Name: Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin, hidrojel tabanlı yöntemle fonksiyonel safra epitel kistlerinin oluşumunu ve kantitatif karakterizasyonunu. Bu protokol, biliyer hastalıkların tedavi hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Amerika Birleşik Devletleri), kim nazilikle NRC hücre hattı sağlanan teşekkür ederiz.
Bu çalışma hem iLite RHU programı (grant ANR-16-RHUS-0005) hem de DHU Hepatinov'un mali desteğini almıştır.
Isabelle Garcin ve Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay'e görüntüleme konusundaki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

1. Kistlerin üretimi
NOT: Jelleşme hücrelerin katıştırılmasına izin veriyorsa, bu protokol her türlü hidrojel ile yapılabilir.
<ol><li>Hidrojel kaplama NOT: Hazne saklıdoğru hidrojel kaplama kuyunun alt kısmında 2D hücre tabakaları oluşumunu önlemek için kritik bir adımdır, sonraki kist görüntüleme müdahale ve kist oluşumu verimliliği hesaplama sını bozabilir.<ol>
<li>Jel çözeltisinin homojenliğini sağlamak için hidrojeli bir gecede 4 °C'de (O/N) eritin.</li>
		<li>-20 °C'de buz veya O/N üzerinde precool pipet uçları ve -20 °C O/N'de 8 kuyulu bir hazne kaydırağı.</li>
		<li>Buz dolu bir buz kovası üzerine hidrojel ve 8-iyi oda slayt yerleştirin.</li>
		<li>15 mL konik bir tüpte, soğuk NRC komple ortamda @ hidrojel (V/V) içeren bir çözelti hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)ve tüpü buzüzerine yerleştirin.</li>
		<li>Soğuk pipet uçları kullanarak bir hazne slaytKaplamak için, her kuyunun ortasına 50 μL hidrojel çözeltisi ekleyin ve hazne ucunu buz üzerinde tutarken bir pipet ucu kullanarak tüm yüzeye yayıldı(Şekil 1A). NOT: Hidrojel çözeltisini mümkün olduğunca eşit olarak kabarcıklardan kaçınarak yayın.</li>
		<li>Hidrojeli polimerize etmek için, 37 °C,% 5 CO2en az 15 dakika için oda slayt kuluçka .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre hazırlama<ol>
<li>Isınma NRC komple orta, fosfat tamponlu salin (PBS), ve tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (tripsin-EDTA) önceden ısıtılmış bir su banyosunda 37 °C.</li>
		<li>Hidrojel polimerize iken, NRCs bir T-25 cm2 kollajen kaplı şişe21%birleşimi için yetiştirilen emin olun. Önceden ısıtılmış 1x PBS ile hücreleri bir kez yıkayın.</li>
		<li>NRC'leri 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS (T-25 cm2 şişe için) 37 °C'de 20 dk, %5 CO2ile inkübedin. NOT: Tripsin-EDTA ile kuluçka süresini kısaltan bu adım, hücrelerin kendi kendini organize eden özelliklerini korumada etkilidir.</li>
		<li>PBS atın, trypsin-EDTA 1 mL ekleyin ve 37 °C, % 5 CO25-10 dakika kuluçka.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış tam NRC ortamının 4 mL'si ile nötralize edin. Hücre süspansiyonuna 15 mL konik bir tüp toplayın ve aktarın ve 4 dk boyunca 150 x g'da döndürün.</li>
		<li>Orta atın ve önceden ısıtılmış orta 5 mL hücre pelet resuspend.</li>
		<li>40 μm hücreli süzgeç kullanarak hücre çözeltisini 50 mL konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri sayın. NOT: Hücreleri bir süzgeçten geçirmek, kantitatif sonuçların tekrarlanabilir olması, yani gömülü hücre agregalarının neredeyse benzer boyutunu elde etmesi için kritik bir adımdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hidrojel çözeltisindeki hücre süspansiyonunun gömülmesi<ol>
<li> </li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li> <ol><li></li><li><li></li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li></ol></li><li> <ol><li></li><li> </li><li></li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61404/61404eq1.jpg"></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61404/61404eq2.jpg"></li></ol></li></ol><ol><li><li></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li> </li><li> </li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li><li><ol><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Martín-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArtym%2C+VV+%22Current+Procotols+in+Cell+Biology%22">Current Procotols in Cell Biology</a>. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li>
<li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).</li>
<li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+GAG-matrices+to+promote+mammary+epithelial+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 112, 20-30 (2017).</li>
<li>Miroshnikova, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).</li>
<li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li>
<li>Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+3D+culture+in+Matrigel+microbeads+to+analyze+clonal+acinar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development.</a> Biomaterials. 52, 347-357 (2015).</li>
<li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads%3A+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).</li>
<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiopathies+-+Towards+a+molecular+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Cholangiopathies - Towards a molecular understanding.</a> EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).</li>
<li>Loarca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+cholangioids+from+normal+and+diseased+human+cholangiocytes+as+an+in+vitro+model+to+study+primary+sclerosing+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis.</a> Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).</li>
<li>De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+and+the+biliary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine and the biliary tree.</a> Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).</li>
<li>Dianat, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+cholangiocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+and+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells.</a> Hepatology. 60, 700-714 (2014).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li>
<li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li>
<li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. 0 (0), (2019).</li>
<li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).</li>
<li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Annexin+V%2FPropidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).</li>
<li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li>
<li>Spirlì, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarity+of+Na%2B%2FH%2B+and+Cl-%2FHCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Organogenez ve 3D hücresel yapıların bakım çalışması için, çeşitli dokular modellenmiştir, farklı hücresel kökenleri kullanarak ama aynı zamanda sentetik hidrojeller de dahil olmak üzere ekstra-hücresel matrisfarklı türleri8,9,10,21. Ancak, organoidoluşumu veya işlevselliği açısından yöntemler arasında karşılaştırmalar sağlar 3D kantitatif analiz eksikliği nedeniyle7<sup...

Son otuz yılda, in vitro araştırma alanı 3D kültür sistemlerine doğru ilerlemiştir. Bir iskele/matrisin varlığında veya yokluğunda, bir damla, ajitasyonda, mikroakışkan cihazlarda veya yüzen 1'de, 3Boyutlu olarak hücreleri küresel olarak veyaagrega olarak bir dizi şekilde kültüre alma için bir dizi protokol ortaya çıkmıştır. 3D kültür yöntemlerinin kullanımı, özellikle kistler veya acini adı verilen 3Boyutlu yapılarda kendi kendini organize ettiği gösterilen epitel hücreleri başta olmak üzere 2 boyutlu (2D) kültürlere göre avantajlarını kanıtlamıştır. Bu durumda, hücreler bir lümen çevreleyen bir monolayer oluşturur, hücrelerin geliştirilmiş fizyolojik özel fonksiyonları ile tam epitel fenotip eldenerede 2.
Doğal matrislerde bu epitel organoidlerin oluşturulması için yöntemlerin geliştirilmesine çok sayıda çalışma katkıda bulunmuştur. Bu vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevre etkileşimleri recapitulate izin verdi, kurulması ve epitel fenotip istikrar elde etmekiçin 3,4,5,6,7. Son zamanlarda, ve özellikle nakledilebilir organoidler geliştirmek ve epitel programı düzenlemek için mikroortamın gereksinimini deşifre amacı ile, sentetik hidrojeller epitel acini oluşumunu artırmak için geliştirilmiştir8,9,10. Ne yazık ki, bu çalışmalar nitel veri raporu, ya da 2D düzlemde olmayan kistler üzerinde kistlerin oranı gibi iç referanslar kullanarak mevcut hesaplama yöntemleri8,9,10. Bu, epitel organoidlerinin verimlilik, stabilite veya morfolojik ve fizyolojik karakterizasyonu açısından farklı çalışmalar arasında herhangi bir karşılaştırma yıkmaktadır.
Mikroakışkan cihazlar kullanarak boncuklarda epitel hücrelerinin mikrokapsülasyonu daha gerçekçi nicel ve karşılaştırmalı sonuçlar almıştır. Bu teknoloji kullanılarak, çeşitli hücre tiplerinden organoidler oluşmuş ve farklı 3D hücresel yapılar arasında morfolojiye dayalı farklılaşmış11,12. Ancak, bu teknoloji ile çalışmak kolay değildir ve mikroakışkan cihazlar üretmek için temiz oda kullanımını gerektirir. Bu teknoloji hidrojeller birkaç tür için kurulmuştur ama teknik adaptasyon diğer hidrojeller için uygulanacak gerektirir, onun çok yönlülük kısıtlayan. Bu nedenle, epitel organoidler geliştirmek için amaçlanan çoğu çalışma bir hidrojel toplu epitel hücrelerinin katıştırma güveniyor. Bu yöntemlerde, tüm 3D kültür içinde jel strüktürasyonu ve hücre dağılımı yüksek heterojenlik genellikle ihmal edilir. Bu nedenle, analizlerin çoğu tek 2B görüntülerle ilgilidir, bu da yalnızca kabaca tüm 3B hacimdeki çeşitli hücresel nesnelerin dağılımını temsil eder.
Kolanjiokarsinom, safra atrezisi, primer sklerozan kolanjit gibi safra kanallarını etkileyen hastalıklar mortalite ve morbiditenin başlıca nedenidir. Karaciğer nakli dışında bu durumlar için etkili bir tedavi yoktur13. Safra yolu oluşumunu, hastalık nedenlerini ve ilerlemesini araştırma çabaları yeni tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır14.
Normal veya hasta kaynaklı, diferansiye veya ata türevi kolanjiyosit hücre hatları kullanan kist, küresel oidler veya tüp benzeri yapıların biliyer organotipik modelleri geliştirilmiştir15,16,17,18,19,20. Çeşitli çalışmalar da kolanjiyofit polaritere, kolanjisit belirteçlerinin ekspresyonu, silya varlığı, kolanjiyosit salgıve reabsorptif yetenek, ve lümen oluşumu ve obstrüksiyonu; bunların hepsi kolanjiyosit fenotip, morfoloji ve fonksiyon15,17,19önemli özelliklerini temsil eder. Diğerleri uzun süre hasta kaynaklı safra organoidleri bakım bildirdin20. Son zamanlarda, biz biliyer kistler organogenez biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları rolünüaraştırdı21. Daha da önemlisi, biliyer atrezisi patogenezi safra spheroidleri ve tüpler7,22çalışıldı. Ayrıca, kolanjiyosit senescence, pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanması gibi birincil sklerozan kolanjitin temel özellikleri, yanı sıra makrofaj işe başarıyla safra spheroids kullanılarak çalışılmıştır15,20. Ancak, bu soruların ele alınabileceği kolanjiyosit fenotip, fizyoloji ve mikroçevreyi fizyolojik olarak modüle eden in vitro 3D kantitatif modellere hala ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca, sadece birkaç yayın kist oluşumu verimliliği21,23 bildirdin. Bu, özellikle organogenez, hastalık nedeni ve kolanjiyosit fonksiyonu ve polarizasyon ile ilaç yanıtlarının korelasyonunu araştırırken, saptanması gereken önemli bir noktadır. Buna ek olarak, protokolden protokole kadar kullanılan iskele/matris farklılıkları ile sistemler arasında karşılaştırmak zordur. Bu sorunları çözmek için lümen oluşumunu, kolanjisit polarizasyonunu ve kolanjiyit salgı işlevini taklit eden biliyer kistler oluşturmak için nicel, güvenilir ve evrensel bir yöntem öneriyoruz. Daha da önemlisi, zaman içinde değerlendirilirken 3D jel boyunca Z-ekseni boyunca yapılan sistematik bir analiz, kist oluşumu verimliliği, boyut, canlılık, polarizasyon ve işlevsellik sayılmaktadır. Ayrıca, doğal bir hidrojel ve normal sıçan kolanjiyositler (NRC) s, protokol için bir örnek olarak kullanılan, ancak diğer doğal veya sentetik hidrojeller, yanı sıra epitel hücreleri 3D kistik yapıların oluşumu için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10 ve mikro; l- Pipet Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>100 & l - Pipet Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>1000 & l - Pipet Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l - Pipet Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>3,3&asal;,5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 3.4 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>VWR</td><td>20104-298</td><td>0.02N son</td></tr><tr><td>Aerosol bariyer pipet uçları 10 ve mikro; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707439</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol bariyer pipet uçları 1000 ve mikro; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707404</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol bariyer pipet uçları 200 & mikro; l (Fisherbrand)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707430</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100X)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Sığır hipofiz özü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13028-014</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 30 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid Konsantresi (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Kollajen yüksek konsantrasyon, sıçan kuyruğu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>354249</td><td>50 &mikro; g / mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 0.393 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331-020</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1X</td></tr><tr><td>E-kaderin Tavşan anti-İnsan, Sıçan, Poliklonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32178</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Eclipse TE300 ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>görüntüleme</td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>NRC tam orta final konsantrasyon = 0.32 mM</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 5:100 seyreltme</td></tr><tr><td>DAPI ile Fluoroshield (Montaj ortamı)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %16 (A/V)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28906</td><td>%4 (A/H)</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-064</td><td>1:10 seyreltme</td></tr><tr><td>Hamamatsu kamera (Dijital kamera C11440 ORCA - flaş 4.OLT)</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>görüntüleme</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155</td><td>5 & mikro; g / mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Keçi anti-Tavşan, Alexa Fluor Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32733</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>ImageJ sürüm 2.0.0-rc-69/1.52n</td><td></td><td></td><td>Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51300-044</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Matrigel GFR (stok konsantrasyonu 9.7 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>356231</td><td>4:10 seyreltme</td></tr><tr><td>NIS Elements yazılım sürümü 4.50.00</td><td>Nikon</td><td></td><td>görüntü alma ve görüntüleme</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler-Çözeltisi (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Amaç Planı Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&infin;/1.2 WD 15.2)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Altın Antifade Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Probidyum İyodür (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>20 & mikro; g / mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>16.2 nM nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sir-Actin / Verapamil kiti</td><td>Spirochrome</td><td>SC001</td><td>10 & mikro; M nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 50 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Steril hücre süzgeci 40 & mikro; m (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Steril pipetler 10 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Steril pipetler 5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Steril tüpler 1,5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Steril tüpler 15 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7200886</td><td></td></tr><tr><td>Steril tüpler 50 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>553913</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>5:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Doku kültürü ile tedavi edilmiş şişe 25cm2 (Falcon)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>5:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05) fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>1X</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>5:10000 seyreltme</td></tr><tr><td>Vitamin (100X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-037</td><td>NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>&-Slayt 8 Peki ibiTreat, Ibidi</td><td>Clinisciences</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

fonksiyonel ve polarize safra epitel kistlerinin oluşumu ve kantitatif karakterizasyonu

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Kolanjiyositler, karaciğerdeki safra kanallarını oluşturan epitel hücreleri, safra oluşumunu ve modifikasyonu denetler. Son yirmi yılda, karaciğer hastalıkları bağlamında, kolanjiyositlere dayalı 3 boyutlu (3D) modeller, organogenez, hastalık modellemesi ve ilaç tarama çalışmaları için doku topolojisini taklit etmek için kistler, küreseloidler veya tüp benzeri yapılar gibi ortaya çıkmıştır. Bu yapılar esas olarak bir hidrojel kolanjiyositkitler katıştırma ile elde edilmiştir. Temel amaç epitelyal polarite, fonksiyonel ve morfolojik özellikleri ele alarak kendi kendini örgütleme çalışması oldu. Ancak, çok az çalışma kist oluşumu verimliliği üzerinde duruluyor. Bu durumda, verimlilik genellikle tek bir düzlemin görüntülerinden ölçülür. Hidrojel polimerizasyon heterojenitelerinden ve yan etkilerinden kaynaklanan kist dağılımının potansiyel heterojenliğini temsil etmeden fonksiyonel tahliller ve yapısal analizler yapılmaktadır. Bu nedenle, nicel çözümleme yapıldığında, bir makaleden diğerine karşılaştırma için kullanılamaz. Ayrıca, bu metodoloji farklı matrisler ve hücre türlerinin 3D büyüme potansiyelinin karşılaştırmalarına izin vermez. Ayrıca, immünboyama kistler için deneysel sorun giderme söz yoktur. Bu makalede, ilk hücre dağılımının kist oluşumunun heterojen dikey dağılımı ile ilişkili olduğunu göstermek için güvenilir ve evrensel bir yöntem sayılmiyoruz. Hidrojel gömülü kolanjiyosit hücreleri 10 gün boyunca hidrojel derinliği boyunca Z-yığınları analizi ile takip edilir. Bu yöntemle kist oluşumunda verimlilik ve büyüme sağlam bir kinetik elde edilir. Ayrıca kist polaritesini ve salgı fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler saklıyız. Son olarak, görüntüleme için kist çöküşünü sınırlamak için immünboyama protokollerini optimize etmek için ek ipuçları sağlanmıştır. Bu yaklaşım diğer 3D hücre kültürü çalışmalarına uygulanabilir, böylece bir sistemi diğer sistemle karşılaştırma olanakları açılabilir.

Kistlerin oluşumu ve karakterizasyonu 3D hücre kültür sistemleri organogenez ve hastalık modelleme25çalışma için önemli bir araçtır. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğu nitel veya çeşitli çalışmalar arasında kist oluşumu verimliliği açısından herhangi bir karşılaştırma önleme, değişken ve genellikle belirtilmemiş hacimlerde, kistler ve non-kistler karşı kistlerin sayısı karşılaştırarak tek bir düzlemde yapılan iç nicelleştirme kullanın7,<sup clas...

Üç boyutlu (3D) hücresel sistemler organogenezin araştırılması için uygun modellerdir. Safra kist üretimi ve karakterizasyonu için hidrojel bazlı bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, kist oluşumu verimliliğini, boyutlarını değerlendirmek ve işlevselliklerini test etmek için basit ve güvenilir bir yöntemle 3B karakterizasyonunun engellerini ortadan kaldırmaktadır.

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Bu safra kistleri üreten ilk protokol, kist oluşumu, verimlilik ve zaman içinde boyut değerlendirilmesi sağlayan sistematik bir analiz sağlayan. Bu yöntem epitel kist oluşumunun kantitatif değerlendirmesini sağlar ve epitel hücreleri veya hidrojel tipinin bir fonksiyonu olarak bu sürecin değerlendirilmesini mümkün kılar. Safra bozuklukları için tedavi seçenekleri sınırlı olduğundan, bu protokol ilaç çalışmalarının standartlaştırılması, normal terapötik hedeflerin belirlenmesi ve hastalık mekanizmalarının anlaşılması için kapı açmaktadır.Basit yöntem, tübüler yapıların biyomühendisliği alanındaki yeni bilgi mekanizmaları ile ilgili önemli soruların ele alınmasını sağlar. Bir deneye başlamadan önce, uygun bir hidrojel çözeltisi dört santigrat derece ve önceden soğutulmuş pipet uçları ve eksi 20 santigrat derece bir gecede sekiz kuyu odası slayt eritin. Ertesi sabah, buz üzerinde hidrojel ve sekiz iyi oda slayt yerleştirin ve% 40 hidrojel çözeltisi 500 mikrolitre elde etmek için soğuk normal sıçan kolanjiyosit tam orta hidrojel uygun hacmi ekleyin.Daha sonra oda kaydırağının her kuyunun ortasına 50 mikrolitre hidrojel çözeltisi eklemek için soğuk pipet uçlarını kullanın ve çözeltiyi kabarcıklar olmadan mümkün olduğunca iyi alt yüzeyine yaymak için bir pipet ucu kullanın. Deney için hücreleri hazırlamak için, hidrojel polimerize iken, önceden ısıtılmış PBS ile% 70 konfluent normal sıçan kolanjiyosit kültüründen hücreleri yıkayın ve hücre kültürü kuluçka 20 dakika boyunca taze önceden ısıtılmış PBS beş mililitre ile hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, PBS'yi önceden ısıtılmış bir mililitre Trypsin-EDTA ile değiştirin ve şişeyi 5 ila 10 dakika hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.Hücreler ayrıldığında, önceden ısıtılmış tam normal sıçan kolanjiyosit orta dört mililitre ile reaksiyon nötralize ve santrifüj için 15 mililitrelik tüp hücreleri transfer. Daha sonra peleti beş mililitre önceden ısıtılmış ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe sintin. Kistler oluşturmak için, 1 elde etmek için soğuk tam normal sıçan kolanjiyosit orta uygun hacim ekleyin, buz üzerinde% 80 hidrojel çözeltisi 600 mikrolitre ve beş kez hücreleri seyreltmek 1, orta 1, orta soğuk tam normal sıçan cholangiocyte orta konsantrasyonu mililitre başına beş kez 10 hücreleri.Hemen hücre ve hidrojel hücre çözeltileri karıştırın ve kabarcıklar önlemek için özen, hidrojel kaplı oda slayt her kuyuya hücrelerin 400 mikrolitre ekleyin. Tekrarlanabilir ve önemli sonuçlar elde sağlamak için, hidrojeli dikkatlice işletmeyi ve homojen bir çözüm elde etmek için ilk hücre hidrojen çözeltisini iyice karıştırdığından emin olun. Tüm hücreler tohumlanmış zaman, hücre kültürü kuluçka slayt yerleştirin.Kültürde iki gün sonra, her kuyunun bir köşesinden orta 250 mikrolitre çıkarın, hidrojel dışarı floş değil dikkat, ve yavaş yavaş taze kültür orta 250 mikrolitre ile atılan supernatant değiştirin. Kist görüntüleme için, kültürün uygun gününde, görüntü edinme yazılımı ile donatılmış faz kontrast mikroskobundaki 10 X hedefini seçin, beyaz lambayı açın ve brightfield görüntüleme seçeneğini seçin. Kamerayı açmak ve kistler in bir alana odaklanmak için oynat'ı seçin.Pozlama süresini ayarlayın ve görüntülerin otomatik olarak kaydedilmesine izin vermek için otomatik yakalama klasörü penceresini açın. Yakalama Z serisi penceresini açın, varsayılan konumu sıfırlayın ve Z-yığınının üst ve alt düzlüklerini tanımlamak için Z vidasını kullanın, hedefe ve çözünürlük düzeyine bağlı olarak Z adımını ayarlayın. Sonra satın alma başlatmak için şimdi çalıştır'ı tıklatın.Görüntülemeden sonra Fiji'deki Z-yığınını açın. Yığını çoğaltmak için, görüntüyü, yinelenen yığını tıklatın ve yinelenen yığını tıklatın. Yinelenen yığından, görüntü menüsünün altında en az yoğunluklu projeksiyon oluşturmak için yığınlar ve Z projesini seçin.Projeksiyon türü için minimum yoğunluğu seçin ve tamam'ı tıklatın. Projeksiyondan arka planı çıkarmak için, işlem menüsünün altında arka planı çıkarın ve kistleri arka plandan daha zıt hale getirmek için 500 piksel yuvarlanan top yarıçapı ve ışık arka planı seçin. Yaklaşık kist çapını ölçmek için, hedeflenen kisti yakınlaştırın, düz çizgi aracını seçin ve klavyedeki T düğmesine basın.Son projeksiyon üzerinde her kistçapı boyunca bir çizgi çizin. Her kist için oluşturulan bir sonraki ilgi bölgesi, ilgi yöneticisi nin bulunduğu bölgeye eklenecektir. Tüm kistler sayıldığında, z-yığın penceresine tıklayın ve sayılan kistleri görmek için tümünü göster'i tıklatın.İmleci Z-yığını boyunca hareket ettirerek, tüm kistlerin her görüntüde sayılandı ve gerektiğinde ilgi çekici yönetici bölgesine yeni kistler ekleyerek kontrol edin. Tüm kistler sayıldığında, ilgi alanı kümesi bölgesini seçin ve daha fazla tıklatın ve verileri kaydetmek için kaydedin. Her kistin boyutunu belirlemek için, ilgi alanları hala seçiliyken, ölçü'ye tıklayın.Her kist ve tahmini boyutunu listeleyen bir pencere görüntülenir. Ardından verileri CSV formatında kaydedin. Gösterildiği gibi, zaman içinde kistlerin sayısının ve ilgili boyutlarının kaydedilmesi, kist oluşumu ve büyümesinin evriminin analizini sağlar.Başlangıç hücre popülasyonunun ve 10 günlük kistlerin canlı/ölü boyama ile canlılığı değerlendirilebilir. Ölü hücreler 10. Floresan diasetat ve Hoechst ile kuluçka bazal dan apikal luminal alana Floresan oluşumu ve salgılanması nın değerlendirilmesi sağlar.Özellikle, Floresan salgılanması çok ilaca dirençli inhibitör ile ön tedavi ile inhibe edilir, lümen içinde floresan Floresan birikimi çok ilaca dirençli taşıyıcı yoluyla salgı nedeniyle olduğunu gösteren ve hücreler arası uzaydan sızıntı değil. E-kadherin ekspresyonu için boyama normal sıçan kolanjiyositlerinin hidrojelde epitel fenotiplerini en az 10 gün süreyle koruduklarını ortaya koymaktadır. İmmünofluoresans değerlendirme için kistler hazırlanırken, doygunluk sırasında sığır serum albumin %0.1 veya daha az tutulması kist bütünlüğünün korunmasında anahtardır, çünkü yüksek konsantrasyonlar kist geri çekilmesi ve lümen çökmesine neden olur.Bir gecede hidrojel, erime, pipet ucu ve hazne slayt kaydı, buz üzerinde çalışma ve homojen hücreli hidrojel karışımının kültür odası slaytına eşit olarak yayılması deneysel başarı için çok önemlidir. Bu yöntem, epitel polarizasyon daha iyi anlaşılması için karşılaştırmalar sağlayan, diğer epitel hücreleri veya hidrojeller kistler oluşturmak için kullanılabilir. Bu kantitatif yöntem, ilaçların veya genetik mutasyonların safra fonksiyonu ve organogenez üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılabilir.

generation-quantitative-characterization-functional-polarized-biliary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

Burada insan nazal epitel hücreleri kültürleri üç boyutlu küresel oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pulcuklarının sonra sürücüye Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) teşvik-bağımlı iyon ve CFTR işlevi için bir proxy gibi küresel luminal boyutunda değişiklik miktarının sıvı salgılanması.

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu

Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Öğrenin, hidrojel tabanlı yöntemle fonksiyonel safra epitel kistlerinin oluşumunu ve kantitatif karakterizasyonunu. Bu protokol, biliyer hastalıkların tedavi hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olur.

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet