de Yıkama tampon ve santrifüj 350 μL ekleyin. Her filtre sütununu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. Filtre sütununun kapağını açın ve sütunun 3 dakika kurumasına izin verin.</li>
		<li>Filtre sütununun ortasına 50 μL RNase serbest H2O yerleştirerek Elute RNA. 1 dakika RT'de 1 dakika kuluçka ve ardından 1 dk. 8.000 x g'da inkübatör 1 000 x g. Bir agarose jelin üzerine 1 μL RNA yükleyerek RNA bütünlüğünü kontrol edin ve bir spektrofotometre kullanarak çıkarılan RNA konsantrasyonu ölçün. NOT: RNA'yı -80 °C'de elektroporasyona kadar saklayın ve bozulmayı önlemek için rna'yı buz üzerinde özel olarak eritin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HeV (HEVcc) üretimi elde edilen hücre kültürü için HepG2 hücrelerinin hazırlanması
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig03.jpg"> 
    Şekil 3: HeV (HEVcc) üretimi elde edilen hücre kültürü için HepG2 hücrelerinin hazırlanması için şematik deneysel kurulum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Kontaminasyonu önlemek için, hücre hazırlanması, elektroporasyon, enfeksiyon, hasat ve hücre fiksasyonu steril koşullarda biyogüvenlik seviyesi 2 tesisinde gerçekleştirilmiştir. Hücreleri içeren 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçka basamakları gerçekleştirildi.
<ol><li>HeVcc üretimi için HepG2 hücreleri hazırlamak için(Şekil 3),tam Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) tohum hücreleri (Tablo 1 </li><li><li></li><li></li></ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig04large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> </li><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li></ol></li><li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig05large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li><ol><li> </li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig06large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li></li><li><li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61373/61373fig07.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61373/61373fig07large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> </li><li> </li><li><ol><li></ol></li><li></li><li> </li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61373/61373equ01.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61373/61373equ02.jpg"> </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Plazmid hazırlığından başlayarak, aynı plazmid stoğundan birden fazla doğrusallaştırma yapabilmek için DNA verimleri 150 ng/μL'yi aşmalıdır, bu da önemli genom dizilerinin bakteri kaynaklı mutagenezi riskini en aza indirir. Ayrıca jel elektroforezi ile komple plazmid linelizasyonu için restriksiyon sindiriminin kontrol etmek önemlidir (Şekil 8b). Lineerleştirilmiş plazmid DNA eksikliği in vitro transkripsiyon daha az verimli neden haddeleme daire amplifikasyon neden olur. Buna ek olarak, RNA...

Hepatit E, dünya çapında yaygınlığı artan oldukça hafife alınmış bir hastalıktır. Yaklaşık 20 milyon enfeksiyon yılda 70.000'den fazla ölümle sonuçlanır1. Altta yatan ajan, Hepatit E virüsü (HEV), yakın zamanda yeniden atandı ve şimdi cins Orthohepevirus ve Piscihepevirus dahil olmak üzere aile Hepeviridae içinde sınıflandırılır. Çeşitli kökenlerden HEV insanlar, domuz, tavşan, sıçan, kuş ve diğer memeliler 2 izole de dahil olmak üzere orthohepevirus A-D türleri içindesınıflanır. Şu anda, sekiz farklı genotip (GT) pozitif odaklı, tek iplikçikli RNA virüsü tespit edilmiştir2. Dizikimlikleri, iletim yolları ve coğrafi dağılımları farklılık belirtse ler de genomik yapıları son derece korunmuştur. Daha spesifik olan 7.2 kbp HEV genomu 3 ana açık okuma çerçevesine (ORF1-3) ayrılmıştır. ORF1 konak hücre içinde başarılı bir çoğaltma için gerekli tüm enzimleri kodlarken, ORF2 capsid proteinini kodlar ve ORF3 proteini enfeksiyöz partiküllerin toplanması ve serbest bırakılması için gerekli olan işlevsel bir iyon kanalı olarak çalışır3. Bir kez bazal veya apikal lümen HEV içine yayımlanan her iki, yarı ve zarflı olmayan / çıplak türler virüs kan veya dışkı, sırasıyla4,5kaynaklı olup olmadığına bağlı olarak var .
GT1 ve GT2 daha çok gelişmekte olan ülkelerde bulunurken, sadece dışkı-oral yol ileinsanlara 6 bulaştıran, GT3, GT4 ve GT7 ağırlıklı olarak gelişmiş ülkelerde meydana1,7 rezervuarlar olarak hizmet veren türlerin çeşitliile,örneğin, domuz8, sıçan9, tavuk10,11, geyik12, firavun faresi13, yarasa14, tavşan15,16, yaban domuzu17 ve daha birçok7,18,19, zoonoz kanıt sağlayan7,20,21,22. Yetersiz sıhhi koşullara ek olarak23 ve kontamine gıda ürünleri12,24,25,26, kan transfüzyonu ve organ nakli ile iletim demümkündür 27,28. HEV karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliği nin sık görülen bir nedenidir29 özellikle önceden var olan karaciğer hastalığı olan hastalarda, bağışıklık sistemi zayıf bireylerde (genotip 3, 4 ve 7) ve gebe kadınlarda (genotip 1). Not, hematopoetik hastalık30gibi ekstrahepatik belirtileri de vardır30 ,31,32, nörolojik bozukluklar33 ve böbrek hasarı34.
Bugüne kadar, off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok enfekte hastalar için tercih edilen tedavi35,36. Ancak, tedavi başarısızlığı ve kötü klinik uzun vadeli sonuçlar vakaları bildirilmiştir. Tedavi yetmezliği viral mutagenez ve kronik enfekte hastalarda artmış viral heterojenite ile bağlantılı olmuştur37,38,39. Aksine, yakın zamanda yapılan bir Avrupa retrospektif çok merkezli çalışma da polimeraz mutasyonlarını RBV tedavi yetmezliği40ile ilişkilendiremedi. Klinik gözlemler ve in vitro deneylerde, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, çinko tuzları 46 ve silvestrol47 47,48 de antiviral etkileri göstermiştir. Bununla birlikte, hev yaşam döngüsü ve patogenezi hakkında bilgi eksikliği engel, belirli bir HEV tedavisi bulunabilir kalır. Bu nedenle, virolojik çalışmalar ve yeni antiviral ilaçların geliştirilmesi için sağlam bir hücre kültür sistemi acilen ihtiyaç vardır49.
Ne yazık ki, diğer hepatit virüsleri gibi, HEV konvansiyonel hücre hatlarında yaymak zordur ve genellikle çok yavaş düşük viral yüklere yol ileir. Yine de, bazı gruplar hücre hattı subklonlar üretimi tarafından viral yükleri artırmak başardık50 veya medya takviyeleri ayarı51. Son zamanlarda cDNA klonlar üretimi52 ve primer hastanın adaptasyon geçerek izole53,54 hücre kültüründe daha iyi HEV yayılımı55. Bu protokolde, kernow-C1 suş adapte bir hücre kültürünün genomu kullanılan (p6_WT olarak anılacaktır)54 ve bir mutant suş bir çoğaltma arttırıcı mutasyon barındıran (p6_G1634R olarak anılacaktır)37. Kernow-C1 HEV hücre kültüründe en sık kullanılan suşudur ve yüksek viral yükler üretebilme yeteneğine sahiptir. Viral RNA kopya sayıları değerlendirilerek, HEV replikasyonu in vitro olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknikler üretilen enfeksiyöz partikül sayısının değerlendirilmesini izin vermez. Bu nedenle Odak Şekillendirme Birimlerini (FFU/mL) belirlemek için immünoresans boyama sistemi kurduk.
Burada açıklanan yöntem56 birincil hücreler ve memeli hücre hatları da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden hücre türleri çeşitli enfekte yeteneğine sahip tam uzunlukta bulaşıcı viral parçacıklar üretmek için kullanılabilir. Bu HEV enfeksiyonu ve tropizm önemli yönlerini deşifre etmek için temel bir ön koşuldur. Genellikle sınırlı hasta izole ile aşılama için gerek yoktur. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü nispeten verimli kılar. Buna ek olarak, bu sistem in vivo tanımlanan genom değişimi ve HEV replikasyon ve fitness üzerindeki etkileri çalışma sağlayan ters genetik için kullanılabilir. Bu teknik birçok sınırlamanın üstesinden gelmekte ve ilaç gelişimi, mutagenez çalışmaları ve kısıtlama veya giriş faktörleri gibi virüs-konak etkileşimlerinin değerlendirilmesi için yol olabilir.

<table><tbody><tr><td>0.45 ve mikro; m mesh</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td>Hücre dışı Virüs hasadı</td></tr><tr><td>%4 Histofix</td><td>CarlRoth</td><td>P087.4</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>CarlRoth</td><td>6755.1</td><td>Kollajen çalışma solüsyonu</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore UFC910024</td><td></td><td>Virüs toplama</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>Dönüştürülmüş seçimi bakteri</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td> in vitro transkripsiyon ve elektroporasyon</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Şekil Üretimi</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Kollajen R çözeltisi %0,4 steril</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Kollajen çalışma solüsyonu</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Roche</td><td>11140922001</td><td> in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Biorad</td><td>165-2088</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>41965-039</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td> in vitro transkripsiyonuna</td>dahil</tr><tr><td>edilmiştir EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td> Escherichia coli JM109</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td>Dönüşüm</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>gibco</td><td>10270106</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>GenePulser Xcell Elektroporasyon Sistemi</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>gibco</td><td>15710049</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>11140957001</td><td> in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Braun</td><td>184238001</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-03</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>16050122</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>K2HPO<>sub4</td><td>Roth</td><td>P749.1</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>gibco</td><td>25030081</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>L-Glutatyon indirgenmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5G</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>MEM</td><td>gibco</td><td>31095-029</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100 kez;)</td><td>gibco</td><td>11140-035</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>Cytomix Mikrovolume UV-Vis spektrofotometresi NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>DNA/RNA konsantrasyonu</td></tr><tr><td>MluI enzimi</td><td>NEB</td><td>R0198L</td><td>Doğrusallaştırma</td></tr><tr><td>NEB tamponu</td><td>NEB</td><td>, R0198L</td><td>Doğrusallaştırmaya</td> dahildir</tr><tr><td>NucleoSpin Plazmid kiti</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740588.250</td><td>Plazmid hazırlama</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Temizleme Kiti</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740948.250</td><td>RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>70011051</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Tam uzunlukta HEV genomunu kodlayan plazmid (p6_G1634R)</td><td>Todt et.al</td><td></td><td>Virüs üretimi</td></tr><tr><td>Tam uzunlukta HEV genomunu kodlayan plazmit (p6_WT)</td><td>Shukla et al.</td><td>GenBank katılım no. JQ679013</td><td>Virüs üretimi</td></tr><tr><td>Birincil antikor 1E6</td><td>LS-Bio</td><td>C67675</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Birincil antikor 8282</td><td></td><td></td><td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Enstitüsü, Almanya</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>DNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Ribo m7G Kapağı Analog</td><td>Promega</td><td>P1711</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>RNase uzakta</td><td>CarlRoth</td><td>A998.3</td><td>RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>RNasin (RNaz inhibitörü)</td> <td>Promega</td><td>N2515</td><td> in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>İkincil antikor eşek anti-fare 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>İkincil antikor keçi anti-tavşan 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Sodyum Pirüvat</td><td>gibco</td><td>11360070</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Transkripsiyon Tamponu</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td> in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CarlRoth</td><td>3051.3'e</td> <td>dahildirİmmünofloresan</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.5)</td> <td>gibco</td><td>15400054</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>ultra düşük IgG</td><td>gibco</td><td>1921005PJ</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td></td><td>UTP Roche</td><td>11140949001</td><td> in vitro transkripsiyon</td></tr></tbody></table>

yüksek titer hepatit e virüs stokları Üretmek için bir hücre kültürü modeli

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hepatit E virüsü karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliğinin önde gelen nedenidir ve dünya çapında yaygınlığı artmaktadır. Tek iplikçikli RNA virüsü ağırlıklı olarak kan transfüzyonu, yetersiz sıhhi koşullar ve kontamine gıda ürünleri ile bulaşır. Bugüne kadar off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok hasta için tercih edilen tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, belirli bir HEV tedavisi tespit edilmeyi sürdürebilir. Şimdiye kadar, HEV yaşam döngüsü ve patogenez hakkında bilgi ciddi verimli bir HEV hücre kültür sisteminin eksikliği nedeniyle engel olmuştur. Güçlü bir hücre kültür sistemi de viral patogenez içeren viral yaşam döngüsünün çalışma için gereklidir. Burada açıklanan yöntemle 3 x 106 odak şekillendirme ünitesi/mL(FFU/mL) zarfsız HEV ve 5 x 104 FFU/mL'ye kadar zarflı HEV viral titreler üretilebilir. Bu parçacıkları kullanarak, birincil hücreler ve insan da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden gelen hücrelerin çeşitli enfekte etmek mümkündür, yanı sıra hayvan hücre hatları. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü son derece verimli hale getirir.

Bu protokolde, yüksek titreen enfeksiyöz HEVcc üretimini açıklıyoruz. İlk adım plazmid DNA izole etmektir (pBluescript_SK_HEVp654 ve pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Şekil 8a), daha sonra kısıtlama sindirim tarafından doğrusallaştırılmış ve in vitro transkripsiyon için saflaştırılmış (Şekil 1). Başarılı bir doğrusallaştırma jel elektroforez kullanılarak sindirilmiş olmayan plazmid-DNA ile sindirilmiş plazmid-DNA karş...

Burada açıklanan hepatit E virüsü (HEV) yüksek viral titresi üretmek için nasıl etkili bir yöntemdir verimli hepatoma hücreleri enfekte etmektir. Sunulan yöntemle, hem zarfsız, hem de zarflı viral parçacıklar hasat edilebilir ve çeşitli hücre hatları aşılamak için kullanılabilir.

Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Hepatit E virüs araştırmaları, etkin bir hücre kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmiştir. Tekniklerimiz bu sınırlamaların üstesinden gelerek ilaç tasarımı ve aşı geliştirmenin önünü açarak. Bu protokol ile, çeşitli hücrelerin enfeksiyonunu kolaylaştırarak, hem zarf dışı hem de zarf hev partiküllerinin enfeksiyöz yüksek titrevirüslerini üretebiliyoruz.Bu protokolün uygulanması için bsa-2 tesisine erişim ve temel hücre kültürü teknikleri ile deneyim gerekir. Plazmid DNA'sını doğrusallaştırmak için şablon DNA'sının 10 mikrogramını 10 mikrolitre tampon ve iki mikrolitre Micrococcus luteus restriksiyon enzimiyle karıştırın ve son hacmi suyla birlikte 100 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra 37 santigrat derece bir saat için çözüm kuluçka ve standart protokollere göre agarose jel elektroforez ile plazmid doğrusalizasyon onaylamak.Plazmid DNA izolasyonu ve lineerizasyondan sonra, doğrusallaştırmanın başarısı sindirilmemiş plazmid DNA'sı jel elektroforezile sindirilmiş plazmid DNA'sı ile karşılaştırılarak doğrulanabilir. Saflaştırılmış, tam uzunlukta hepatit E virüs DNA'sının in vitro transkripsiyonu için, doğrusaldna şablonunun iki mikrogramını uygun reaktiflerle karıştırın ve çözeltinin son hacmini 100 mikrolitreye getirmek için çekirdeksiz su kullanın. Iyice karıştırdıktan sonra, 37 santigrat derece iki saat boyunca çözelti kuluçka.İki saat sonra, tüpe iki mikrolitre T7 RNA polimeraz ekleyin. Sonra reaksiyonu karıştırın ve tüpü 37 derecede iki saat daha kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 7,5 mikrolitre DNA ile ilk DNA şablonunu 30 dakika boyunca 37 derece boyunca iyice karıştırArak ve kuluçkaya yatırArak sindirin.Ekstraksiyondan sonra, standart protokollere göre agarose jel elektroforezi ile RNA bütünlüğünü ve verimini dikkatlice kontrol edin. Düşük RNA bolluğu durumunda bulanık yayma yerine farklı bantlar gözlenmelidir. Bazı adımlar hızlı yürütme ve bu nedenle ayrıntılı hazırlık gerektirir.Ayrıca, RNA bütünlüğü ve hücre canlılığı için özel dikkat edin. Hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs üretimi için insan karaciğer kanseri hücreleri hazırlamak için, 15 santimetre kollajen kaplı kültür çanak üzerine tam DMEM 20 mililitre hücreleri tohum ve 37 santigrat derece de inkübat onlar% 90 biraraya ulaşana kadar. Kültürün sonunda, hücreleri hücre kültür plakasından 37 santigrat derecede %0.05 Tripsin-EDTA ile ayırmadan önce 10 mililitre PBS ile yıkayın.Tam DMEM 10 mililitre müstakil hücreleri resuspend ve sayma için 50 mililitrekonik tüp içine hücreleri aktarın. Altı hücreye beş kez 10'u yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri yıkama başına 35 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, supernatant çıkarmadan buz hücreleri yerleştirin.Hedef hücrelerin elektroporasyonu için, iki milimolar ATP ve beş milimolar glutatyon ile sitomix ek 384 mikrolitre, daha sonra daha fazla kullanım akadar buz üzerinde saklamak. Supernatant'ı 400 mikrolitre çözeltinin tamamıyla dikkatlice değiştirin. Hücrelere saflaştırılmış viral genomik RNA beş mikrogram ekleyin ve 20 milisaniye için 975 mikrofarad ve 270 volt elektroporasyon için dört milimetrelik bir cuvette hücre süspansiyon aktarın.Elektroporasyondan sonra, hücreleri mümkün olan en kısa sürede 11 mililitre tam DMEM'e aktarmak için pasteur pipeti kullanın ve 10 mililitre elektroporated hücreyi kollajenle kaplanmış 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, kollajen kaplı 24 mikrotiter plaka bir kuyuda bir kapak kayma üzerine orta 300 mikrolitre beşinci hücrelere 1,3 kez 10 ekleyin ve 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka ve çanak yerleştirin. Ertesi gün, taze DMEM 10 mililitre ile çanak supernatant değiştirin ve ek bir altı gün için hücre kültürü kuluçka için çanak dönmek.Beşinci günden 7'ye kadar, hücre yoğunluğuna bağlı olarak, transfeksiyon kontrolünün immünororesan boyamasını gerçekleştirerek, hedef proteini ifade eden hücre sayısının toplam hücre sayısına normalleştirilmesini sağlar. Başarılı elektroporasyon transfeksiyon kontrolünün immünoresan boyama ile izlenebilir. Transfeksiyon verimliliği aşmalıdır 40% Bir çoğaltma eksik mutant boyama özgüllüğünü doğrulamak için olumsuz bir kontrol olarak hizmet verebilir.Hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs partiküllerini hasat etmek için, altıncı günde, süpernatant'ı 0,45 mikrolitrelik bir kafesten filtreleyin, herhangi bir hücre enkazını çıkarın ve hasat edilen hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüsünü dört santigrat derecede saklayın. Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık hasadı için, hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 1,5 mililitre ile 37 santigrat derecede %0,05 Tripsin-EDTA ile ayırın. Hücreler ayrıldığında, 8.5 mililitre DMEM ile reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu santrifüj için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tek tek iki mililitre reaksiyon tüpleri için elektroporasyon başına tam orta 1.6 mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için orta 800 mikrolitre kullanın, böylece tüplere hücreleri aktarArak. Hücreleri sıvı nitrojenle dondurun ve daha sonra yüksek hızda 10 dakika 10 dakika boyunca 10 dakika, 000 kez g'de santrifüj etmeden önce hücreleri buzüzerinde üç kez eritin. Sonra eksi 80 santigrat depolama için hücre enkaz pelet rahatsız etmeden yeni tüpler içine supernatants aktarın.Yeni üretilen intra ve ekstrasellüler hepatit E virüs stoklarının titrelerini değerlendirmek için, kollajen kaplı 96 kuyulu mikrotiter plakanın 60 merkez kuyusuna her 100 mikrolitre mem başına dört hücreye iki kez 10 tohum tohumu ve en dış kuyuları kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile doldurun. 37 santigrat derecede 24 saat sonra, hücrelerin ilk satırına 50 mikrolitre ekstrasellüler virüs parçacığı ekselansları ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, seri hücrelerin son satırına kadar yinelenen hücrelerin önceki bir sonraki satıra supernatant 50 mikrolitre aktararak kuyu başına bir ila üç konsantrasyon altı kez seyreltin.Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile hücreleri enfekte etmek için, hücrelerin üst satırına hücre içi virüs parçacığı supernatant 25 mikrolitre ekleyin ve seri olarak bir ila beş oranında hücreleri altı kez seyreltme önce iyice karıştırın 25 kopya seyreltme çoğaltılması olarak gösterilmiştir. Daha sonra yazıdaki protokole göre immünofloresan boyama önce yedi gün boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka ve immün boyama sonrasında, plakalar immünfloresans mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir.İmmünleledikten sonra hücre içi ve hücre dışı partiküllerin son titreci belirtildiği gibi uygun formül kullanılarak hesaplanabilir. Seri seyreltme ile hücre kültürü kaynaklı E virüs parçacıkları ile hedef hücre enfeksiyonu sonra, mililitre başına altı odak oluşturan birimleri bir kez 10 ila üç kez arasında titreler olmayan zarflı hücre içi hücre kültürü türevi hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte hücre kültürleri beklenebilir. Zarflı hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte kültürlerde, mililitre başına birim oluşturan dördüncü odak 10 bir kez 10 ve bir kez arasında titrebekleniyor.Buna ek olarak, genom kopyaları ve zarfsız hücre içi enfeksiyöz virüs parçacıkları arasındaki oran tipik olarak hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık enfekte kültürleriçin gözlenenden daha düşüktür, bu da zarfsız hepatit E virüs türlerinin daha yüksek spesifik bir enfekteliği düşündürmektedir. Viral parçacık üretimi ve hedef hücre enfeksiyonu tam bir viral yaşam döngüsü gerektirir, ve virüs-host etkileşimleri içine yeni anlayışlar sağlayabilir. Bu protokol çoğaltma kinetik gerçekleştirmek veya enfeksiyon tahlilleri kullanılabilecek parçacıklar üretmek için değiştirilebilir.Araştırmalarımızın çoğu şu anda hem zarflı hem de zarfsız HEV'de bulunan enfeksiyöz partiküllere bağlıdır. Ve tekniklerimizi kullanan makaleler şu anda yayınlanmaktadır.

a-cell-culture-model-for-producing-high-titer-hepatitis-e-virus-stocks

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Bu videoda, rekombinant bir HBV raportör sistemi aracılığıyla hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonunu tespit etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri enfekte ettikten sonra, rekombinant viral genom, substratını oksitledikten sonra biyolüminesans üreten lusiferaz raportör enzimini eksprese eder - viral enfeksiyonu tespit etmeye yardımcı olur.

Viral Enfeksiyonun Tespiti için İn Vitro Rekombinant Virüs Raportör Sistemi

Hepatit C Virüsü (HCV), siroz ve kanser dahil olmak üzere karaciğer bozukluklarına neden olan önemli bir insan patojenidir. HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi, HCV replikasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir. Burada, HCV replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmak için bir protokol açıklıyoruz.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Öğrenin, hepatit E virüsü için yüksek titerli stok üretme yöntemini. Bu hücre kültürü protokolü, zarflı ve zarfsız viral parçiklerin elde edilmesini sağlar.

Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Daha fazla video keşfet