Travmatik Kanama, Konkontüzyon ve Nöroinflamasyon için Preklinik Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Serebral kontüzyonun eşlik ettiği intraparankimal kanama ve nöroinflamasyon ciddi ikincil beyin hasarını tetikleyebilir. Bu protokol, araştırmacıların kanama, kontüzyon ve travma sonrası bağışıklık tepkilerini incelemelerine ve potansiyel terapötikleri keşfetmelerine olanak tanıyan fare kontrollü bir kortikal etki (CCI) modelini detaylandırır.

Bu model, intrakraniyal kanama, demir toksisitesi, nöron ölümü, aksonal yaralanma, nörolojik defisit ve nöral inflamasyon dahil olmak üzere serebral kontüzyon ile ilişkili patolojileri incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, CCI cihazı üzerindeki çarpmanın hızı ve ölümü gibi biyokimyasal parametrelerin manipüle edilmesiyle beyin hasarının ciddiyetinin kolayca kontrol edilebilmesidir. CCI'nin neden olduğu fokal kortikal kırılma yaralanması yüksek oranda tekrarlanabilir.

Uygun stereotaktik teknik ve kraniyotomi prosedürü, stabil ve tekrarlanabilir CCI ile indüklenen beyin hasarı oluşturmada ana belirleyicilerdir. Genel olarak, prosedüre yeni başlayan araştırmacı, fareyi steriotexic çerçeveye stabilize etmek ve uygun kraniotomi yapmakla mücadele edecektir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Bayan Jhih Shuan Lin olacak.

Uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olmak için hayvanda ayak parmağı kıstırma refleksi eksikliğini onaylayarak başlayın. Farenin kafasını elektrikli makaslarla kaudal - rostral yönde tıraş edin. Ancak bıyıkları kesmeyin.

Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin ve kulak çubuklarını dikkatlice kulak kanallarına yerleştirin, fare kafasının her iki kulak çubuğu tarafından eşit şekilde sabitlendiğinden emin olun. Ameliyat süresince anesteziyi %1 ila %2 izofluran arasında tutun. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için her iki göze de vazelin sürün.

Daha sonra traşlı kafayı betadin ve ardından %70 etanol ile dezenfekte etmek için steril pamuklu çubuklar kullanın. 100 mikrolitre% 0.25 Bupivakain'i 31 gauge insülin iğnesi ile deri altına uygulayın ve daha iyi emilim için enjeksiyon bölgesine hafifçe masaj yapın. Bir neşter veya makasla kafa derisinin orta hattı boyunca uzunlamasına bir kesi yapın.

Daha sonra cildi sağ tarafa çekmek için bir hemostat kullanın. Açıkta kalan kafatasının bir dakika kurumasını bekleyin. Ardından kafatasındaki kalan kan ve dokuları steril bir pamuklu çubukla temizleyin.

Hayvanın kafasının yatay düzlemde düz olup olmadığını kontrol edin ve anatomik yer işaretleri olan Bregma ve Lambda'yı tanımlayın ve her iki yeri de bir kalemle işaretleyin. Hem Bregma hem de Lambda'nın Z koordinatlarını ölçerek hayvanın başının rostral-kaudal yönde düz olduğundan emin olun. Kafayı yatay olarak konumlandırmak için aynı prosedürü kullanın.

Kraniektomi bölgesini belirlemek için 31 gauge insülin iğnesi kullanın. XY orijinini Bregma olarak ayarlayın ve iğneyi yanal olarak üç milimetre sağa hareket ettirin. Bu pozisyonu kraniektomi bölgesi olarak işaretleyin ve kafatasının üzerine bir kalemle dört milimetre çapında bir daire çizin.

Dört milimetre çapında açık bir delik oluşturmak için trephine ile yüksek hızlı bir mikro matkapla kalemle çerçevelenmiş daire boyunca kesin. Kemik flebini bir cımbızla çıkarın ve buz gibi, normal tuzlu suda saklayın. Kanamayı durdurmak için beyin yüzeyine baskı uygulamadan önce deliği tuzlu su ile nazikçe durulayın.

CCI cihazında 2.5 milimetre çapındaki yuvarlak çarpma tertibatı ucunu 22.5 derecelik bir açıya ayarlayın. Darbe ucunu dural yüzeye sıfırlayın ve kontrol kutusundaki darbe parametrelerini saniyede dört metre hıza ve iki milimetre deformasyon derinliğine ayarlayın. Metal ucu geri çekin.

Beyinde çarpma oluşturmak için pistonu boşaltın. Ardından kanamayı durdurmak için yaralı bölgeye steril bir pamuklu çubuk yerleştirin. Kemik flebini değiştirin ve diş çimentosu ile sabitleyin.

Kafa derisini doku yapıştırıcısı ile kapatın. Fareyi ısı lambasının altına, tamamen iyileşene kadar yataklı temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin. Uygun stereotaktik teknik ve kraniektomi prosedürü, stabil ve tekrarlanabilir CCI ile indüklenen beyin hasarının oluşturulmasında majör belirleyicilerdir.

İdeal bir kraniektomi prosedürü, sahte olarak ameliyat edilen beyinde minimal histolojik hasara neden olur. CCI'dan sonra 1, 3, 7 ve 28. günlerde beyin hasarı ve korpus kallozum kaybında değişiklikler gözlendi. Ek olarak, kontüzyon tarafında tek taraflı beyin atrofisi, CCI sonrası 28. günde görüldü.

Nöroinflamasyon, kontüzyon alanının sınırında Iba1 pozitif aktive mikroglia ve makrofaj birikimi ile ortaya çıktı. İntraparenkimal kanama, CCI sonrası bir ila yedi gün arasında Ly76 pozitif boyama ile de tespit edilebilirdi. CCI'den sonraki yedinci günde, yırtılmış ve sağlam hücre morfolojisine sahip kırmızı kan hücrelerinin bir karışımı gözlendi, bu da RBC'lerin bu aşamada parçalandığını düşündürdü.

Bu fenomen, kontüzyon bölgesinde CCI sonrası yedi ila 28. günler arasında ferrik demir birikiminin tespit edilebilir olduğu gözlemiyle tutarlıydı. CCI sonrası üç ila 28. gün arasında kontüzyon bölgesinden uzaktaki striatumda aktive edilmiş mikroglia ve makrofajlar gözlendi, bu da korpus kallozum ve striatal yaralanmaları gösteriyor. Bu teknik, araştırmacının kanama kontüzyonu sonrası mikroglia gibi bağışıklık hücrelerinin tepkisini anlayarak beyin kanamasına bağlı nöroinflamasyon etkileşimini daha fazla keşfetmesinin yollarını açar.