Name: Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, hipokampal nöronlarda akson ilk segmenti montajını nicel olarak incelemek için birincil kültür yöntemini. Bu protokol, ankyrin-G eksikliğinde AIS yapısını değerlendirerek nöronal gelişim ve işlev mekanizmalarını aydınlatır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nöronal kültür protokolü önerisi için Dr. Gary Banker'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü, NIH'den bir hibe ve George Barth Geller tarafından profesörlük (V.B.

NOT: Doğum sonrası 0 günlük ANK3-E22/23f/f farelerden hipokampal nöronların bu kültür yöntemi Gary Banker'ın glia/nöron ortak kültür sisteminden uyarlanmıştır. Bu nedenle, sterilize edilmiş aletler kullanarak temiz bir başlıkta diseksiyondan sonra tüm adımların gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu protokol 1 aya kadar sürer. İş akışı Şekil 3'te görüntülenir. Protokol Duke Üniversitesi'nin hayvan kurallarına uyuyor.
1. Kapak ve nöronal kaplama yemeklerinin hazırlanması
<ol><li>Kültür gününden en az bir hafta önce, kapak kapaklarını kapak rafı üzerine yükleyin ve gece boyunca nitrik aside (% 70 W / W) batırın (günlerce uzatılabilir).</li>
	<li>Nitrik asitle işlenmiş kapak örtülerini damıtılmış suyla, her biri 1 saat olmak üzere 2 kez bir cam kavanozda düşük hızlı bir çalkalayıcıda yıkayın.</li>
	<li>Doymuş KOH'daki inkübatif kapaklar bir gecede% 100 etanolde çözülür. Koh'u artık çözünene kadar etanol içine ekleyin.</li>
	<li>Yıkama adımını damıtılmış suyla tekrarlayın. Kapak örtülerini 10 dakika boyunca bir kez% 100 etanol ile durulayın.</li>
	<li>Kapakları raftan cam bir behere aktarın. Beheri alüminyum folyo ile örtün. Kapakları sterilize etmek için gece boyunca 225 °C fırında coverlips pişirin. (Kapaklar haftalarca beherde saklanabilir).</li>
	<li>Kapakları bir Petri kabına yerleştirin ve ardından ayak görevi görmek için kapak kılıfı üzerine 3-4 balmumu noktası uygulayın. Cam şişede haşlanmış balmumuna daldırmak için pasteur pipet kullanın. Ardından bir nokta oluşturmak için kapak kılıfı'na hızlı bir şekilde dokunun. 60 mm Petri kabı 4 kapak kılıfı tutabilir. 10 mm Petri kabı ~ 10 kapak kılıfı tutabilir.</li>
	<li>Kültür gününden 2 gün önce, 0,1 M borik asitte (pH 8,5) 1 mg/mL poli-L lizini sterilize edilmiş filtreli palto örtüleri (balmumu noktaları ile yan) en az 6 saat boyunca ve her seferinde 2 kez, 1 saat su ile durulayın. Kapaklar aynı Petri kabında kalır.</li>
	<li>Kaplama ortamını (MEM glikoz ile desteklenmiş MEM% 0.6 (wt / vol) ve% 10 (vol / vol) at serumu) rahatsız edici kapaklar olmadan yavaşça plakalara ekleyin. Nöronları tohumlamak için kültür gününe kadar inkübatöre plaka koyun.</li>
</ol>2. Glia hücre besleyici yemeklerinin hazırlanması (kültür gününden 2 hafta önce)
<ol><li>Korteksi doğum sonrası 1 günlük fare beyninden parçalara ayrıştırın ve menenjitleri soyun.</li>
	<li>Korteks dokusunu temiz bir bankta temiz bir Petri kabında temiz bir makasla mümkün olduğunca ince doğrayın.</li>
	<li>Doğranmış dokuyu 12 mL HBSS'ye aktarın ve %2,5 tripsin ve %1 (wt/vol) DNase'nin 1,5 mL'sini ekleyin. 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatır, her 5 dakikada bir sallan. İyi sindirilmiş doku yapışkan hale gelir ve büyük bir küme oluşturur. Dokuyu parçalamak ve daha iyi sindirim elde etmek için 10 mL pipetle 10-15 kez tritüre edin.</li>
	<li>İyi sindirilmiş dokuyu 5 mL pipetle 10-15 kez tritüre edin, ta ki çoğu parça kaybolana ve ortası bulanıklaşana kadar. Kalan parçaları çıkarmak için bir hücre süzgecinden geçirin ve sindirimi durdurmak için glikoz (%0,6 wt/vol), %10 (vol/vol) at serumu ve Penisilin-Streptomisin (1x) ile desteklenmiş 15 mL glia ortamı (Minimum esansiyel ortam (MEM) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 120 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Hücre peletini taze glia ortamı ve hücre kültürü yemeklerinde tohumla yeniden depola (yaklaşık 105 hücre /cm2).</li>
	<li>Eklenmemiş hücreleri çıkarmak için ertesi gün ortamı taze glia ortamıyla değiştirin.</li>
	<li>Glia yemeklerini her 3-4 günde bir taze glia ortamı ile besleyin. Ortamı değiştirmeden önce gevşek bağlı hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi bir el ile 5-10 kez tokatlayın.</li>
	<li>10 günlük kültürden sonra, glia hücreleri neredeyse bir araya gelmeli. Glia hücrelerini% 0.25 tripsin-EDTA ile ayır ve yeni bir 60 mm hücre kültürü çanağı içinde yaklaşık 105 hücre tohumlayın. Kalan hücreler ileride kullanılmak üzere dondurulabilir.</li>
	<li>Kültür gününden 3 gün önce, glia ortamını nöronal kültür ortamına değiştirin (1x GlutaMAX-I ve 1x B27 takviyesi ile Neurobasal-A Medium).</li>
</ol>3. Kültür hipokampal nöronlar
NOT: Tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
<ol><li>6-8 hipokampiyi ANK3-E22/23f farelerden doğum sonrası 1 günlük yavrulardan oda ılıman bir Petri kabında HBSS ortamı ile parçalara ayırt edin. Hipokampiyi diseksiyon makasıyla daha küçük parçalara bölün. Hipokampiyi Petri kabından 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hipokampi 2x'i tüpte 5 mL HBSS ile yıkayın. Hipokampiyi yıkadıktan sonra 4,5 mL 1x HBSS'de bırakın.</li>
	<li>4,5 mL HBSS'ye %2,5 trypsin 0,5 mL ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü her 5 dakikada bir ters çevirin. İyi sindirilmiş hipokampi yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır. Gerekirse, sindirimi 5 dakika daha uzatın.</li>
	<li>Hipokampiyi HBSS ile 3 kez 5'er dakika yıkayın. HBSS'yi çıkarmak için vakum kullanmayın. Hipokampiyi çıkarmak çok kolaydır.</li>
	<li>Yıkadıktan sonra 2 mL HBSS ekleyin ve hipokampiyi 15 kez Pasteur pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Dokuyu ateş cilalı bir Pasteur pipetle (açık çapı yarı yarıya daralır) 10 kez üçe bölün. Hala kalan parçalar olsa bile 10 kezden fazla gitmeyin. Aşırı kulak misafiri nöronları öldürür.</li>
	<li>Tüm parçalar tabana ayarlanana kadar tüpü 5 dakika dinlendirin. Ayrışmış nöronları içeren süpernatantı kaplama yemeklerine (10 5 hücre/60 mm çanak) aktarmak için hafifçe1 mL pipet ucu kullanın. Doğrudan önceden inkübe edilmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın.</li>
	<li>Parçaların çoğu kaybolana kadar kalan parçalarla 3.6-3.7 adımını yineleyin.</li>
	<li>Tohumlamadan 2-4 saat sonra, kaplama yemeklerini hafif bir mikroskopla kontrol edin. Nöronların çoğu kapak kılıflarına bağlı olmalıydı. Bağlı hücreler yuvarlak ve parlaktır. Balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ön koşulsuz nöronal kültür ortamına sahip glia hücre besleyici yemeklerine ince bir uçlu önseçimler kullanarak kapakları çevirin.</li>
	<li>Nöronlar glia hücre besleyici yemeklerinde 1 aya kadar büyüyebilir. Nöronları 7 günde bir 1 mL taze nöron kültürü ortamı ile besleyin.</li>
	<li>İsteğe bağlı adım: Tohumlamadan 1 hafta sonra, glial çoğalmasını önlemek için 5 μM'lik son konsantrasyona sitozin arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) ekleyin.</li>
</ol>4. Nöron gelişiminin erken aşamasında Ankyrin-G'nin Nakavtı ile AIS'nin Bozulması
<ol><li>3 div (gün in vitro),bir glia hücre besleyici kabına bakan balmumu noktaları tarafı ile kapakları koşullandırılmış nöronal kültür ortamı ile çevirin.</li>
	<li>4 kapaklıyı (~ 2:1 DNA kopya numarası oranı) transfect etmek için 1,7 mL tüpte 0,25 μg Cre-BFP DNA'sını 0,5 μg ankyrin-G-GFP (WT/mutant) DNA ile karıştırın. 100 μL kültür ortamı ekleyin (örneğin, Opti-MEM), karıştırın ve bir rafa dinlendirin. Sadece Cre-BFP transktrise, GFP plazmid omurgası toplam DNA miktarıyla eşleşmek için kullanılır.</li>
	<li>Yeni bir 1,7 mL tüpte 3 μL transfeksiyon reaktifini (örneğin Lipofectamine 2000) (~ 3 kez DNA) 100 μL kültür ortamı ile karıştırın. RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>4.2. adımdan 100 μL DNA çözeltisi ile 4.3. Bir rafta 5-10 dakika dinlendirin.</li>
	<li>Kapağın ucuna dokunmadan ortamın hemen altına yerleştirerek her kapak kapağının tam üstüne 4,4 adımdan 50 μL DNA karışımı ekleyin. DNA karışımının yayılmasını önlemek için pipet yavaşça.</li>
	<li>Yemeği yavaşça inkübatöre geri getirin ve 30-45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kapakları, balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ev glia besleyici kabına geri çevirin ve plakayı inkübatöre geri koyun.</li>
</ol>5. Akson başlangıç segmentinin nicelleştirilmesi
<ol><li>Nöronları 7-10 div'e sabitleyin ve ilginç protein için standart immünostokimya protokolünü izleyerek AIS işaretleyici ile lekeleyin.</li>
	<li>İstediğiniz mikroskopi ile floresan resimleri toplayın.<ol>
<li>Tüm AIS'nin sinyalini toplamak için Z serisi bölümler alın. Tüm resimler için aynı Z derinliğini koruyun.</li>
		<li>En iyi piksel yoğunluğu dinamik aralığına ulaşmak için lazer yoğunluğunu ayarlayın.</li>
		<li>Tüm AIS resimlerinin aynı mikroskop kurulumunda çekildiğinden emin olun.</li>
		<li>Her zaman Cre-BFP'nin sinyalini kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AIS nicelemesi<ol>
<li>Fiji (https://fiji.sc) ile resmi açın.</li>
		<li>Z serisi görüntülerin maksimum projeksiyonu oluşturun.</li>
		<li>Görüntüden boş kapak altlık arka plan sinyalini çıkarın.</li>
		<li>AIS boyunca bir çizgi çizin. Hattın genişliği AIS'i tamamen kapsamalıdır. AIS sinyali arka planın üzerine çıkmadan önce satırı başlatın ve arka plana düştükten sonra durun.</li>
		<li>Ortalama piksel yoğunluğunu tek başına çizgi olarak ölçün ve bir elektronik tabloya dışa aktarın (~10-15 AIS gereklidir).</li>
		<li>Berger ve ark.15'ten uyarlanan MATLAB komut dosyasını kullanarak AIS'nin ortalama yoğunluk eğrisini oluşturun.</li>
		<li>Her deney için, AIS'nin nakavtının verimlilik ve kurtarmanın başarılı olduğundan emin olmak için negatif ve pozitif kontroller olarak yalnızca Cre ve Cre artı wildtype 480 kDa ankyrin-G transfected nöronları ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

AIS montajı 480 kDa ankyrin-G tarafından düzenleniyor. Bununla birlikte, ankyrin-G, wildtype nöronların AIS'sine hedefleyebilen daha kısa izoformlara sahiptir ve bu da AIS montajının yapı-fonksiyon analizlerinin yorumlanmasında zorluk çekebilir. Burada, AIS'nin de novo montajının incelenmesine izin veren ANK3-E22/23-flox farelerden nöronları kullanarak bir yöntem sunuyoruz. Cre-BFP ile 3 div'de transfecting yaparak, ankyrin-G'nin tüm endojen izoformlarını ortadan kaldırırız. Ayrıca AIS oluşumunu kurtarm...

Akson başlangıç segmenti çoğu omurgalı nöronda proksimal aksonda bulunur. İşlevsel olarak, AIS, bu bölgedeki voltaj kapılı sodyum kanallarının yüksek yoğunluğu nedeniyle eylem potansiyellerinin başlatıldığı yerdir. Bazı uyarıcı nöronların AIS'si de GABAergic sinapsları1,2,3oluşturarak inhibitör internöronlar tarafından hedeflenir. Bu nedenle, AIS hücre sinyallerini entegre etmek ve nöronların heyecanlanabilirliğini modüle etmek için kritik bir sitedir. AIS normalde 20-60 μm uzunluğundadır ve hücre gövdesinin 20 μm içinde bulunur. AIS'nin uzunluğu ve konumu beyin bölgelerindeki nöronlarda ve aynı nöronun farklı gelişim aşamalarında değişir4,5. Birikmiş kanıtlar, AIS'nin bileşiminin ve konumunun nöronal aktivitenin değişimine yanıt vermede dinamik olduğunu öne sürdü4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G, AIS'nin ana organizatörüdür. 480 kDa ankyrin-G, voltaj kapılı sodyum kanallarına ve beta4-spectrin dahil olmak üzere diğer büyük AIS proteinlerine doğrudan bağlanan membran ilişkili bir adaptör proteinidir, Sodyum kanal aktivitesi 8,9ve186kDa nörofascin modüle eden KCNQ2/3 kanalları, GABAergic sinapsları AIS 2,10'ayönlendiren bir L1CAM . 480 kDa ankyrin-G, kısa 190 kDa ankyrin-G izoformunda bulunan kanonik ankyrin etki alanlarını paylaşır (ANK tekrarları, spectrin bağlama etki alanı, düzenleyici alan adı), ancak sadece omurgalılarda bulunan ve özellikle nöronlarda ifade edilen dev bir ekson ile ayırt edilir (Şekil 1A)11,12. AIS oluşumu için 480 kDa ankyrin-G nöron spesifik etki alanı (NSD) gereklidir12. 190 kDa ankyrin-G, AIS montajını desteklemez veya ankyrin-G-null nöronlarda AIS'i hedeflemez12. Bununla birlikte, 190 kDa ankyrin-G, 480 kDa ankyrin-G12içeren AIS'de yoğunlaşmıştır. 190 kDa ankyrin-G'nin wildtype nöronların önceden monte edilmiş AIS'lerini hedefleme yeteneği literatürde bir karışıklık kaynağı olmuştur ve AIS montajındaki 480 kDa ankyrin-G'nin kritik özel işlevlerinin takdirini yavaşlatmıştır. Bu nedenle, önceden monte edilmiş bir AIS'den yoksun ankyrin-G-null nöronlarda AIS derlemesinin incelenmesi kritik öneme sahiptir.
Burada, ankyrin-G13'ün tüm izoformlarını ortadan kaldıran ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronlar kullanarak AIS'nin montajını ve yapısını incelemek için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1B). AIS toplanmadan önce nöronları Cre-BFP yapısı ile transfekte ederek, tamamen AIS'den yoksun ankyrin-G eksikliği olan nöronlar ürettik (Şekil 1B, Şekil 2). AIS montajı, 480 kDa ankyrin-GFP plazmidinin Cre-BFP plazmid ile birlikte transfeksiyonu sonrasında tamamen kurtarılır. Bu yöntem, önceden monte edilmemiş bir AIS ortamında AIS derlemesini incelemek için bir yol sağlar. Ayrıca, daha önce embriyonik gün 18 nöronları için tasarlanmış antibiyotik kullanmadan Gary Banker'den glia-nöron ortak kültür sistemini, doğum sonrası fare nöronlarına uygulama için değiştirdik ve AIS14,15varyasyonunu normalleştirmek için birden fazla nörondan ortalama AIS ölçümlerine bir AIS nicelasyon yöntemi uyarladık.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm kapak camı (1.5D)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa ankirin-G-GFP</td><td>Addgene</td> <td># 31059</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı olmayan% 2.5 Tripsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa ankirin-G-GFP</td><td>laboratuvarı yapımı</td><td>İstek</td> <td>üzerine sağlayın</td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f fareler</td><td>JAX</td><td>Stok No: 029797</td><td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>B27 serumsuz takviye edici gıda</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>70 mm gözenekli hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Seramik lamel boyama rafı</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td> <td># 128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Earle 'ile MEM s tuzları ve L-glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik asit %70</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

axon İlk segmentlerinin montajını İncelemek için birincil kültürlü hipokampal nöronların kullanımı

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Nöronal akson başlangıç segmentleri (AIS) eylem potansiyellerinin başlangıç alanlarıdır ve moleküler yapıları, montajları ve aktiviteye bağımlı plastisiteleri için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. AIS'nin ana organizatörü dev ankyrin-G, membran yayılan voltaj kapılı sodyum (VSVG) ve potasyum kanalları (KCNQ2/3) ve L1CAM hücre yapışma molekülü olan 186 kDa nörofassin ile doğrudan ilişkilidir. Dev ankyrin-G ayrıca beta-4-spectrin ve mikrotübül bağlayıcı proteinler, EB1/EB3 ve Ndel1 dahil olmak üzere sitoplazmik AIS moleküllerine bağlanır ve işe alınır. Dev ankyrin-G, ankyrin-G eksik nöronlarda AIS oluşumunu kurtarmak için yeterlidir. Ankyrin-G ayrıca AIS yerine dendritik dikenlerde bulunan ve AIS'yi hedef alama veya ais'yi ankyrin-G eksikliği olan nöronlarda kurtaramayan daha küçük bir 190 kDa izoform içerir. Burada, Cre-BFP ile enfekte olduğunda tüm ankyrin-G izoformunun kaybını sergileyen ve AIS oluşumunu bozan ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronları kullanan bir protokol tanımladık. Modifiye banker glia/nöron ortak kültür sistemini birleştirerek, AIS oluşumunu kurtarmak için yeterli olan 480 kDa ankyrin-G-GFP plazmid ile ankyrin-G null nöronları transfect etmek için bir yöntem geliştirdik. Ayrıca, Hipokampal nöron kültürlerinde meydana gelen nöronal hücre cisimlerinden AIS uzaklığındaki varyasyonla başa çıkmak için Salzer ve meslektaşlarımız tarafından geliştirilen bir niceleme yöntemi de kullanmaktadır. Bu protokol, de novo montajının nicel çalışmalarına ve AIS'nin dinamik davranışına izin verir.

Tam bir deney seti, negatif kontrol olarak cre-BFP sadece transfection, pozitif kontrol olarak Cre-BFP artı 480 kDa ankyrin-G ko-transfection ve teknik kontrol olarak transktaklı olmayan bir durumu içermelidir. Cre-BFP'de sadece kontrol, transfected nöronlar ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), nörofassin (Nf) ve voltaj kapılı sodyum kanalları (VSVG) dahil olmak üzere AIS belirteçlerinin birikmesinden yoksundur (Şekil 4A)16. Buna karşılık, Cre ve 480 kDa ankyrin-G k...

Burada, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Bu protokol, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun Hipokampal Nöronların akson ilk segmentlerinin montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için kullanılır. Başlamak için, bir Petri kabında HBSS ortamına sahip altı ila sekiz hipokampiyi doğum sonrası, bir günlük yavrulardan parçalara ayırt edin. Hipokampiyi diseksiyon makasıyla daha küçük parçalara ayırın ve tabaktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hipokampiyi beş mililitre HBSS ile iki kez yıkayın ve yıkadıktan sonra 4,5 mililitre HBSS'de bırakın. 4,5 mililitre HBSS'ye 0,5 mililitre %2,5 trypsin ekleyin ve 37 santigrat derecelik su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırarak tüpü her beş dakikada bir ters çevirin. İyi sindirilmiş hipokampi yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır.Gerekirse, sindirimi beş dakika daha uzatın. Hipokampiyi HBSS ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, iki mililitre HBSS ekleyin ve hipokampiyi 15 kez pasteur pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.Dokuyu 10 kez ateş cilalı pasteur pipetle üçe bölün ve tüm parçalar dibe ayarlanana kadar tüpü beş dakika dinlendirin. Çoğu kaybolana kadar tritürasyonu kalan parçalarla tekrarlayın. Daha sonra, ayrışmış nöronları içeren süpernatantı kaplama yemeklerine hafifçe aktarmak için bir mililitre pipet ucu kullanın.Doğrudan önceden inkübe edilmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın. Tohumlamadan iki ila dört saat sonra, kaplama yemeklerini hafif bir mikroskopla kontrol edin. Nöronların çoğu kapak kaymasına bağlı olmalıydı.İnce uçlu bir önpsek kullanarak, kapak kaymalarını balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ön koşullanmış nöronal kültür ortamı içeren glial hücre besleyici tabaklarına çevirin. Nöronlar glial hücre besleyici yemeklerinde bir aya kadar büyüyebilir. Nöronları her yedi günde bir mililitre taze nöron kültürü ortamıyla besleyin.Üçüncü gün in vitro, balmumu nokta tarafı yukarı bakacak şekilde kapak kaymalarını şartlandırılmış nöronal kültür ortamına sahip bir glial hücre besleyici kabına çevirin. Dört kapak fişini transfect etmek için 1,7 mililitrelik bir tüpte 0,25 mikrogram CRE BFP DNA'sını 0,5 mikrogram ankyrin-G GFP DNA ile karıştırın. Optimum 100 mikrolitre ekleyin.Sonra tüpü karıştırın ve bir rafa dinlendirin. Sadece CRE BFP transfected ise, GFP plazmik omurgası toplam DNA miktarıyla eşleşmek için kullanılır. Üç mikrolitre transfeksiyon reaktifini 1,7 mililitrelik yeni bir tüpte 100 mikrolitre optimum ile karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, daha önce karıştırılan DNA'nın 100 mikrolitresini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif karışımı ile karıştırın ve bir rafta beş ila 10 dakika bekletin. Kapak kaymalarına dokunmadan ucu ortamın hemen altına yerleştirerek her kapak fişinin üzerine 50 mikrolitre DNA karışımı ekleyin. DNA karışımını yaymamak için yavaşça pipet.Yemeği yavaşça inkübatöre geri getirin ve 30 ila 45 dakika orada bırakın. Kapak kaymalarını balmumu nokta tarafı aşağı bakacak şekilde ev glial besleyici kabına geri çevirin ve kabı tekrar inkübatöre koyun. AIS nicelemesi için Fiji'deki Z serisi görüntüleri açın ve maksimum görüntü projeksiyonu oluşturun.Görüntüden boş kapak kayması arka plan sinyalini çıkardıktan sonra, çizginin genişliğinin AIS'yi tam olarak kapsadığından emin olarak AIS boyunca bir çizgi çizin. AIS sinyali arka planın üzerine çıkmadan önce satırı başlatın ve arka plana düştükten sonra durun. Satır boyunca ortalama piksel yoğunluğunu ölçün ve bir elektronik tabloya dışa aktarın.Ardından, son rakamı oluşturmak için bir MATLAB komut dosyası çalıştırın. Deney, negatif kontrol olarak sadece Cre-BFP transfeksiyonunu, pozitif kontrol olarak Cre-BFP artı 480 kilodalton ankyrin-G kotransfeksiyonunu ve teknik kontrol olarak transfeksiyonsuz bir durumu içermelidir. Sadece Cre-BFP kontrolünde, transfected nöronlar ankyrin-G, beta 4 spektrin, nörofassin ve voltaj kapılı sodyum kanalları da dahil olmak üzere AIS belirteçlerinin birikmesinden yoksundir.Buna karşılık, Cre ve 480 kilodalton ankyrin-G ko-transfected nöronları, AIS belirteçlerinin varlığı ile gösterilen AIS'yi tamamen bir araya getirmişlerdir. Transfected olmayan yemekler ile karşılaştırıldığında kültürün kalitesini onaylamak önemlidir. Sağlıksız nöronlar, durdurulmuş veya ektopik AIS gibi anormal AIS yapısı gösterme eğilimindedir.Ankyrin-G insan nörogelişimsel bozukluk mutasyonu AIS derlemesini nasıl etkilediğini değerlendirmek için, ortalama AIS yoğunluğu somadan distal aksona kadar çizildi. AIS zenginleştirilmiş proteinler normalde proksimal aksondan gelen sinyalin hızlı bir şekilde arttığını ve sinyalin distal aksona yavaş bir şekilde azaldığını gösterir. Transfected olmayan AIS ile hizalandığında, mutant eğri daha geniştir ve eğrinin zirvesi daha düşüktür, bu da AIS'nin yapı değişikliğini düşündürür.Vahşi tip ankyrin-G, AIS'i transfected olmayanla yakından hizalanmış olarak bir araya getirmiş.

use-primary-cultured-hippocampal-neurons-to-study-assembly-axon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Diseksiyon ve bireyin beyin bölgesi hücrelerinin büyüme, hücresel ve fizyolojik parametrelere soruşturma kolaylaştırır. Biz nöron zenginleştirilmiş serum serbest bir ortamda kültürler üretir primer hücre kültür için bir metodu tanımlar.

P0 Yenidoğan Ratlarda Hipokampal Nöronlar İlköğretim Kültür

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Video, murin hipokampusundan nöronları kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Başlangıçta, hipokampus, hücre dışı doku matrisini parçalamak için enzimatik sindirime uğrar. Daha sonra, sindirilen doku, tek tek nöronları izole etmek için mekanik olarak bozulur. Son olarak, bu nöronlar glial besleyici hücreler üzerinde kültürlenir.

Fare Hipokampal Nöronlarını Kültürlemek İçin Bir Teknik

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Primer hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürleri, nörotrofik faktörleri sağlamak ve uzun ömürlülüğü sürdürmek için genellikle glia besleyici tabakaya ihtiyaç duyar. Burada, spesifik nöronal-otonom mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıran yüksek yoğunluklu bir nöronal besleyici tabakanın varlığında cam lameller üzerinde ultra düşük yoğunluklu nöronları kültürlemek için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Kullanıma hazır dondurulmuş bir nöron stoğu, sinaptik fonksiyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Burada, 96 delikli bir plaka kullanarak dondurulmuş stoktan kolay, düşük yoğunluklu bir birincil kültürü tanıtıyoruz.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Öğrenin, hipokampal nöronlarda akson ilk segmenti montajını nicel olarak incelemek için birincil kültür yöntemini. Bu protokol, ankyrin-G eksikliğinde AIS yapısını değerlendirerek nöronal gelişim ve işlev mekanizmalarını aydınlatır.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Daha fazla video keşfet