Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Selam. Yani bu küçük bir RNA kuzey protokolü. Dr. Rashid Akbergenov tarafından optimize edilmiş bir protokol türevi.

Bu yöntemde, bir uzunluğu 20-24 nükleotit arasında herhangi bir yerde küçük RNA'lar tespit edebilirsiniz, çok hassas ve çok yüksek çözünürlükte. Protokol temelde geleneksel Kuzey analizinin değiştirilmiş bir şekli, ama burada, akrilamid yüzdesi oldukça yüksek, yüzde 15. Bu kuzey zaten bilinen küçük RNA algılamak için kullanılabilir, mikro RNA veya küçük RNA diğer kümesi, sırası bilindiğinde ya da yeni nesil sıralama veri kümeleri gelen küçük RNA bolluğu onayı için kullanılabilir.

Bu yöntemin avantajı, bir sadece mikro RNA bolluk bakamaz, ama aynı zamanda öncüllerin bolluğu, örneğin mikro RNA birkaç yüz nükleotit uzun olabilir yaklaşık 30 bir öncül dışarı bırakabilir, bu da aynı anda tespit edilebilir, mikro RNA ile birlikte. Protokol çok basit, çok yalındır, ancak bu protokolün sonunda listelenen bazı kritik adımları gerçekleştirirken çok dikkatli olmak gerekir. 10 mL jel karışımının hazırlanması için 4,8 gram üre, 3,75 mL %40 Akrilamid çözeltisi ve 1 mL taze hazırlanmış 10X TBE, pH 8,2 ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.

Çözelti temiz görünene kadar karışımı bir su banyosunda ısıtarak üreyi tamamen çözün. Steril MilliQ su kullanarak hacmi 10 mL'ye çıkarın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun. Gerekli cihazı deterjanla yıkayın, artık TBE ve Akrilamid'i çıkarmak için hafifçe fırçalayın.

Daha fazla MilliQ su ile durulayın ve kurumasını bekleyin. Cam plakayı bir araya getirin, her ikisinin de aynı seviyede olduğundan emin olun. Süngerin üzerine sıkıca yerleştirin.

Jel karışımına 8 mikro litre TEMED ve %10 taze hazırlanmış APS'yi 80 mikro litre ekleyin. Yavaşça karıştırın ve monte plakalar için jel karışımı dökün. Jelin sızdırmaz olduğundan emin olun.

Taramayı dikkatlice yerleştirin. Jel yaklaşık 45 dakika polimerize sağlar. Jelin polimerizasyonundan sonra cam plakaları montajdan çıkarın.

Cam tabakları MilliQ su ile yıkayın. Ve onları çalışan kasete koy. Çalışan kaseti tankın içine yerleştirin.

Taze hazırlanmış 1X TBE, pH 8.2 dökün. Taramayı dikkatlice çıkarın. Tampon boruları borulayarak jel kuyularını iyice yıkayın.

Bu adım, üre çökeltilerini kuyudan uzaklar ve RNA'nın jel üzerinde düzgün çalışmasını kolaylaştırır. Herhangi bir tampon sızıntısı kontrol etmek için, cihazın kapağını kapatın ve 30 dakika boyunca 80 volt boş jel önceden çalıştırın. 10 mL yükleme boyası hazırlanması için, bromofenol mavisi 5 mg, ksilen siyanol 5 mg ağırlığında ve deioinised formamid 10 mL ekleyin ve iyice karıştırın.

Aliquot boya ve saklamak 4 derece daha fazla kullanım için. Aliquot 10 mikrogram toplam RNA steril 1.5 mL tüpler içine. RNA'nın kalitesinin

260:230 oranı ikiden büyük veya daha yakındır. Tüpü speedVac'ın içine yerleştirin ve numuneleri vakumlayın kurulayın. 8 mikro litrelik yükleme boyasında kurutulmuş RNA numunelerini yeniden askıya alın.

Örnekleri 98 derecede iki dakika ısıtın. Oda sıcaklığında bir dakika soğutun. Yükleme boyasında uygun yeniden süspansiyon sağlamak için soğutulmuş RNA numunelerini girdap.

Tüpleri çevirin. Serbest akan RNA almak için ısıtma, soğutma ve girdap adımlarını üç kez tekrarlayın. Jelin ön çalışmasını durdurun.

Kuyuların içindeki üre tortularını gidermek için, numuneyi yüklemeden önce kuyuları iyice yıkayın. Yeniden askıya alınan RNA örneklerini 98 derecede bir dakika ısıtın. Kılcal uçlu uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyulara yükleyin.

Hava kabarcıkları tanıtmaktan kaçının. Tüm numunelerin tam yükleme ve kapağı monte. Bromofenol mavisi tamamen çalışana kadar jeli 80 voltta üç saat veya çalıştırın.

Transfer için pozitif yüklü naylon membran kullanın. Cam plakanın boyutlarına kadar kesin. Sağ üst köşedeki membranı etiketle.

Membranı steril MilliQ su yüzeyine hafifçe yerleştirin, etiket tarafını su yüzeyine bakacak şekilde aşağıya doğru yerleştirdiğinden emin olun. Temiz bir tepsi alın ve elektro transfer için jel sandviç hazırlamak. Kasetin gri tarafını aşağı yerleştirin.

1X TBE'yi kaset seviyesinin biraz üzerine dökün. Lif yastığını 1X TBE'de önceden ıslavetin ve hava kabarcıklarını temizlemek için sıkın. İki parça lekekağıdını fiber ped boyutuna kadar kesin.

Bir parça leke kağıdını 1X TBE'de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıt üzerinde plastik bir pipet haddeleme hava kabarcıkları çıkarın. Önceden 1X TBE içinde leke kağıt başka bir parça ıslatın ve kaset üzerine koydu.

Hava kabarcıkları kaldırmak için üzerinde rulo. Şimdi sandviç kurulumu elektro transfer için hazır. Elektroforez tamamlandıktan sonra, çalıştırmayı durdurun ve kapağı cihazdan çıkarın.

Çalışan kaseti kurulumdan çıkarın. Çalışan kasetteki cam plakaları çıkarın. Jeli dikkatlice montajdan çıkarın.

İlk yüklenen RNA numunesi saağınıza doğru olacak şekilde lekekağıdının üzerine tökezle. Önceden ıslatılmış membranı 1X TBE'ye yavaşça batırın ve etiketlenmiş tarafa bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Membran ve jelin kurumasını izin vermeyin.

Hava kabarcığı kaldırmak için yavaşça üzerinde rulo. 1X TBE içinde lekeleme kağıt bir parça Daldırma ve membran üzerine yatıyordu. Hava kabarcıkları kaldırın.

Leke kağıt başka bir parça yerleştirin ve hava kabarcıkları kaldırın. Lif yastığını montajın üzerine sererek sandviçi tamamlayın. Kaseti sıkıca kapatın.

Trans-blot kasetini modüle yerleştirin. Tankı 1X TBE, pH 8.2 ile doldurun. Cihazın kapağını kapatın ve 4 derece veya soğuk bir odada bir gecede 10 volt transfer.

UV çapraz bağlantı hazır tutun ve elektro transferi tamamlanmadan hemen önce, 1200 ayarlayın. Aktarım tamamlandıktan sonra kaseti modülden çıkarın. Nemli membranı bir A4 levhaüzerine yerleştirin ve işaretli tarafı yukarı doğru yerleştirin.

120 mili joule'de 254 nanometre UV ışığı ile ışınlama ile RNA'yı membrana çapraz bağla. Çapraz bağlı leke dört derece de saklanabilir veya hibridizasyon için kullanılabilir. Tespit edilmesi gereken küçük RNA'ya tamamen ücretsiz bir sonda tasarla.

PNK enzimini kullanarak son etiket son beş asal ucunda probu etiket ve gösterildiği gibi bileşenleri birleştirmek. Reaksiyon karışımını 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka 30 dakika sonra reaksiyon karışımı ndan etiketsiz probları ayırmak için G-25 sütunkullanın.

Sondanın daha iyi etiketlemiiçin, g-25 sütunu kullanılmadan önce hazırlayın. Bir hibridizasyon şişesi içinde, üst bakan leke, RNA tarafı yerleştirin. Kullanmadan önce hibridizasyon arabelleği şiddetle karıştırın.

Içine hibridizasyon tampon 10 mL ekleyin ve hibridizasyon fırın içine hibridizasyon şişesi yerleştirin, rotasyon ile 35 derece korumak. 20 ila 30 dakika için ön hibridizasyon gerçekleştirin. Ön hibridizasyondan sonra şişeyi fırından çıkarın.

Etiketli sondayı melezleştirme arabelleğine yavaşça ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşturulmadığından emin olun. 12 saat boyunca rotasyon ile 35 derece fırın içinde leke kuluçka.

Melezlemeden sonra, şişeden hibridizasyon arabelleği kaldırın. Yıkama tampon-I kullanarak lekeleri hızlı bir yıkama gerçekleştirin. Bu adım, fazla hibritleştirme çözümlerini lekelerden kaldırmak için gerçekleştirilir.

Daha fazla yıkama tampon-I kullanarak 30 dakika boyunca 35 derece lekeler kuluçka. 30 dakika boyunca 35 derece tampon-II kullanarak başka bir yıkama gerçekleştirin. Lekeyı yıkadıktan sonra, bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve mühürleyin.

Bir kasetin içine yerleştirin ve 12 saat boyunca radyasyonsuz fosfo-imager ekranına maruz bırakın. Tayfun biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini algıla ve ImageJ yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin. Lekenin diğer problarla melezlenmesi için, resimli olduğu gibi sıyırma adımları gerçekleştirin.

Bu teknik ile bir mikro RNA bolluğu tahmin edebilirsiniz, hem de uzunluğu. Bu görüntüden, mikro RNA 397 ifadesi tüm örneklerde tespit edilebilir. Bu lekede, örnek bir bolluk milyonda yaklaşık 5 okur, yeni nesil sıralama verilerine göre, tekniğimizin de daha az bol mikro RNA'ları tespit edebildiğinizi düşündürmektedir.

Buna ek olarak, ImageJ niceleme yazılımı kullanarak, bir örnekler arasında mikro 397 ifadesini ölçebilirsiniz. Burada yükleme kontrolleri olarak U6 ve mikro RNA 168 kullandık. Deneyi yaparken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli adımlardan bahsedeceğim.

Numune hazırlama için kaliteli RNA kullandığınızdan emin olun. Numuneleri vakumlarken, fazla kurutmaktan kaçının. Yükleme boyasında RNA'nın yeniden askıya alınması çok önemlidir.

Serbest akan numune hazırladığından emin olun. Jel yüklenirken dikkatli olunmalıdır. Jel kuyuları yıkanmalı ve numune kuyuların içine düz bir çizgide yüklenmelidir.

Elektro transferi sırasında, membranın suya yayılması, 1X TBE daldırma hemen önce esastır, bu transferi artırır. Lekenin hibridizasyonu 35 derecede yapılmalıdır. Hibridizasyon fırınSıcaklığını koruyun.

Lekelerin tekrar tekrar kullanımı için membranlar 4 derece olarak saklanmalıdır. 2X SSE'de nemli tutulmalıdır. Diğer PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin niceliğini ve mikro RNA'ların boyutunun belirlenmesini sağlar.