İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden İndüklenen İn vitro Nöromüsküler Kavşak

Bu insan nöromüsküler kavşak indüksiyon sistemi ön ve post-sinaptik bileşenlerin oluşumunu indüklemek için kullanılabilir, motor nöronlar da dahil olmak üzere, iskelet kası, ve Schwann hücreleri. Sadece olgun, karmaşık Bir NMJ yapısı tek bir başlangıç hücre popülasyonundan tek bir kültür çanak elde edilebilir, ama ortaya çıkan NMJ de sözleşme yeteneğine sahiptir. Bu yöntem spinal müsküler atrofi gibi nöromüsküler hastalıkların incelenmesi ve terapötik bileşik tarama için potansiyele sahiptir.

Diferansiye NMJ çok kalın, karmaşık bir dokudur ve görselleştirmek zordur. Yordamı göstererek, okuyuculara belirli yapıları nasıl tanımlayacağını öğretebiliriz. Bir Petri kabına bir mililitre hücre ayırma çözeltisi eklemeden önce hücreleri üç mililitre PBS ile yıkayın.

37 santigrat derece de 10 dakika sonra, her iyi primat embriyonik kök hücre orta üç mililitre ekleyin ve yavaşça kapakları hücreleri ayrıştırmak için üç kez pipet. Daha sonra, ayrılmış kök hücre içeren süpernatantları santrifüj için 50 mililitrelik konik tüpe havuzlayın ve geri sayım için 10 mikromolar Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenen üç mililitre taze primat embriyonik kök hücre de kök hücre peletini yeniden askıya alın. Daha sonra rock inhibitörü konsantrasyonu ile desteklenen orta mililitre başına beş hücre hücreleri iki kez 10 seyreltmek ve ekstrasellüler matris kaplı altı iyi plaka her kuyuda her coverslip hücrelerin iki mililitre dönmek.

24 saat sonra, her kuyudaki süpernatantı, doksisiklin mililitresi başına bir mikrogramla takviye edilmiş iki mililitre taze primat embriyonik kök hücre ortamıyla değiştirin ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, iyi başına doksisiklin ile takviye farklılaşma orta iki mililitre ile supernatants değiştirin ve 10 gün boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Kuluçka sonunda, iyi başına doksisiklin ile desteklenen miyojenik farklılaşma ortamı iki mililitre ile supernatants değiştirin ve ek bir 10 gün için hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek.

Kuluçka sonunda, iyi başına nöromüsküler kavşak orta iki mililitre ile supernatants değiştirin ve 30 gün boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Kuluçka sonunda, ters mikroskopi ile farklılaşmış nöromüsküler kavşakları görselleştirin. Miyotube kasılmaları tetiklemek için, farklılaşmış nöromüsküler kavşak hücrelerinin her bir kuyuya 25 milimolar kalsiyum klorür ekleyin.

Ve tedaviden sonraki 1-2 dakika içinde, tabağı ters bir mikroskobun sahnesine yerleştirin. Canlı hücre mikroskobu kullanarak, 20 saniye boyunca miyotube daralma bir film kaydedin. Kaydın sonunda, kültür ortamına mililitre başına 300 nanogram ekleyin ve film dosyasını analiz için uygun bir hareket vektör analizi yazılım programında açmadan önce filmi 20 saniye daha kaydedin.

Nörofilament sinaptik damarların ve asetilkolin reseptörlerinin immünororesan boyama nöronları tanımlamak için yapılabilir. Motor nöronlar TUJ 1 ve Islet 1 boyama ile tespit edilebilirken, post-sinaptik miyotüpler miyozin ağır zincir için boyama ile tespit edilebilir. Schwann hücreleri S-100 antikor ile etiketlenebilir.

Bu taramalı elektron mikroskobu görüntülerinde, olgun nöromüsküler kavşakların morfolojisi genişletilmiş akson terminalleri, akson ve kas liflerinin net bir şekilde görüntülenmesi ile gözlemlenebilir. İletim elektron mikroskobu nöromüsküler bileşenlerin olgun ultra yapısını görselleştirmek için kullanılabilir, sinaptik veziküller ile presinaptik akson terminali de dahil olmak üzere ve post-sinaptik bölge, sinaptik yarık ile ayrılır. Junctional kıvrımlar nöron ve kas lifleri arasındaki kavşak işareti.

Burada sinaptik veziküliçeren olgun akson terminalleri gösterilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu morfolojik özellikleri nöromüsküler bileşenlerin iyi indüklenen ve olgunlaşmış olduğunu göstermektedir. Hücrelerin fonksiyonel değerlendirilmesi, belirgin nöromüsküler kavşak hareket sinyallerinin kalsiyum klorür tarafından indüklenebileceğini ve bu kasılmaların motor nöron sinyallerinin kas kasılmasını tetiklemek için nöromüsküler kavşakyoluyla iletilir olduğunu doğrulayan curare ile kesilebildiği ortaya koymaktadır.

Hücre tohumlama yoğunluğu NMJ oluşumunun verimliliğini etkiler. Deneysel amaçlara göre protokole uyum sağlayacak şekilde değiştirilebilir. Bu nöromüsküler kavşak kültürü birden fazla hücre tipleri içerir, ve bu bileşenler nöromüsküler kavşak gelişimi sırasında veya belirli hastalık patolojilerine yanıt olarak bu hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.