Name: Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin P. falciparum gametosit kültürü ve yapay membran besleme yöntemiyle sivrisinek enfeksiyonu protokolünü. Bu yöntem sıtma bulaş biyolojisi ve sporozoit üretimi çalışmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne (JHMRI) finansal destek için Bloomberg Hayırseverlerine teşekkür ediyor. JHMRI böcek ve parazitoloji çekirdek tesisleri tarafından sağlanan uzmanlık olmasaydı bu çalışma mümkün olmazdı.

Aşağıda açıklanan kan almalar Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. P. falciparum, biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) tesisinde steril koşullar altında taze RBC'lerde kültürlenir ve biyolojik malzemelerin işlenmesinde dikkatli olunması gerekir. Kan veya kan ürünlerini içeren her adımdan sonra, her plastik veya cam eşya, uygun imhadan önce kaputun içinde% 10 çamaşır suyu ile durulanır.
1. Reaktifler ve hazırlık
<ol><li>Parazit izole P. falciparum NF54 (bkz. Malzeme Tablosu)kullanıldı, bu da sürekli kültürdeyken iki aya kadar enfeksiyöz gametosit üretebilir. NOT: Kültüre uyarlanmış tüm parazit çizgileri gametosit üretmez ve düşük geçişli NF54 izolatları en tutarlı olanıdır.</li>
	<li>O+ Eritrositler: Eşit hacimde RPMI 1640 ortam ve santrifüj ekleyerek tüm kanı 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, deaklerasyon 0 olarak ayarlanmış bir rotorda seyreltin. Süpernatant ve buffy paltoyu (plazma ve paketlenmiş eritrositler arasında beyaz bir bant, beyaz kan hücrelerinin ve trombositlerin çoğunu içeren) dikkatlice çıkarın ve eşit hacimde RPMI ekleyin. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra 4 °C'de depolama için% 50 hematokrit elde etmek için bir pelet hacmi RPMI ekleyin. NOT: Gametositler iki haftalık bir süre içinde olgunlaşır, bu da kültürlere taze eritrositlerle başlamayı kritik hale getirir, genellikle bir hafta içinde çizilen eritrositler iyi çalışır.</li>
	<li>O+ İnsan Serumu: Farklı bireylerden serumdaki normal varyasyonun etkisini en aza indirmek için en az 6 ünite serumu bir araya getir. Havuzalanmış insan serumunu 0,2 μm filtrasyon şişeleri kullanarak sterilize edin. aliquot 50 mL veya daha az porsiyonlarda ihtİyada göre ve -20 °C'de saklayın. NOT: Eritrosit ve serumun P. falciparum kültürleri için uyumlu bir kan grubuna ait olması gerekir.</li>
	<li>500x Hipoksantin (100 mL) çözeltisi: 1 M NaOH'un 100 mL'sinde 0,5 g hipoksantin çözün. Filtre sterilize edin ve depolama için 5-10 mL aliquots yapın. Stoklar -20 °C'de bir yıla kadar ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Sodyum bikarbonat (İsteğe bağlı): 7,5 g sodyum bikarbonat'ı 100 mL deiyonize, doku kültürü sınıfı suda çözün ve 0,2 μm filtre ile sterilize edin. NOT: Bu protokol, P. falciparum in vitro kültürü için mikroaerofilik koşullar sağlamak için mum kavanozu yöntemini kullanır ve sodyum bikarbonat gerektirmez. Bununla birlikte, parazitler bir sıtma gazı karışımı (%5 O 2 ,%5CO2 ve% 90 N2)kullanılarak kültürlenirse, kültür medyasını% 0,2 sodyum bikarbonat ile takviye etmek önemlidir.</li>
	<li>Tam medya: 500 mL tam ortam hazırlamak için 500 mL RPMI 1640'a 1 mL hipoksantin çözeltisi ve 50 mL havuzlu insan serumu ekleyin. Sıtma gazı karışımı kullanıyorsanız% 7,5 sodyum bikarbonat 15 mL ekleyin. Tam ortamı 4 °C'de saklayın ve tam ortamın rengi turuncudan pembeye değişirse atın. İsrafı önlemek için, üç gün içinde kullanılacak kadar eksiksiz ortam yapın.</li>
	<li>Eksflagellasyon ortamı (İsteğe bağlı): 200 mg NaHCO 3 ,5mg Hipoksantin ve 100 μL ksanurenik asit (sudaki 100 mM stoktan) 100 mL eksik ortama (glutamin ve HEPES ile RPMI 1640) eriterek eksflagellasyon veya ookinete ortam yapın. NOT: Eksflagellation, gametositlerle enfekte olmuş kan unu aldıktan birkaç dakika sonra dişi Anopheles sivrisineklerinin ortagutu içinde erkek gamet oluşumu işlemidir. Plasmodium'un erkek gametositleri, bir eksflagellation olayından sonra 8 erkek gametes'e yol açtı. İn vitro, bu işlem kültür sıcaklığı oda sıcaklığına (RT) düşürildiğinde kendiliğinden gerçekleşir ve kültürlü olgun gametositlerde gözlenebilir.</li>
	<li>N-Asetilglukozamin (İsteğe bağlı): Su veya eksik ortamda 500 mM stok N-asetilglukozamin çözeltisi yapın, aliquot ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>NaCl çözümleri: 0.9 g, 1.6 g ve 12 g NaCl'yi 100 mL doku kültürü sınıfı deiyonize suda çözünerek %0.9, %1.6 ve NaCl çözümleri yapın. Filtre 0,22 μm filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. P. falciparum aseksüel sahne kültürü
<ol><li>Parazit kültürüne başlamak için, sıvı azot tankından P. falciparum NF54'ün düşük geçişli donmuş şişesini çıkarın ve 37 ° C'de ayarlanan su banyosunda hızla çözün.</li>
	<li>İçeriği (~1 mL) 50 mL steril santrifüj tüpüne aktarın ve damla yönünde 0,2 hacim önceden ısınmış% 12 NaCl eklerken, eşit karıştırmayı sağlamak için tüpü hafifçe sallayın. Aralıklı hafif titreme ile RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Nazik karıştırmaya devam ederken 9 adet %1,6'lık NaCl damla yönünde ekleyin. İçeriği RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin, süpernatantı dikkatlice atın. Parazit peletini sürekli olarak karıştırdığından emin olurken, 9 cilt% 0.9 NaCl damla yönünde ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüj.</li>
	<li>İçeriği 6 kuyu doku kültürü plakasının bir kuyusuna aktarın ve 100-200 μL paketlenmiş RBC ekleyin.</li>
	<li>Parazit kültürünü 37 °C'de bir mum kavanozunda veya %5 O2,</li><li><li><li><li><li></ol><ol><li><li></li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li><li></li><li> </li><li><li> </li></ol><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li> </li><li><li> </li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li></li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ01v3.jpg"><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ02v3.jpg"><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ03.jpg">

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Malaria+Report%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">World Malaria Report.</a> World Health Organization. , (2018).</li>
<li>Sinden, R. E., Smalley, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametocytogenesis+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro%3A+The+cell-cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle.</a> Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).</li>
<li>Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+Development+of+Malarial+Parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Sexual Development of Malarial Parasites.</a> Advances in Parasitology. 22, 153-216 (1983).</li>
<li>Joice, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+transmission+stages+accumulate+in+the+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 6 (244), 5(2014).</li>
<li>Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+Plasmodium+falciparum+gametocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow.</a> American Journal of Hematology. 85 (12), 943(2010).</li>
<li>Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoite+invasion+of+the+mosquito+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).</li>
<li>Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+malaria+parasites+in+the+mosquito+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The development of malaria parasites in the mosquito midgut.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).</li>
<li>Trager, W., Jenson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+malarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cultivation of malarial parasites.</a> Nature. 273 (5664), 621-622 (1978).</li>
<li>Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery.</a> Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).</li>
<li>Delves, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+in+vitro+culture+of+P.+Falciparum+gametocytes+to+evaluate+novel+transmission-blocking+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).</li>
<li>Habtewold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+SMFA+and+mosquito+dark-feeding+regime+significantly+improve+malaria+transmission-blocking+assay+robustness+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity.</a> Malaria Journal. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>Demanga, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+sexual+stage+malaria+gametocytes+in+a+Wave+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor.</a> Parasites and Vectors. 10 (1), 216(2017).</li>
<li>Brockelman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+favoring+gametocytogenesis+in+the+continuous+culture+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).</li>
<li>Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeibalan%2C+E+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22">Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine</a>. 7, (2017).</li>
<li>Essuman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gametocyte+biomarker+for+superior+molecular+detection+of+the+plasmodium+falciparum+infectious+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs.</a> Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).</li>
<li>Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+of+plasmodium+is+anopheles+species+specific+and+infection+intensity+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent.</a> mBio. 8 (5), 01631(2017).</li>
<li>Oakley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+based+detection+of+Plasmodium+falciparum+development+in+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8, 11568(2018).</li>
<li>Saraiva, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromobacterium+spp.+mediate+their+anti-Plasmodium+activity+through+secretion+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin.</a> Scientific Reports. 8, 6176(2018).</li>
<li>Tao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-partitioning+of+the+Plasmodium+falciparum+stage+V+gametocyte+proteome+provides+insight+into+falciparum-specific+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).</li>
<li>Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+enhanced+chemiluminescent-ELISA+for+the+detection+of+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+antigen+in+midguts+of+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).</li>
<li>Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+iron+chelator+FBS0701+blocks+transmission+by+Plasmodium+falciparum+gametocyte+activation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).</li>
<li>Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametocytocidal+screen+identifies+novel+chemical+classes+with+Plasmodium+falciparum+transmission+blocking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity.</a> PLoS One. 9 (8), 105817(2014).</li>
<li>Lindner, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+proteomics+reveal+two+waves+of+translational+repression+during+the+maturation+of+malaria+parasite+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites.</a> Nature Communications. 10, 4964(2019).</li>
<li>McLean, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmission-Competent+Human+Malaria+Parasites+with+Chromosomally-Integrated+Fluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters.</a> Scientific Reports. 9, 13131(2019).</li>
<li>Espinosa, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Cleavage+of+the+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+Is+a+Target+of+Protective+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).</li>
<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
<li>Ifediba, T., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vitro+maturation+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes.</a> Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+of+standard+membrane-feeding+assays+for+evaluation+of+malaria+transmission-blocking+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines.</a> Malaria Journal. 15, 463(2016).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntemler Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'nde 10 yıldan fazla bir süredir başarıyla kullanılmaktadır15,16,17,18,19,20,21,22. Bu protokol kullanılarak üretilen gametositler, yüksek verimli gametositocidal tahliller2...

Sıtma Plazmodium parazitlerinden kaynaklanır ve omurgalı konaklarına dişi Anopheles sivrisineklerinin bulaşıcı ısırması yoluyla bulaşır. Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) 2019 raporuna göre, toplam 228 milyon sıtma vakasından tahmini 405.000 ölümoldu 1. Sıtmaya bağlı ölümlerin çoğu, özellikle beş yaşın altındaki çocuklar arasında Afrika bölgesinde yoğunlaşmıştır. Sıtmanın genel görülme oranı 2010 yılından itibaren küresel olarak azalırken, son yıllarda düşüş platolanmıştır ve hastalığı ortadan kaldırmak için acilen ek kontrol stratejilerine ihtiyaç vardır.
Sıtma parazitlerinin döngüsel aseksüel kan evreleri hastalık patogenezine neden olur ve bunların küçük bir alt kümesi kadın ve erkek gametositlerine ayrılır. Plazmodium falciparum gametositler, morfolojik olarak farklı beş aşamadan geçerek 7-10 gün sürdükleri için doğada benzersizdir. Aşama I'den IV'e olgunlaşmamış gametositler kemik iliği parankiminde inzdidadır ve büyük ölçüde periferik dolaşımda yoktur2,3,4,5. Olgun evre V gametositlerle enfekte olmuş eritrositler kan dolaşımında serbest bırakılır ve sivrisinekler tarafından alınmak üzere serbestçe dolaşır. Sivrisinek midgut içine girdikten sonra, gametositler, sıcaklıktaki bir değişiklik ve midgut ortamına maruz kalma yoluyla aktive edilir, dişi ve erkek gametlere dönüşür ve sivrisinek tükürük bezlerindeki sporozoitlerin enfektif aşamaları ile sonuçlanan sivrisinek aşamalarının geliştirilmesine başlar6,7.
Trager ve Jenson8 P. falciparumkültürü için standartlaştırılmış bir yöntem tanımladığından, aseksüel kan aşamaları üzerine çalışmalar büyük ölçüde ilerlemiştir. Bununla birlikte, cinsel aşamalar için güvenilir bir kültür sisteminin olmaması, P. falciparum gametositlerini, iletim biyolojisini ve sivrisinek aşamalarını incelemeyi zorlaştırmıştır. Son yıllarda, gametosit kültürlerinin kurulmasında laboratuvarlara yardımcı olan çeşitli yöntemler yayınlanmıştır9,10,11,12. Bu makale, sıtma araştırma topluluğu için değerli bir kaynağı temsil edebilecek P. falciparum gametositleri kültürü için standartlaştırılmış ve güvenilir protokolü açıklar. Bu yöntem, standartlaştırılmış bir sivrisinek besleme protokolü ile birlikte son derece güvenilir sivrisinek enfeksiyözitesi ile sonuçlanan olgun ve bulaşıcı gametositlerin sağlam üretimini sağlar. Bu yöntemler, gametositlerin ve sivrisinek evresi parazitlerinin kesintisiz tedarikini sağlamak için kurulmuştur. Bu yazıda, kapsamlı bir gametosit kültür protokolü (Şekil 1), cam membran besleyicilerin hazırlanması ve bu membran besleyiciler kullanılarak sivrisineklerin enfeksiyonu (Şekil 2), midgut diseksiyonu (Şekil 3) ve sivrisineklerin tükürük bezi (Şekil 4) ve midgut ve tükürük bezi diseksiyonu sonrası sivrisinekte enfeksiyonun nicelleştirilmesi.

<table><tbody><tr><td>% 10 Şeker çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1 ml serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5ml serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" cam pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anofel Sivrisinekleri</td><td>JHMRI, Böcek çekirdeği</td><td></td><td>A. stephensi veya A. gambiae (keele)</td></tr> <tr><td>kullanıyoruz hücre sayacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ince uçlu forseps</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa leke</td><td>Sigma</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>Cam kurutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam membran besleyici</td><td>Chemglass Yaşam Bilimleri</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kanı O +</td> <td>JHU</td><td></td><td>RBC'leri RPMI ile üç kez yıkayın ve% 50 hematokrit</td></tr><tr><td>İnsan Serumu O +</td> <td>Eyaletler arası kan bankası</td><td></td><td>Farklı donörlerden en az 6 ünite serum toplayın ve alikotları -20 ° C'de dondurun derece;C.</td></tr><tr><td>Hipoksantin</td><td>Sigma</td><td>H9337</td> 1M NaOH Mercurochrome Sigma M7011'de <td>500x stok yapın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS'de gerektiğinde %0,1'e kadar seyreltilebilen %1 stok çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td>Mikro</td> Pipet <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td>10x, 40x ve 100x objektifli herhangi bir mikroskop işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Sivrisinek kapları</td><td>Neptün kapları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-asetilglukozamin</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>İsteğe bağlıdır ve yalnızca saf gametositler gerektiğinde gereklidir.</td></tr><tr><td>Ağ Sivrisinekleri</td><td></td><td></td><td>içerebildiğinden ve kan beslemesine izin verebildiğinden emin olun</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum NF54</td><td>BEI Kaynakları</td><td>MRA-1000</td><td>Sabit bir kaynağınız olduğundan emin olmak için çok sayıda erken geçiş kültürünü dondurun</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>Ortam glutamin ve HEPES içerir</td></tr><tr><td>Slayt ısıtıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Ortam için isteğe bağlı, yalnızca kültür inkübasyonu su banyosu sırasında sıtma gazı karışımı kullanırken ekleyin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamçılama ortamı için</td> <td>Ksantürenik Asit</td><td>Sigma</td><td>D120804</td></tr></tbody></table>

plazmodium falciparum yapay membran besleme yoluyla gametosit kültürü ve sivrisinek enfeksiyonu

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Sıtma, önemli morbidite ve mortaliteye neden olan en önemli halk sağlığı sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. Sıtma, dişi Anopheles sivrisineklerinden bulaşıcı bir ısırık yoluyla bulaşan sivrisinek kaynaklı bir hastalıktır. Sıtma kontrolü sonunda sivrisineklere, sivrisineklere ve sivrisineklerden bulaşmayı engellemenin yollarını içeren çok sayıda yaklaşıma dayanacaktır. Laboratuvarda sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamalarını incelemek için, insan konakçıdan sivrisinek vektörüne bulaşmak için gerekli bir parazit aşaması olan son derece bulaşıcı Plasmodium falciparum gametositlerini kültüre etmek için bir protokol optimize ettik. P. falciparum gametositleri yaklaşık 1-2 hafta süren morfolojik olarak farklı beş adımla olgunlaşır. Bu protokolde açıklanan gametosit kültürü 15 günde tamamlanır ve 15-18. günlerden itibaren sivrisineklere bulaşıcıdır. Bu protokoller, sürekli bir enfeksiyon yetkin gametosit döngüsünü sürdürmek ve parazitin sivrisinek aşamalarının kesintisiz tedarikini sağlamak için geliştirilmiştir. Burada, gametosit kültürünün metodolojisini ve cam membran besleyiciler kullanarak sivrisineklerin bu parazitlerle nasıl enfekte olduğunu açıklıyoruz.

Burada, yukarıdaki protokol kullanılarak oluşturulan P. falciparum NF54 gametocyte kültürleri kullanılarak bir dizi membran beslemesinden elde edilen sonuçları sunuyoruz (bkz. Gametosit kültürü, 0. günde yaklaşık %0.5 karışık evre aseksüel kültürle başlatıldı ve bu kültür 4. Bu yüksek parazitmide Şekil 5A'da gösterildiği gibi, parazitler strese girer ve aseksüel sahne kültürü çökür. Bununla birlikte, bu stres birlikte gametositogenez indüksiyonu ile son...

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Gametositler sıtma parazitinin bulaşmasından sorumludur. Laboratuvarda enfeksiyöz gametositlerin üretilmesi, sivrisinek aşamalarında bulaşma biyolojisini incelemenin ve daha sonraki aşama sonuçları için sporozoitlerin üretilmesinin anahtarıdır. Bu yöntemler herhangi bir laboratuvarın benimsemesi için basittir ve görsel gösterim, bu prosedürlerin dünya çapındaki sıtma topluluğuyla paylaşılmasına yardımcı olacaktır.Her ikisi de Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'nden meslektaşlarım, kıdemli araştırma ortağımız Godfree Mlambo ve doktora sonrası araştırmacımız Sachie Kanatani benimle birlikte prosedürü gösterecek. Bir gametosit kültürü kurmak için, bir santrifüjde beş mililitre besleyici kültürü döndürün ve peleti 30 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. 1.2 mililitre paketlenmiş kırmızı kan hücresini tüp içeriği ile karıştırın ve elde edilen süspansiyonun beş mililitresini altı oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna ekleyin.Ardından plakayı 37 santigrat derecede bir mum kavanozuna yerleştirin. Önümüzdeki 15 ila 18 gün boyunca her gün, her bir oyuktan kültür süpernatanının% 70 ila 80'ini dikkatlice aspire edin ve yerleşmiş kırmızı kan hücresi tabakasını bozmadan kültü

plasmodium-falciparum-gametocyte-culture-mosquito-infection-through

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Dang virüsü için potansiyel refrakter olarak bir gen tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde viral enfeksiyonların önlenmesinde rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, dang sivrisinek enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı virüs büyüyor ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Öğrenin P. falciparum gametosit kültürü ve yapay membran besleme yöntemiyle sivrisinek enfeksiyonu protokolünü. Bu yöntem sıtma bulaş biyolojisi ve sporozoit üretimi çalışmalarında kullanılır.

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Daha fazla video keşfet