Name: Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: Öğrenin, bitki mikroRNAlarını %15 akrilamid jel kullanarak yüksek çözünürlüklü RNA leke analizi ile saptama ve ölçme yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesi çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar radyoizotop için ev sahibi enstitü ve BRIT tarafından sağlanan radyasyon laboratuvarına erişim kabul. PVS laboratuvarı Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi, Tata Temel Araştırma Enstitüsü ve hibeler tarafından desteklenir (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/İsviçre/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden. MP DBT-Araştırma Associateship, DBT, Hindistan Hükümeti kabul eder.

1. %15 denaturing poliakrilamid jelin hazırlanması
<ol><li>Tartmak ve üre 4.8 g ekleyin, % 40 akrilamid 3.75 mL ekleyin: bisacrylamide (19:1) çözeltisi ve 1 mL 10x TBE pH 8.2 steril 50 mL tüp içine.</li>
	<li>60 °C'de bir su banyosu seti kullanarak üreyi berrak bir çözelti ye doğru çözün.</li>
	<li>Taze otoklavlı steril su kullanarak hacmi 10 mL'ye kadar makyajlayın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
	<li>Taze %10 (w/v) amonyum persülfat çözeltisi hazırlayın.</li>
</ol>2. Cam plakalar ve elektroforez ünitesinin montajı
<ol><li>Jel elektroforezi ve elektro-leke için gerekli tüm cihazları deterjanla yıkayın. Yavaşça artık tampon ve akrilamid kaldırmak için yumuşak bir sünger kullanarak ovmak, su ile durulayın ve onları kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Her iki cam plakayı bir araya getirin ve süngerin üzerine sıkıca yerleştirin. Bu kurulum için 1 mm kalınlığında bir plaka kullanın. Sızıntıyı önlemek için plakaların aynı seviyede olduğundan emin olun.</li>
	<li>10 mL jel karışımına 8 μL TEMED ve 80 μL taze hazırlanmış %10 (w/v) amonyum persülfat çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Gecikmeden, yavaşça karıştırın ve monte cam plakalar arasında dökün. Taramayı dikkatlice yerleştirin. Bu adımda hava kabarcıkları üretmekten kaçının.</li>
	<li>Jel yaklaşık 45 dakika polimerize izin verin.</li>
	<li>Jel çalışan kurulum içine yerleştirmeden önce steril su ile polimerize jel yıkayın.</li>
	<li>Plakaları çalışan kasetin içine monte edin ve taramayı nazikçe çıkarın.</li>
	<li>Tankın içine taze hazırlanmış steril 1x TBE, pH 8.2 dökün.</li>
	<li>Tuz kristallerini çıkarmak için tamponboruları borulayarak kuyuları dikkatlice yıkayın. Bu adım, RNA örneğinin jel üzerinde düzgün çalışmasına yardımcı olur.</li>
	<li>30 dakika boyunca 80 V'de ön çalıştırma yapın.</li>
</ol>3. Yükleme boyası ve numunelerinin hazırlanması
<ol><li>Jel yükleme boya 10 mL için, bromofenol mavi5 mg tartmak, ksilen siyanol 5 mg, dikkatle deiyonize formamid 10 mL ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Aliquot 10 μg toplam RNA steril 1.5 mL tüp içine ve bir speedvac kullanarak örnekleri kuru. Numuneleri aşırı kurutmayın.</li>
	<li>8 μL yüklemede RNA örneklerini yeniden askıya alın.</li>
	<li>Numuneleri 98 °C'de 2 dk ısıtın, RT'de 1 dakika serinleyin, girdap ta ve numuneleri 3 kez döndürün. Bu adım uygun geri süspansiyon için gereklidir ve bu da numunelerin eşit yüklenmesine yardımcı olur.</li>
</ol>4. Jel elektroforez
<ol><li>Ön çalıştırmayı durdurun ve numune yüklemesinden önce kuyuları yıkayın.</li>
	<li>Numuneleri 98 °C'de 1 dk ısıtın ve kılcal uçlu uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyuya yükleyin. İpucunu kuyunun dibine yerleştirin, böylece örnek kuyuda ince bir tabaka kaplar.</li>
	<li>Tüm numunelerin tam yüklemesi. RNA onyılı işaretçisini yüklemek için ekleyin.</li>
	<li>Bromofenol mavisi boya neredeyse tamamen çalışana kadar 80 V jel çalıştırın. Bromofenol mavisi 10 bp'de %15 denaturing akrilamid jeli ile çalışır.</li>
</ol>5. Elektro-blotting için hazırlık
<ol><li>N+naylon membranı cam plaka boyutlarına kesin ve sağ üst köşesindeki membranı HB kalemle etiketleyin.</li>
	<li>Membranı steril su yüzeyine hafifçe yerleştirin ve etiketli tarafa su yüzeyine bakacak şekilde yerleştirin. Önceden 15 dakika boyunca membran ıslatın.</li>
	<li>Fiber ped boyutlarına 4 adet lekeleme kağıdı I kesin.</li>
	<li>Kasetin gri tarafını temiz bir tepsiye yerleştirmek için jel sandviçi hazırlayın.</li>
	<li>Önceden lif pedi ısla ve kasetin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>Önceden ıslak bir parça blotting kağıt 1x TBE ve fiber ped üzerine yerleştirin. Kağıt üzerinde plastik bir pipet haddeleme hava kabarcıkları çıkarın. Önceden ıslak lekeleme kağıdı başka bir parça lay ve hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>Jeli çalışan kasetten dikkatlice çıkarın ve ilk yüklenen RNA numunesinin sağa doğru olması için sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Önceden ıslatılmış membranı 1x TBE'ye yavaşça batırın ve etiketlenmiş tarafa bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları kaldırmak için dışarı rulo.</li>
	<li>Leke kağıt bir parça daldırma, membran üzerine koymak ve hava kabarcıkları kaldırın. Leke kağıt başka bir parça Daldırma, sandviç kurulum üzerine yerleştirin ve hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>Kurulum üzerine önceden ıslak fiber ped yerleştirerek sandviç tamamlayın ve sıkıca kaset kapatın.</li>
	<li>Transblot kasetini modüle yerleştirin ve 1x TBE, pH 8.2'yi lekeleme işaretine kadar doldurun.</li>
	<li>10 V'de, gece boyunca 4 °C'de aktarın.</li>
	<li>Transferden sonra, nemli membranı bir kağıt levhaüzerine yerleştirin ve 254 nm UV ışığı (120.000 μjoules/cm²) ile ışınlama ile RNA'yı hemen membrana bağlayın. Çapraz bağlı leke belki daha fazla hibridizasyon için 4 °C'de depolanır.</li>
</ol>6. Radyoetiketli sonda hazırlanması
<ol><li>Tespit edilecek küçük RNA'nın tamamen tamamlayıcısı bir sonda tasarlayın.</li>
	<li>Tablo 1'deverilen tarife göre bileşenleri birleştirerek 5' ucunda32ATP (BRIT'den elde edilen) ƳP kullanarak son etiket.</li>
	<li>Yukarıdaki reaksiyon karışımını 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Üreticiprotokolüne göre sephadex G-25 sütunu kullanarak 32 ATP'denetiketlenmemişƳP ayrı bir şekilde sondadan ayırın.</li>
</ol>7. Lekenin hibridizasyonu
<ol><li>Çapraz bağlı leke, RNA tarafı bir hibridizasyon şişesi içinde üst bakan yerleştirin.</li>
	<li>Ultra hassas hibridizasyon tamponunu şiddetle karıştırın, 10 mL ekleyin ve 35 °C'de tutulan bir hibridizasyon fırınının içine girin.</li>
	<li>20 dk için ön hibridizasyon gerçekleştirin.</li>
	<li>Şişeyi fırından çıkarın ve etiketli probu hibridizasyon tamponuna hafifçe ekleyin.</li>
	<li>Lekeyi 35 °C'de, 12 saat döndürülür.</li>
	<li>Hibridizasyondan sonra hibridizasyon çözeltisini dikkatlice 15 mL tüpe aktarın. Bu çözelti yeniden kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>2x SSC tampon artı% 0.5 SDS ekleyerek aşırı hibridizasyon çözümünü kaldırmak için 2 dakika için leke hızlı bir yıkama gerçekleştirin. Çözümü atın.</li>
	<li>35 °C için 2x SSC tampon artı %0,5 SDS ile 30 dakika rotasyon ile lekeyi kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Lekeyi 30 dakika boyunca döndürülürken, 35°C için 0,5 x SSC tamponu artı %0,5 SDS ile tekrar yıkayın.</li>
	<li>Lekeyi bir melezleme kapağının içine yerleştirin, fazla arabelleği çıkarın ve kapatın.</li>
	<li>Bir gecede bir kaset içinde radyasyonsuz fosfor görüntüleyici ekrana maruz.</li>
	<li>Biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini algıla ve uygun yazılımları kullanarak sonuçları analiz edin.</li>
	<li>Lekeyi 80 °C'de kuluçkaya yatarak, 30 dakika boyunca 0,5 X SSC tampon artı %0,1 SDS ve %0,1 X SSC tamponu artı 30 dakika için %0,1 SDS ile soyun.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan edilemis.

Bu yöntem, daha az bol miRNA'lar da dahil olmak üzere küçük RNA'ların saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılabilir. Protokol esas olarak bir yükleme tamponunda toplam RNA'nın denatife, jel elektroforezinin boyut ayrımına, RNA'nın bir membrana aktarılmasına, RNA'nın membrana çapraz bağlanmasına ve istenilen radyoetiketli oligo probları kullanılarak hibridize edilmesine yönelik adımları açıklar.
Herhangi bir lekeleme deneyi için kritik adım, numune hazırlama için kaliteli RNA kullan...

Küçük düzenleyici RNA'lar, mikroRNA'lar, son keşif onları ve bitki vehayvanlardakirollerini anlamak araştırma yol açmıştır 1 . MiRNA'ların uzun öncüleri HYL1 ve spesifik dicer benzeri proteinler2,3ile 21-24 nt olgun miRNA'lara işlenir. Bir 22 nt miRNA ikincil siRNA'lar4oluşturarak basamaklı susturma başlatabilirsiniz. Çalışmalar gelişme miRNA'lar ve ikincil siRNA'ların rolünü göstermiştir, hücre kaderi ve stres yanıtları5,6.
Kuzey hibridizasyonu belirli RNA moleküllerini tespit etmek için rutin olarak kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntem, toplam RNA7bir havuzdan yaklaşık 19 -24 nt uzun küçük RNA tespitinde kullanımını özelleştirmektedir. Bu gösteride, miRNA'ların saptanması ve ölçülmesi için bu tekniğin kullanımını gösteriyoruz. Bu yöntem, radyoizotoplar kullanarak probların etiketlenmesi kullanır; böylece numunedeki miRNA düzeyleri artan hassasiyetle saptayabilir. PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin nicelemesini ve miRNA'ların boyut tayinini sağlar. Bu protokolde miRNA tespitini geliştiren önemli adımlar gösteriyoruz. MiRNA'ların yüksek çözünürlüklü sinyal algılaması için lekeleme ve hibridizasyon adımlarını değiştirdik. Bu teknik aynı zamanda siRNA, tasi-sekonder RNA ve snoRNA gibi diğer endojen küçük RNA'ların saptanması için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>% 40 Akrilamid-bisakrilamid çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma kağıdı</td><td>whatmann kurutma kağıdı I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal yükleme uçları</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize formamid</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N + naylon membran</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon şişesi</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon Fırını</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE-Typhoon tarayıcı</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager ekran ve kaset</td><td>GE healthcare</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Gilson, modeller: P20 ve P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipet</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Poliakrilamid jel aparatı</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 sütunu</td><td>GE sağlık</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Vac Konsantratörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz (PNK)</td> <td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Transblot aparatı</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHyb hibridizasyon tamponu</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>UV-çapraz bağlayıcı</td><td>UVP</td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen siyanol</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki mikrornalarının saptanması ve Ölçülmesi için rna leke analizi

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNA'lar (miRNA'lar) hem bitkilerde hem de hayvanlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan endojen olarak ifade edilen kodlamayan, ~21 nt küçük RNA'lar sınıfıdır. MiRNA'ların çoğu, anahtar genleri hedefleyen gen ekspresyonunun negatif anahtarları olarak hareket eder. Bitkilerde, birincil miRNA 'lar (pri-miRNA'lar) transkriptleri RNA polimeraz II tarafından oluşturulur ve pre-miRNA adı verilen kararlı kök-döngü yapılarının değişen uzunluklarını oluştururlar. Bir ensonükleaz, Dicer benzeri1, miRNA-miRNA* dublekslerine pre-miRNA'ları işler. MiRNA-miRNA* dubleks iplikçiklerinden biri seçilir ve hedef mRNA'ların bölünmesine aracılık etmek için Argonaute 1 proteinine veya homologlarına yüklenir. MiRNA'lar anahtar sinyal molekülleri olmasına rağmen, bunların tespiti genellikle hassas bir kuzey leke analizi yerine optimal PCR tabanlı yöntemlerden daha az yöntemle gerçekleştirilir. Biz çok yüksek hassasiyet ile miRNA düzeylerinin sayısallaştırılması için ideal basit, güvenilir ve son derece hassas kuzey yöntemi tarif, kelimenin tam anlamıyla herhangi bir bitki dokusundan. Ayrıca, bu yöntem boyutu, kararlılık ve miRNA ve öncüllerinin bolluğunu onaylamak için kullanılabilir.

Bu gösteride indica rice var whiteponni'nin farklı dokularında miR397 ifadesini tespit ettik ve ölçtük (Şekil 1). miR397 22 nt miRNA ve korunmuş miRNA olduğunu. Test edilen tüm örneklerde miR397 ifadesi saptanabilir. Yeni nesil sıralama verilerine göre, örnek 1 (fide dokusu) milyonda 5 okuma (rpm) miR397'ye sahiptir. Sinyalini rahatça tespit ettik, bu yöntemin çok hassas olduğunu ve çok düşük miktardaki miRNA'ları bile tespit etmek için kullanılabileceğini belirttik. Bu den...

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Selam. Yani bu küçük bir RNA kuzey protokolü. Dr. Rashid Akbergenov tarafından optimize edilmiş bir protokol türevi.Bu yöntemde, bir uzunluğu 20-24 nükleotit arasında herhangi bir yerde küçük RNA'lar tespit edebilirsiniz, çok hassas ve çok yüksek çözünürlükte. Protokol temelde geleneksel Kuzey analizinin değiştirilmiş bir şekli, ama burada, akrilamid yüzdesi oldukça yüksek, yüzde 15. Bu kuzey zaten bilinen küçük RNA algılamak için kullanılabilir, mikro RNA veya küçük RNA diğer kümesi, sırası bilindiğinde ya da yeni nesil sıralama veri kümeleri gelen küçük RNA bolluğu onayı için kullanılabilir.Bu yöntemin avantajı, bir sadece mikro RNA bolluk bakamaz, ama aynı zamanda öncüllerin bolluğu, örneğin mikro RNA birkaç yüz nükleotit uzun olabilir yaklaşık 30 bir öncül dışarı bırakabilir, bu da aynı anda tespit edilebilir, mikro RNA ile birlikte. Protokol çok basit, çok yalındır, ancak bu protokolün sonunda listelenen bazı kritik adımları gerçekleştirirken çok dikkatli olmak gerekir. 10 mL jel karışımının hazırlanması için 4,8 gram üre, 3,75 mL %40 Akrilamid çözeltisi ve 1 mL taze hazırlanmış 10X TBE, pH 8,2 ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.Çözelti temiz görünene kadar karışımı bir su banyosunda ısıtarak üreyi tamamen çözün. Steril MilliQ su kullanarak hacmi 10 mL'ye çıkarın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun. Gerekli cihazı deterjanla yıkayın, artık TBE ve Akrilamid'i çıkarmak için hafifçe fırçalayın.Daha fazla MilliQ su ile durulayın ve kurumasını bekleyin. Cam plakayı bir araya getirin, her ikisinin de aynı seviyede olduğundan emin olun. Süngerin üzerine sıkıca yerleştirin.Jel karışımına 8 mikro litre TEMED ve %10 taze hazırlanmış APS'yi 80 mikro litre ekleyin. Yavaşça karıştırın ve monte plakalar için jel karışımı dökün. Jelin sızdırmaz olduğundan emin olun.Taramayı dikkatlice yerleştirin. Jel yaklaşık 45 dakika polimerize sağlar. Jelin polimerizasyonundan sonra cam plakaları montajdan çıkarın.Cam tabakları MilliQ su ile yıkayın. Ve onları çalışan kasete koy. Çalışan kaseti tankın içine yerleştirin.Taze hazırlanmış 1X TBE, pH 8.2 dökün. Taramayı dikkatlice çıkarın. Tampon boruları borulayarak jel kuyularını iyice yıkayın.Bu adım, üre çökeltilerini kuyudan uzaklar ve RNA'nın jel üzerinde düzgün çalışmasını kolaylaştırır. Herhangi bir tampon sızıntısı kontrol etmek için, cihazın kapağını kapatın ve 30 dakika boyunca 80 volt boş jel önceden çalıştırın. 10 mL yükleme boyası hazırlanması için, bromofenol mavisi 5 mg, ksilen siyanol 5 mg ağırlığında ve deioinised formamid 10 mL ekleyin ve iyice karıştırın.Aliquot boya ve saklamak 4 derece daha fazla kullanım için. Aliquot 10 mikrogram toplam RNA steril 1.5 mL tüpler içine. RNA'nın kalitesinin260:230 oranı ikiden büyük veya daha yakındır. Tüpü speedVac'ın içine yerleştirin ve numuneleri vakumlayın kurulayın. 8 mikro litrelik yükleme boyasında kurutulmuş RNA numunelerini yeniden askıya alın.Örnekleri 98 derecede iki dakika ısıtın. Oda sıcaklığında bir dakika soğutun. Yükleme boyasında uygun yeniden süspansiyon sağlamak için soğutulmuş RNA numunelerini girdap.Tüpleri çevirin. Serbest akan RNA almak için ısıtma, soğutma ve girdap adımlarını üç kez tekrarlayın. Jelin ön çalışmasını durdurun.Kuyuların içindeki üre tortularını gidermek için, numuneyi yüklemeden önce kuyuları iyice yıkayın. Yeniden askıya alınan RNA örneklerini 98 derecede bir dakika ısıtın. Kılcal uçlu uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyulara yükleyin.Hava kabarcıkları tanıtmaktan kaçının. Tüm numunelerin tam yükleme ve kapağı monte. Bromofenol mavisi tamamen çalışana kadar jeli 80 voltta üç saat veya çalıştırın.Transfer için pozitif yüklü naylon membran kullanın. Cam plakanın boyutlarına kadar kesin. Sağ üst köşedeki membranı etiketle.Membranı steril MilliQ su yüzeyine hafifçe yerleştirin, etiket tarafını su yüzeyine bakacak şekilde aşağıya doğru yerleştirdiğinden emin olun. Temiz bir tepsi alın ve elektro transfer için jel sandviç hazırlamak. Kasetin gri tarafını aşağı yerleştirin.1X TBE'yi kaset seviyesinin biraz üzerine dökün. Lif yastığını 1X TBE'de önceden ıslavetin ve hava kabarcıklarını temizlemek için sıkın. İki parça lekekağıdını fiber ped boyutuna kadar kesin.Bir parça leke kağıdını 1X TBE'de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıt üzerinde plastik bir pipet haddeleme hava kabarcıkları çıkarın. Önceden 1X TBE içinde leke kağıt başka bir parça ıslatın ve kaset üzerine koydu.Hava kabarcıkları kaldırmak için üzerinde rulo. Şimdi sandviç kurulumu elektro transfer için hazır. Elektroforez tamamlandıktan sonra, çalıştırmayı durdurun ve kapağı cihazdan çıkarın.Çalışan kaseti kurulumdan çıkarın. Çalışan kasetteki cam plakaları çıkarın. Jeli dikkatlice montajdan çıkarın.İlk yüklenen RNA numunesi saağınıza doğru olacak şekilde lekekağıdının üzerine tökezle. Önceden ıslatılmış membranı 1X TBE'ye yavaşça batırın ve etiketlenmiş tarafa bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Membran ve jelin kurumasını izin vermeyin.Hava kabarcığı kaldırmak için yavaşça üzerinde rulo. 1X TBE içinde lekeleme kağıt bir parça Daldırma ve membran üzerine yatıyordu. Hava kabarcıkları kaldırın.Leke kağıt başka bir parça yerleştirin ve hava kabarcıkları kaldırın. Lif yastığını montajın üzerine sererek sandviçi tamamlayın. Kaseti sıkıca kapatın.Trans-blot kasetini modüle yerleştirin. Tankı 1X TBE, pH 8.2 ile doldurun. Cihazın kapağını kapatın ve 4 derece veya soğuk bir odada bir gecede 10 volt transfer.UV çapraz bağlantı hazır tutun ve elektro transferi tamamlanmadan hemen önce, 1200 ayarlayın. Aktarım tamamlandıktan sonra kaseti modülden çıkarın. Nemli membranı bir A4 levhaüzerine yerleştirin ve işaretli tarafı yukarı doğru yerleştirin.120 mili joule'de 254 nanometre UV ışığı ile ışınlama ile RNA'yı membrana çapraz bağla. Çapraz bağlı leke dört derece de saklanabilir veya hibridizasyon için kullanılabilir. Tespit edilmesi gereken küçük RNA'ya tamamen ücretsiz bir sonda tasarla.PNK enzimini kullanarak son etiket son beş asal ucunda probu etiket ve gösterildiği gibi bileşenleri birleştirmek. Reaksiyon karışımını 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka 30 dakika sonra reaksiyon karışımı ndan etiketsiz probları ayırmak için G-25 sütunkullanın.Sondanın daha iyi etiketlemiiçin, g-25 sütunu kullanılmadan önce hazırlayın. Bir hibridizasyon şişesi içinde, üst bakan leke, RNA tarafı yerleştirin. Kullanmadan önce hibridizasyon arabelleği şiddetle karıştırın.Içine hibridizasyon tampon 10 mL ekleyin ve hibridizasyon fırın içine hibridizasyon şişesi yerleştirin, rotasyon ile 35 derece korumak. 20 ila 30 dakika için ön hibridizasyon gerçekleştirin. Ön hibridizasyondan sonra şişeyi fırından çıkarın.Etiketli sondayı melezleştirme arabelleğine yavaşça ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşturulmadığından emin olun. 12 saat boyunca rotasyon ile 35 derece fırın içinde leke kuluçka.Melezlemeden sonra, şişeden hibridizasyon arabelleği kaldırın. Yıkama tampon-I kullanarak lekeleri hızlı bir yıkama gerçekleştirin. Bu adım, fazla hibritleştirme çözümlerini lekelerden kaldırmak için gerçekleştirilir.Daha fazla yıkama tampon-I kullanarak 30 dakika boyunca 35 derece lekeler kuluçka. 30 dakika boyunca 35 derece tampon-II kullanarak başka bir yıkama gerçekleştirin. Lekeyı yıkadıktan sonra, bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve mühürleyin.Bir kasetin içine yerleştirin ve 12 saat boyunca radyasyonsuz fosfo-imager ekranına maruz bırakın. Tayfun biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini algıla ve ImageJ yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin. Lekenin diğer problarla melezlenmesi için, resimli olduğu gibi sıyırma adımları gerçekleştirin.Bu teknik ile bir mikro RNA bolluğu tahmin edebilirsiniz, hem de uzunluğu. Bu görüntüden, mikro RNA 397 ifadesi tüm örneklerde tespit edilebilir. Bu lekede, örnek bir bolluk milyonda yaklaşık 5 okur, yeni nesil sıralama verilerine göre, tekniğimizin de daha az bol mikro RNA'ları tespit edebildiğinizi düşündürmektedir.Buna ek olarak, ImageJ niceleme yazılımı kullanarak, bir örnekler arasında mikro 397 ifadesini ölçebilirsiniz. Burada yükleme kontrolleri olarak U6 ve mikro RNA 168 kullandık. Deneyi yaparken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli adımlardan bahsedeceğim.Numune hazırlama için kaliteli RNA kullandığınızdan emin olun. Numuneleri vakumlarken, fazla kurutmaktan kaçının. Yükleme boyasında RNA'nın yeniden askıya alınması çok önemlidir.Serbest akan numune hazırladığından emin olun. Jel yüklenirken dikkatli olunmalıdır. Jel kuyuları yıkanmalı ve numune kuyuların içine düz bir çizgide yüklenmelidir.Elektro transferi sırasında, membranın suya yayılması, 1X TBE daldırma hemen önce esastır, bu transferi artırır. Lekenin hibridizasyonu 35 derecede yapılmalıdır. Hibridizasyon fırınSıcaklığını koruyun.Lekelerin tekrar tekrar kullanımı için membranlar 4 derece olarak saklanmalıdır. 2X SSE'de nemli tutulmalıdır. Diğer PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin niceliğini ve mikro RNA'ların boyutunun belirlenmesini sağlar.

rna-blot-analysis-for-detection-quantification-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, bitki dokusundan ekstrakte edilen toplam RNA'dan mikroRNA'ları (miRNA'lar) tespit etmek ve ölçmek için bir hibridizasyon tekniği olan kuzey blotunu gösteriyoruz.

Bitki dokusunun toplam RNA ekstraktındaki spesifik mikroRNA'yı tespit etmek ve ölçmek için Northern Blot

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bir biyoinformatik boru hattı, yani miRDeep-P2 (kısaca miRDP2), güncellenmiş bitki miRNA kriterleri ve elden algoritması ile, doğru ve verimli bitkilerde mikroRNA transkripsiyon analiz edebilir, özellikle karmaşık ve büyük genomları olan türler için.

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Burada, 1) bilinen ve yeni miRNA'ları daha doğru bir şekilde tanımlayabilen ve 2) tam otomatik ve serbestçe kullanılabilen yeni ve tam otomatik bir miRNA boru hattı olan mirMachine'i sunuyoruz. Kullanıcılar artık tam otomatik mirMachine işlem hattını çalıştırmak için kısa bir gönderme komut dosyası yürütebilir.

mirMachine: Tesis miRNA Ek Açıklaması için Tek Noktadan Çalışan Bir Dükkan

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, bitki mikroRNAlarını %15 akrilamid jel kullanarak yüksek çözünürlüklü RNA leke analizi ile saptama ve ölçme yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesi çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Daha fazla video keşfet