Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi

Bu yöntem, böbrek fibrozisi gibi çok çeşitli patolojik rahatsızlıkları olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonu sağlamayı mümkün kılmasıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, zaman kazandırır ve teknik hatayı önleyen basit bir işlem kullanarak mikroRNA ifade profillemesini yüksek doğruluk ve hassasiyetle mümkün kılmasını sağlamasıdır. Sahte cerrahi gerçekleştirmek için, karın deride bir kesi yapmak ve kaburga sol alt kenarına mesane kas ve periton zarı kesmek için cerrahi makas ve cımbız kullanın.

PBS ile iki pamuklu bez nemlendirin ve dikkatle yan bağırsakçekin. Sol böbrek ve üreter tanımlamak için nemlendirilmiş bezleri yerleştirin. Periton zarını kapatın ve ardından kesiyi 4-0 naylon ile kapatın.

Tek taraflı üretral obstrüksiyon, ya da UUO gerçekleştirmek için, karın deride bir kesi yapmak ve sahte cerrahi için gösterildiği gibi kas ve periton zarı kesti. Farenin altına 2,5 mililitrelik bir şırınga yerleştirin. PBS ile iki pamuklu bez nemlendirin, sonra cımbız ile dikkatle yan bağırsakçekin ve sol üreter tanımlamak için bezleri yerleştirin.

Sol böbreği kaldırmak için cımbızkullanın. Yaklaşık bir santimetre arayla iki yerde sol üreter inilemek için 4-0 ipek kullanın. İki ligasyonun merkez noktasında üreteci kesin ve sonra periton zarını ve kesisini kapatmak için 4-0 naylon dikiş kullanın.

Periton zarını kestikten sonra, daha önce de gösterildiği gibi, cımbızla kaldırın ve üst kenarda yan lara doğru bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın, sonra kaburgaların en alt kenarı boyunca kesi devam edin. Sol böbreği belirleyin ve böbrek sarı-beyaz olana kadar PBS ile reflü. Cerrahi makas ile sol böbrek arter ve ven keserek böbrek çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin, sonra PBS ile dikkatlice yıkayın.

Cerrahi makas ve cımbız ile yaklaşık 10 miligramlık örnekler halinde böbreği kesin, böbreğin her bir parçasını kendi 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne koyun ve tüpün kapağını kapatın. Silikon homogenizer bir böbrek örneği koyun ve fenil / guanidin bazlı lizis reaktif 700 mikrolitre ekleyin. Homogenizer'in zararlısını böbrek örneğine doğru yavaşça bastırın ve bükerek homojenize edin.

Numune lysis reaktifinde tamamen eriyene kadar presleme ve bükümtekrarlayın. Numuneyi daha da homojenize etmek için homojenize edilmiş lysat'ı biyopolimer spin sütununa aktarın ve 14.000 kez G'de üç dakika döndürün, sonra çökelmiş lysate'yi kullanılmayan 1,5 mililitrelik mikrosentrifüge tüpüne aktarın. Tüpteki lysat'ı 140 mikrolitre kloroform ile birleştirin ve tüpü sıkıca kaplayın.

Lysat ve kloroformu karıştırmak için tüpü 15 kez ters çevirin. Örnekleri oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçkaya yatırın, sonra 12,000 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Çökeltiyi bozmadan, süpernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın ve %100 etanol hacminin 1,5 katını ekleyin.

Karışımı beş saniye boyunca girdaplayın. Numunenin 700 mikrolitresini iki mililitrelik toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa yükleyin. Sütun kapağını kapatın ve 15,000 kez G sütunu döndürün, sonra toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.

İki mililitrelik toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa 700 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek numuneyi iyice yıkayın. Sonra santrifüj tekrarlayın ve toplama tüpü atmak. Yıkama başına iki yıkama tampon u 500 mikrolitre ile yıkama iki kez tekrarlayın.

Son yıkamadan sonra, membran alamış spin kolonu 15, 000 kez G'de iki mililitrelik bir toplama tüpünde bir dakika boyunca döndürün ve çökelmiş lysate'yi atın. Membran bağlantılı spin kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Sütuna 30 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyerek toplam RNA'yı çözün, sütun kapağını kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin.

Sonra bir dakika için 15,000 kez G sütun döndürün. Toplam RNA içeren numuneyi buz üzerindeki yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve spektrofotometri ile toplam RNA konsantrasyonu ölçün. El yazması yönlere göre bir ana karışım çözeltisi hazırlayın ve sekiz kuyulu bir tüp şeridinin her tüpüne sekiz mikrolitre ekleyin.

Toplam RNA yoğunluğunu ayarladıktan sonra, her tüpe toplam RNA'dan 12 mikrolitrelik bir aliquot yerleştirin ve kapağı kapatın. Tüpleri 15 saniye santrifüj edin. Tüpleri termocycler'a koyun ve 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.

Bittiğinde, cDNA sentezi için 95 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. CDNA'yı 1,5 mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpe aktarın ve distile suyla 10 kez seyreltin. Girdap ve beş saniye için tüp santrifüj, sonra metin el yazması açıklandığı gibi, nicel gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Bu protokol, 20-25 gram ağırlığındaki sekiz haftalık erkek farelerde sol üreteral ligasyon yoluyla tek taraflı üretral obstrüksiyon fare modeli oluşturmak için kullanılmıştır. Üreterler 4-0 ipek sütürile çift ligasyon ile tamamen tıkandı. Böbrekler ameliyat tan sekiz gün sonra toplandı.

MikroRNA qRT-PCR verileri, uuo farelerinin böbreklerinde mikroRNA 3070-3p seviyesinin anlamlı olarak arttığını ve kontrollere göre MikroRNA, 7218-5p ve mikroRNA 7219-5p seviyelerinin azaldığını göstermiştir. Bu protokolü denerken, iyi bir RNA ekstraksiyonu elde etmek için fenil/guanidin bazlı lisis reaktifinde tamamen eriyene kadar böbrek örneğini bükme yi tekrarlamayı unutmayın.