Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi
11 Mart 2021
Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.
ATP önemli bir hücresel haberci olduğundan, ATP'nin reseptörlerine bağlanmasını yüksek hassasiyetle ölçmemizi sağlayan bir yöntem geliştirdik. Nükleotid türevleri ve floresan olarak etiketlenmiş proteinler arasındaki FRET'i kullanarak, nükleotidin bozulmamış fonksiyonel reseptörlere bağlanmasını gerçek zamanlı olarak ve mükemmel uzamsal çözünürlükle izleyebiliriz. Bu yöntemi, hücresel metabolizmanın, belirli diyabet formlarında rol oynayan ATP'ye duyarlı potasyum kanalı üzerindeki etkilerini anlamak için kullanıyoruz.
Çatısız bir membran deneyi yapmak için, önce transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasından küçük bir parçayı kırmak için bir çift forseps kullanın ve parçayı PBS ile durulayın. Kapak kayması polilizin ile önceden kaplanmışsa, parçayı iki mililitre PBS içeren 35 milimetrelik bir çanağın altına yerleştirin ve numunenin üç ila beş milimetre üzerinde üç milimetrelik bir prob sonikatörünü tutun, hücrelerin çatısını açmak için 200 ila 500 milisaniye boyunca 50 watt ve% 20 ila% 40 genlikte titreştirin. Kapak kaymaları önceden kaplanmamışsa, PBS ile duruladıktan sonra, gösterildiği gibi kısa sonikasyonla hücreleri açmadan önce parçayı% 0.1 poli-L-lizin içeren bir tüpe yaklaşık 30 saniye batırın.
Sonikasyonlu parçayı iki mililitre banyo çözeltisi içeren kapalı bir cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı yüksek sayısal diyaframlı 60x suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin. Mikroskobun kamera portunun yüksek hassasiyetli bir CCD kamera ile seri olarak bir spektrografa bağlı olup olmadığını kontrol edin ve banyo odasını dakikada 0,5 ila bir mililitre tampon akış hızında tamponla perfüze etmek için peristaltik bir pompa kullanın. ANAP etiketli kanalı ifade eden çatısız membran parçalarını tanımlamak için, floresan kanallı membranları bulmak üzere numuneyi görüntüleyin.
Spektrometre maskesini mikroskoptaki kamera portu ile spektrograf arasına kısmen takın. Maskenin gölgesi kamera görüntüsünde görünecektir. Analiz için ilgili bölgenin seçilmesine izin vermek için çatısız membranın parlak bir alan ve floresan görüntüsünü elde edin.
Mikrohacim perfüzyon sisteminin ucunu çatısız membrana yaklaştırın. ANAP floresansının bir görüntüsünü elde etmek için, 390/18 nanometre bant geçiş uyarma filtresi ve 416 nanometre kenar dikroik aracılığıyla 385 nanometre LED ile membranı heyecanlandırın ve yayılan ışığı 400 nanometre longpass emisyon filtresinden toplayın. Spektrometre maskesini takın ve yayılan ışığın içinden geçtiğinden emin olun.
İlgilendiğiniz bölgeyi spektrometre maskesinin yarığıyla hizalayın. Spektrometre ızgaralarını devreye sokun. Izgaralar yerleştirildiğinde, spektrometre tarafından kırılan ışık, spektral görüntüler üretmek için CCD kameranın çipine yansıtılacaktır.
Görüntüler uzamsal bilgileri Y boyutunda koruyacaktır. X boyutu dalga boyu ile değiştirilecektir. Nükleotid içermeyen tampon çözeltisi ile perfüzyon yaparken, deneyin geri kalanında toplanan verilerin aşağı akış düzeltmesi ve normalleştirilmesi için bir veya daha fazla 0,1 ila on saniyelik pozlama elde edin.
Daha sonra, bir konsantrasyon tepki eğrisi oluşturmak için banyo çözeltisine bir dizi TNP ATP konsantrasyonu uygulayın, kararlı bir duruma ulaşılmasını sağlamak ve her konsantrasyon için bir maruz kalma elde etmek için her çözeltiyi en az bir dakika perfüze edin. Her konsantrasyondan sonra, TNP ATP'yi işlem sonrası maruz kalma görüntüsü elde etmeden önce en az bir dakika boyunca nükleotid içermeyen banyo çözeltisi ile yıkayın. Yama kelepçeli florometri deneyi gerçekleştirmek için, önce yama pipetlerini kalın duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 1,5 ila 2,5 megaohm dirence çekin.
Daha sonra, transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasını, iki mililitre banyo çözeltisi içeren cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı ters çevrilmiş mikroskopa monte edin. Banyo odasını banyo çözeltisi ile perfüze edin ve ANAP etiketli kanalları ifade eden bir hücre tanımlayın. Yama pipetine hafif pozitif basınç uygulayın ve pipeti bir banyo odasına yerleştirin.
Pipetinizi hücrenin zarına bastırın ve gigaohm sızdırmazlık elde etmek için nazik bir emme uygulayın. Yamayı tüketmek için, pipet tutucuyu yamalı hücreden hızla uzaklaştırın. Yama pipetinin ucunu perfüzyon sisteminin ucuna yaklaştırın ve yamanın spektrometre maskesinin yarığı içinde olup olmadığını kontrol edin.
Ardından TNP ATP'yi uygulayın ve görüntü spektrumlarını toplayın. Bu görüntülerde, turuncu floresan proteini ile etiketlenmiş ATP'ye duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir HEK293T hücresinden tipik bir çatısız membran parçası gözlemlenebilir. Beş mikromolar TNP ATP'ye maruz kalan bir HEK293T hücresinden çatısız bir zarda ANAP etiketli ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının bu spektral görüntüsünde, ANAP ve TNP ATP'nin tepe emisyonuna karşılık gelen iki yüksek yoğunluklu bölge gözlemlenebilir.
Son bir spektrum, ortalama arka plan spektrumunun ortalama ilgi alanı spektrumundan çıkarılmasıyla elde edilebilir. Burada, çoklu maruziyetlerden sonra pik ANAP floresansında azalma gözlenebilir. TNP ATP'nin yokluğunda çeşitli maruziyetlerden kaynaklanan pik floresan, tek bir üstel bozunmaya takıldı.
Bu veriler daha sonra fotobeyazlatma eserlerini düzeltmek için kullanıldı. Burada, TNP ATP'nin yokluğunda ve varlığında ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir hücreden elde edilen çatısız bir membrandan elde edilen temsili spektral görüntüler gösterilmiştir. Düzeltilmiş emisyon spektrumlarının gözlemlenmesi, donör ve alıcı floresan emisyonu arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu şekilde, tipik bir yama-kelepçe florometri deneyinden ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarından gelen temsili akımlar ve spektrumlar gösterilmiştir. Emisyon spektrumları, çatısız membranlar için gösterildiği gibi arka plan ve ağartma için düzeltilir. Floresan sinyalinin reseptörünüze özgü olduğunu doğrulamak için kontrollere dikkat edin.
Profüzyonunuzun hızlı, verimli ve eksiksiz olduğundan emin olun ve pozlamalarınızı mümkün olduğunca kısa tutun. Bu yöntem, reseptör doluluğu ve bunun işlevle nasıl ilişkili olduğu hakkındaki soruları yanıtlar. Benzer bir kurulumla kullanılan diğer FRET teknikleri, reseptördeki ligand kaynaklı doğrulama değişikliklerini araştırabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, hücresel ortamda adenosin nükleotide bağlanmasının reseptörlere bağlanmasını gerçek zamanlı olarak ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Nükleotid türevleri ve floresan etiketli proteinler arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak, araştırmacılar işlevsel reseptörlere nükleotit bağlanmasını yüksek hassasiyetle izleyebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Biyofizik
Arka Plan
- ATP, çeşitli sinyal yollarına dahil olan kritik bir hücresel habercidir.
- ATP'nin reseptörlerine bağlanmasını anlamak, hücresel metabolizmayı incelemek için esastır.
- ATP duyarlı potasyum kanalı, bazı diyabet formlarıyla ilişkilidir.
- Gerçek zamanlı ölçüm teknikleri, reseptör dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Çalışmanın Amacı
- Reseptörlere ATP bağlanmasının gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem geliştirmek.
- Hücresel metabolizmanın ATP duyarlı potasyum kanalları üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Hücresel ortamda deneyler yapmak için detaylı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Trinitrofenil nükleotid türevleri kullanılarak FRET ölçümü.
- Transfekte edilmiş hücrelerden membran fragmanlarının açılması.
- Görüntüleme için yüksek sayısal diyafram mikroskobu kullanımı.
- Reseptör aktivitesini analiz etmek için patch-clamp florometrisi.
Ana Sonuçlar
- ATP bağlanma dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Floresan etiketli kanalları ifade eden açılmış membran fragmanlarının tanımlanması.
- TNP ATP için konsantrasyon-cevap eğrilerinin oluşturulması.
- Donör ve alıcı floresan emisyonlarının net bir şekilde ayrılması gözlendi.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, ATP reseptör etkileşimlerinin hassas bir şekilde izlenmesini sağlar.
- Bulgular, hücresel metabolizmada ATP'nin rolünü anlamaya katkıda bulunur.
- Bu protokol, reseptör dinamiği ve işlevi üzerine daha fazla çalışma için uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables real-time quantification of nucleotide binding to functional membrane proteins, providing mechanistic insights into ligand-dependent gating that can inform target validation for nucleotide-regulated receptors. By integrating binding measurements with functional readouts such as ion channel current, it supports de-risking of therapeutic hypotheses in discovery programs targeting metabolic and neurological disorders. The approach is adaptable to other receptors with suitable fluorescent ligands, offering a reusable platform for assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time occupancy of nucleotide-binding sites on intact, functional receptors to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables direct correlation of ligand binding with protein function via simultaneous current measurement in excised patches.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving ligand-dependent gating dynamics of targets like KATP channels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative concentration-response curves using TNP ATP derivatives to establish binding affinity and potency.
- Reproducibility: Uses standardized unroofed membrane and patch-clamp fluorometry setups to minimize variability across experiments.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging and spectral analysis for multi-condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to ATP-sensitive potassium channels implicated in certain forms of diabetes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges binding kinetics to functional outcomes, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic Insight: Reveals how nucleotide binding modulates channel activity, informing structure-function relationships in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing binding-function correlation data.
- Discovery Biology: Tests target engagement and pathway modulation by measuring nucleotide binding in native-like membrane environments.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding data suitable for hit confirmation and SAR development.
- Analytics: Produces corrected emission spectra and binding isotherms that enable comparison of ligand efficacy and potency.
- Translational Research: Links binding events to functional readouts in disease-relevant systems such as metabolically active cells.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other nucleotide-regulated proteins or receptors with compatible fluorescent ligands, supporting platform-level investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on ligand-receptor interactions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes real-time binding measurements with spatial and temporal resolution in intact membranes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement with functional correlation.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on binding kinetics and functional impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular tagging with non-canonical amino acids like ANAP and FRET-based detection.
- Depends on instrumentation including spectrograph-equipped microscopes, high-sensitivity CCD cameras, and microvolume perfusion systems.
- Necessitates standardization of membrane preparation (unroofed or excised patches) and buffer conditions across teams.
- Adaptation to other systems requires identification of suitable fluorescent nucleotide derivatives and compatible protein tags.
- Potential limitations include photobleaching artifacts and the need for careful controls to ensure signal specificity, as noted in the data treatment section.
