Özel Yapım Bir Dağıtım Sistemi Kullanarak Manyetik Nanopartikül Hipertermisinin In Vitro ve In Vivo Teslimatı
2 Temmuz 2020
Bu protokol, sofistike bir dağıtım ve izleme sistemi kullanarak manyetik nanopartikül hipertermisinin doğru bir şekilde verilmesi için gerekli teknikleri ve metodolojiyi sunar.
Bu yöntem önemlidir çünkü klinik öncesi modellerde manyetik nanopartikül hipertermi tedavisi sağlamak için en sağlam ve tekrarlanabilir yolu sağlar. Bu teknik, yerel ortamı, hayvan fizyolojisini ve termal dozu doğru bir şekilde izleyerek ve kontrol ederek nanopartikül hiperterminin kesin ve tutarlı bir şekilde uygulanmasını sağlar. Bu protokolü denerken, nanopartikül ısıtmanın hedef doku ile sınırlı kalması gerektiğini unutmayın.
Tekrarlanabilirliği ve güvenliği sağlamak için bol ve uygun termometri kullanmak esastır. Kaplamadan 24 saat sonra, B16 F10 murin melanom hücreleri, mililitre başına üç miligram iyonun nihai konsantrasyonuna manyetik nanopartiküller ekler. Önceden bir ortam ve manyetik nanoparçacık stok çözeltisi oluşturarak nanopartiküllerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.
Nanopartikülleri ekledikten 48 saat sonra, tedavi edilen her kuyucuğa 0.5 mililitre tripsin ekleyin ve plakayı hafifçe döndürün. Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre ortam ekleyin ve tüm hücreleri, her kuyucuk için açıkça etiketlenmiş ayrı bir tüp kullanarak 1,5 mililitrelik tüplere toplayın.
Hücreleri peletlemek için tüpleri 60G'de iki ila üç dakika döndürün. Ardından tüpleri, bobinin içindeki suyla dolu ara parçaya yerleştirin. Ortamı ve hücre paletini 37 santigrat derecede tutmak için su banyosunun sıcaklığını ayarlayın.
Tüp ve su banyosu içindeki sıcaklığı izlemek için ayrı fiber optik sıcaklık probları kurun. Soğutucuyu açın ve soğutucunun bobinden akıp akmadığını kontrol edin. Ardından güç kaynağını açın ve maksimum yüzdeyi istenen alana ayarlayın.
10 kilovatlık bir jeneratörle çalışan 14 dönüşlü solenoid bobini 165 kilohertz ve metre başına 23.87 kiloamperde çalıştırın. Önceden belirlenmiş bir protokol termal dozuna ulaşılana kadar hücreleri tedavi edin. İşlemden sonra, peletlenmiş hücreleri tüplerin içindeki ortamdan yeniden süspanse edin ve bunları yeni, açıkça etiketlenmiş altı oyuklu plakalara yeniden plakalayın.
Fareyi uyuşturduktan sonra, tümörü alkollü bir mendille temizleyin. Manyetik nanopartikülleri AMF tedavisinden üç saat önce tümöre enjekte edin. Üç saat sonra, fareyi tekrar uyuşturun ve doğru reflekslere yanıt verilmediğini kontrol edin.
Farenin üzerindeki kulak küpesini veya diğer metal nesneleri çıkarın ve yağlanmış bir fiber optik sıcaklık probunu yavaşça rektumuna yerleştirin. Kateteri tümörün içine yerleştirin. İğneyi çıkarın.
Daha sonra kateteri tümörden çok fazla çıkmayacak şekilde kesin. Sensörleri koruyacak olan katetere üç sensörlü bir fiber optik sıcaklık probu yerleştirin. Rektal ve intratümöral probu hayvanın kuyruğuna bantlayın.
Fareyi, anestezinin bağlanabileceği ve verilebileceği başın yanında bir delik olması gereken 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Tüpü bobin kurulumunun içine yerleştirin ve anesteziyi yeniden bağlayın. Ortamın sıcaklığını ölçmek için tüpe gevşek bir şekilde bir fiber optik sıcaklık probu yerleştirin.
Ardından soğutucuyu açın ve soğutucunun sirküle edildiğinden emin olun. Bilgisayar yazılımının çeşitli sıcaklıkları gösterdiğini doğrulayın ve gerekli CEM43 dozunun daha önce belirlenmiş olması gereken bir CEM43 hesaplamasının gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine izin vermek için kayda başlayın. Mıknatısı düşük bir güç yüzdesinde açıntage ve fiber optik sıcaklık problarının sıcaklık değişikliklerini kaydettiğinden emin olun.
Kısacası, hayvanın çekirdek sıcaklığının 38 santigrat derecede kalması ve onu şartlandırılmış hava ceketi ile düzenlemesi. Tümördeki sıcaklık seviyesini kontrol eden gücü değiştirerek manyetik alanın gücünü ayarlayın. İstenilen doza ulaşıldığında AMF'yi kapatın.
Tüpü bobinden çıkarın ve fareyi tüpten çıkarın. Ardından, soğutucuyu kapatın. Probları ve kateterleri çıkarın ve gerekirse hayvanı yeni bir metal kulak küpesi ile etiketleyin.
Anesteziden iyileşme sırasında fareyi izleyin, normal davranışına devam ettiğinden ve herhangi bir komplikasyon olmadığından emin olun. In vivo hipotermi için, gerçek zamanlı etkinlik ve güvenlik değerlendirmesi için stratejik bölgelere mümkün olduğunca çok sayıda fiber optik sıcaklık probu yerleştirmek çok önemlidir. Bu problar, deney boyunca sıcaklığın kaydedilmesini mümkün kılarak doğru dozimetri ve termal geçmişe izin verir.
Bir in vivo deney sırasında oluşturulan eğriler burada gösterilmekte olup, sıcaklığı yakından izleme ve tümör sıcaklıklarını istenen aralıkta tutmak için sistemi ayarlama yeteneği vurgulanmaktadır. Volkan grafikleri, in vitro ve in vivo manyetik nanopartikül hipertermi tedavisini takiben diferansiyel eksprese edilen genleri göstererek, hipertermi etkilerini izlemek için moleküler tekniklerin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Tedavinin tutarlı bir şekilde uygulanması için tümör sıcaklıklarının, hayvanların çekirdek sıcaklığının ve termal dozun doğru bir şekilde izlenmesi gereklidir.
Hipertermiyi takiben, tedavinin etkisini ve mekanizmasını anlamak için farklı analizler yapılabilir. Ve daha büyük bir terapötik etki için diğer tedaviler uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, gelişmiş bir uygulama ve izleme sistemi kullanarak manyetik nanoparçacık hipertermi uygulamasının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi için gerekli teknikleri ve metodolojiyi sunmaktadır. Bu yöntem, preklinik modellerde manyetik nanoparçacık hipertermi tedavisi uygulamak için en sağlam ve tekrarlanabilir yolu sağladığı için önemlidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoteknoloji
- Termal terapi
Arka Plan
- Nanoparçacık hipertermisinin hassas ve tutarlı bir şekilde uygulanması.
- Yerel ortamın ve hayvan fizyolojisinin doğru şekilde izlenmesi ve kontrolü.
- Tekrarlanabilirlik ve güvenlik için termometrinin önemi.
- Preklinik modellerdeki uygulaması.
Çalışmanın Amacı
- Manyetik nanopartikül hipertermisini uygulamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Tedavide güvenliği ve tekrarlanabilirliği sağlamak.
- Isıtmayı hedef doku ile sınırlandırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Mililitrede üç miligram iyon konsantrasyonunda manyetik nanoparçacıkların hazırlanması.
- Nanoparçacıkların hücre kültürü kuyucuklarına eşit şekilde dağıtılması.
- Besiyeri ve nanoparçacıklardan oluşan bir stok çözeltinin kullanılması.
- Tedavi sırasında termal dozun izlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Manyetik nanoparçacık hiperterminin başarılı bir şekilde uygulanması.
- Hedef dokularla sınırlı, tutarlı ısıtma.
- Denemeler arasında sonuçların tekrarlanabilirliği.
- Yerel ortamın ve hayvan fizyolojisinin etkili bir şekilde izlenmesi.
Sonuçlar
- Protokol, nanopartikül hipertermi için sağlam bir yöntem sunmaktadır.
- Preklinik uygulamalarda güvenliği ve etkinliği sağlar.
- Tedavide termometrinin önemini vurgular.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Manyetik nanopartikül hipertermisi (mNPH), preklinik onkoloji modellerinde hassas termal dozlamaya olanak tanıyarak, kontrollü tümör ablasyonu ve subletal immünomodülatör etkiler aracılığıyla hedef doğrulamasını destekler. Sistemin gerçek zamanlı, çok noktalı sıcaklık izleme özelliği ve CEM43 tabanlı dozimetrisi, mekanistik risk azaltma ve terapötik pencerelerde öngörücü güvenilirlik için kritik olan kantitatif, tekrarlanabilir çıktılar sağlar. Bu yetenek, in vitro bulguları in vivo etkinlikle ilişkilendirerek erken keşif süreçlerindeki devam/dur kararlarına veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tümör mikroçevresini ve bağışıklık yanıtlarını modüle etmek için tanımlanmış termal dozlar uygulayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Fiber optik termometri aracılığıyla ısıtmayı hedef dokuyla sınırlandırarak hedef dışı etkileri azaltır ve assay özgüllüğünü artırır.
- Öngörücü Değer: Sıcaklık-zaman gradyanları boyunca biyolojik etkileri nicelleştirerek hedef önceliklendirme için doz-yanıt modellemesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tutarlı hipertermi yanıtı için standardize nanopartikül alımına sahip valide edilmiş biyolojik sistemler (örneğin, B16 F10 melanoma hücreleri) hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kuyucuklar ve plakalar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için stok çözeltiler ve homojen dağılım protokolleri kullanır.
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli tarama ve alt analizlerle uyumlu hacimsel termal doz verileri (CEM43) üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Özdeş nanopartikül formülasyonları ve izleme yöntemleri kullanarak, in vitro hücre kültüründen in vivo tümör modellerine sorunsuz geçişi destekler.
- Hastalık Uygunluğu: Fare melanoma modellerine uygulanabilir; böylece hipertermi kaynaklı gen ekspresyon değişikliklerinin (örneğin, volkan grafikleri) potansiyel biyobelirteçler olarak değerlendirilmesine olanak tanır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Gerçek zamanlı termal doz takibi, kombinasyon tedavisi çalışmaları öncesinde güvenlik kontrollü doz artırımı ve mekanizmaya dayalı risk azaltma imkanı sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
mNPH'yi, termal doz hassasiyetinin fenotipik tarama ve etki mekanizması çalışmalarını yönlendirdiği, hedef doğrulaması ile öncü bileşik optimizasyonu arasında kolaylaştırıcı bir teknoloji olarak konumlandırır.
- Keşif Biyolojisi: Termal stresi diferansiyel gen ekspresyonu ve immün modülasyonla ilişkilendirerek yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Nanopartikül formülasyonlarını ve saha parametrelerini karşılaştırmak için kantitatif, tekrarlanabilir termal çıktılar (örneğin, CEM43) sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizi için gerçek zamanlı sıcaklık eğrileri ve tedavi sonrası moleküler profiller (örneğin, volcano plot'lar) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hücrelerden hayvanlara kadar nanopartikül dozlaması ve izlemede tutarlılığı koruyarak preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sistem tasarımı; ex vivo, in vitro ve in vivo düzenekler arasında hızlı dönüşüme izin vererek platformun projeler genelindeki kullanımını maksimize eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hassas termal dozları moleküler sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Farklı merkezlerde kalibre edilmiş solenoid bobinler, soğutucular ve fiber optik problar aracılığıyla hipertermi uygulamasını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Etkinlik ve doku güvenliği arasında denge kuran etkili termal pencereleri tanımlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Tekrarlanabilir termal ablasyon profillerine dayanarak nanoterapötik adaylarının risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Nanopartikül hazırlama, termal dozimetre ve in vivo prosedürler için hayvan kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- 10 kW jeneratörler, 14 sarımlı solenoid bobinler, soğutucular ve çok noktalı fiber optik sıcaklık izleme sistemleri dahil olmak üzere özel enstrümantasyon gereklidir.
- Nanopartikül konsantrasyonu (3 mg iyon/mL), dağıtım protokolleri ve CEM43 hesaplama yöntemlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı tümör modelleri, nanopartikül yapıları ve alan parametreleri (165 kHz, 23.87 kA/m) için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Hedef dışı ısınmayı önlemek ve hayvan vücut çekirdek sıcaklığı regülasyonunu sağlamak için kapsamlı termometri ihtiyacı gibi pratik sınırlamaları içerir.
