İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

ABH'de mikroRNA'nın değişmiş ekspresyonu biyobelirteç ve tedavi için yararlı olabilir. Bu protokol basittir ve laboratuvarlar arasında sürekli sonuçlar elde edilmesini sağlar. Böbreğin IRI'si, ABH için en önemli risk faktörlerinden birini temsil eder. IRI tarafından değiştirilen mikroRNA'ların ölçülmesi tanıya yol açar. Böbrek örneğinden saflaştırılan mikroRNA'lar başka bir sisteme uygulanır. İşlem boyunca hipotermi, bağırsak nemlendirmesi ve anestezi derinliğini dikkatlice izleyin. Bunun nedeni, alışmak için birçok manuel teknik olmasıdır.

[Ekran Okuyucusu] Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. Orta hatta abdominal bir kesi yaptıktan sonra, sağ böbrek ve üreteri ortaya çıkarmak için bağırsağı ekstra karın boşluğunun sol tarafına nazikçe itmek için PBS ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın ve sağ üreteri kaldırmak için açılı forseps kullanın. 4-0 ipek örgülü dikişlerle üreteri iki yerden bağlayın, böbreğe daha yakın olan dikiş için daha uzun bağlar bırakın ve dikişler arasından kesin. Kalan dikişi dikkatlice tutarak, böbrek boyunca bağ dokusunu ve yağı kör bir şekilde inceleyin ve sağ böbreğe kan sağlayan renal arterler veya damarlar olmayan bir kan damarı belirleyin. Damarı bağlayın ve sağ böbrek yeterince ayrıldığında, böbrek damarını ve arteri bağlayın. PBS ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak, sol böbreği açığa çıkarmak ve bağırsağı nemli bir örtü ile kaplamak için bağırsağı ekstra karın boşluğunun sağ tarafına doğru hafifçe itin. Sol böbreği gösterildiği gibi hazırladıktan sonra, sol böbrek iskemisini indüklemek için böbrek arterini ve damarını böbrekten bir santimetre uzakta klempleyin. Başarılı bir iskemi, böbrek dokusunun kademeli olarak homojen bir şekilde kararması ile görsel olarak doğrulanabilir. İskemi doğrulandığında, bağırsak dokusunu karın boşluğuna geri koyun, bağırsak bükülmesini önlemeye dikkat edin ve karın derisini geçici olarak kapatın ve örtün. 25 ila 45 dakika sonra, kelepçeyi çıkarın ve kan akışı reperfüzyonunun ve böbrek renginin iyileştiğini onaylayın. Bağırsağın bükülmediğini doğruladıktan sonra, intraperitoneal PBS'yi aşılayın ve karın kasını ve cildi 4-0 naylon dikişler kullanarak iki kat halinde kapatın. İskemik yaralanma indüksiyonundan 24 saat sonra, orta hat insizyonunu tekrar açın ve inferior vena kavadan kanı almak için 27 gauge bir iğne kullanın. Göğüs duvarında orta hat insizyonu yapın ve sol ventriküle 23 gauge iğne sokun. İğneye geri akışı onayladıktan sonra, karaciğerin sağ lobunda bir kesi yapın ve 20 mililitre PBS enjekte edin. Karaciğer kırmızıdan pembeye dönecek ve yeterli kanın boşaltıldığını onaylayacaktır. Sol böbreği çıkarmak için forseps ve makas kullanın ve eksize edilen dokuyu bir PBS kabında yıkayın. Daha sonra böbreği kurutmadan böbrek fasyasını çıkarmak için forseps kullanın ve böbreği dikey orta hat boyunca ikiye bölün. MikroRNA saflaştırması için, 30 miligram donmuş böbrek örneğini buz üzerinde 700 mikrolitre fenilguanidin bazlı lizis reaktifi içeren bir cam homojenizatöre koyun ve numuneyi tamamen homojenize etmek için havaneli yavaşça ve tekrar tekrar çevirin. Doku tamamen ayrıştığında, homojenize lizatı iki mililitrelik bir toplama tüpünde bir mikro santrifüj döndürme kolonunda biyopolimer parçalama sistemine aktarın ve numuneyi santrifüjleme ile tüpün dibine toplayın. Lizatı 140 mikrolitre kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü, kapak sıkıca sıkılmış olarak 15 saniye boyunca ters çevirerek karıştırın. Oda sıcaklığında iki ila üç dakikalık bir inkübasyondan sonra, numuneyi santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanı, peleti bozmadan hacmin 1,5 katı %100 etanol içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Numunenin 700 mikrolitresini iki mililitrelik bir toplama tüpünde silika membran bazlı bir spin kolonuna aktarmadan önce numuneyi girdaplayarak beş saniye karıştırın. Kısa bir santrifüjlemeden sonra, akışı atın ve tuz izlerini gidermek için numuneyi yıkama başına 500 mikrolitre yıkama tamponu 2 ile yeni bir silika membran bazlı döndürme kolonunda iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, silika membran bazlı spin kolonunu tekrar santrifüjleyin ve akışı attıktan sonra kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne aktarın. Kolona 25 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin ve numuneyi tekrar santrifüjlemeden önce oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra 25 mikrolitrelik mikroRNA içeren eluiti yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu çalışmada, akut böbrek hasarı olan farelerin böbreklerinde yukarı regüle edilen insanlarda eksprese edilen yedi mikroRNA araştırıldı. MikroRNA'ların altısının seviyelerinin, iskemi reperfüzyon hasarı olan farelerin böbreklerinde, gösterildiği gibi kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanan sahte farelerdekilere kıyasla önemli ölçüde arttığı bulundu. Serum kan üre azotu ve kreatinin seviyeleri ve akut tübüler nekroz da önemli ölçüde yukarı regüle edildi.

İri tanısı ve ABH'nin spesifik tedavisi için biyobelirteçler belirsizliğini korumaktadır. MikroRNA araştırmalarının ilerleyeceğini ve ABH tanı ve tedavisine katkıda bulunacağını umuyorum.