Name: Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Keşfedin: qRT-PCR ile sığır beyin yapılarında kuduz virüsü N geni nicelendirmesi. Bu yöntem, düşük viral yükleri tespit ederek hayvan sağlığı araştırmalarına ve epidemiyolojik çalışmalara katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Tarım, Ormancılık ve Hayvancılık Araştırmaları Enstitüsü (INIFAP) tarafından desteklendi. Jerzayn Fraustro Esquivel'e bu belgeyle ilişkili videonun geliştirilmesindeki işbirliği için teşekkür ederiz.

Bu çalışma Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan hayvanların kullanımına yönelik tavsiyeler doğrultusunda onaylanmış ve yürütülmüştür.
1. Örnekler
<ol><li>RT-PCR analizi için beynin 6 farklı kuduz pozitif sığır beyninden parçalanmış farklı bölgelerini kullanın.</li>
</ol>2. Kuduzu doğrulamak için doğrudan floresan antikorlar (DFAs)
NOT: Kuduz antijeninin DFA tarafından tespit edilmesi, floresan etiketli antikorlar kullanılarak kuduz nükleoproteinin varlığını belirlemek için nitel bir yöntemdir. Test, aşağıda açıklandığı gibi Dean ve ark. (1966)20tarafından sağlanan protokol kullanılarak gerçekleştirildi.
<ol><li>Yaklaşık 15 mm çapında steril bir slayt üzerinde farklı beyin yapılarından parçalanmış her dokudan iki izlenim bırakın. Dokunun yaklaşık 3mm 3 kısmını steril kaydırağa sürmek için ahşap bir aplikatör kullanın. Lekeyi oluşturmak için, ahşap aplikatörü slayta hafifçe bastırın.</li>
	<li>Slaytları -20 °C'de 1 saat boyunca %100 aseton olarak batırarak örnek leke slaytlarını sabitleyin. Kuluçkadan sonra, slaytları 21 °C'de kuru bir bez üzerinde 30 dakika kurutun.</li>
	<li>Bir şırıngamdan dağıtarak her beyin smear'ına 1:10 seyreltmede floresan etiketli anti-nükleoprotein antikorunun 50 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Slaytları konjuge ile 37 °C'de nemli bir odada 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, fazla konjugeyi ortadan kaldırmak için slaytları iki kez suyla ve PBS ile yıkayın. Slaytların 21 °C'de kurumasını bekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için dikkatlice lekelenin ve montajdan önce kısa bir süre hava kurutun.</li>
	<li>Bölümün yüzeyini örtmek için% 50 fosfat gliserin damlası ekleyin ve ardından bir kapakla örtün. Epifluoresans mikroskobu altındaki bölümleri 40x büyütmede gözlemleyin.<ol>
<li>Pozitif ve negatif kontrolleri (pozitif kontrol: RABV ile aşılanmış fare beyinleri; negatif kontroller: RABV negatif sığır beyinleri) örneklerle aynı şekilde işleyin ve gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RT-PCR için pozitif kontrol oluşturma
<ol><li>Mikroplazm bankasından BHK-21 hücreleri alın. RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) suşunu 2.</li>
	<li>BHK-21hücrelerini, CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de %10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortam (MEM) içeren şişelerde muhafaza edin ve yayın ve nemli koşullar altında. Hücreleri% 80 birışıklığa ve daha sonra alt kültüre ulaşana kadar25 cm 2 kültür şişelerinde büyütün.</li>
	<li>Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve şişeyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. RABV strain ERA'nın 105 TCID/mL'si ile kültürü aşıla. Co 2 (%5) varlığında 37 °C'de sürekli sallanarak viral inokülüsleri2 saat kuluçkaya yatırın ve nemli koşullar altında.</li>
	<li>Enfeksiyon ortamını çıkarın ve% 5 (serum fetal sığır) SFB ile desteklenmiş MEM ekleyin. CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de72 saat kuluçkaya yatır nemli koşullarda.</li>
	<li>Hücreler sitopatik etkiler sergilediğinde aşılamadan 3 gün sonra RABV hasat edin. Enfekte hücreleri dondurun ve hücreleri izne çıkarmak için 4 °C'de çözün. Ortamı şişeden toplayın ve ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.050 x g'da santrifüjleme için bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>RABV'den gelen süpernatantları -80 °C'de saklayın ve -70 °C'de depolama için çalışan aliquots hazırlayın.</li>
	<li>İntraserebrally, önceki adımda elde edilen virüsü 21 günlük dişi CD1 farelerine aşılar. 106 MICLD 50 (fare enfeksiyöz kültürü ölümcül doz% 50) içeren50 μL çözeltiyi aşılamak için 1 mL şırınna kullanın farelere dozlar22.</li>
</ol>4. RNA ekstraksiyonu
NOT: Toplam RNA, aşağıdaki protokole göre organik ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrudan sığır beyinlerinden çıkarılmıştır.
<ol><li>Guanidium izotiyosiyanat içeren piyasada bulunan bir reaktif kullanarak toplam RNA çıkarmak için her anatomik yapıdan 100 mg beyin dokusu kullanın.</li>
	<li>Maksimum hızda 15 s için mikrotüp içinde küçük bir pestil ile bir Dounce homojenizat kullanarak girdap kullanarak guanidium izotiyosiyanat reaktifinin 1 mL'sinde her yapıdan toplam 100 mg dokuyu manuel olarak homojenize edin.</li>
	<li>Numuneleri 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve ardından 200 μL kloroform ekleyin. Numuneleri 15 sn boyunca kuvvetlice karıştırın, 2 ila 3 dakika buzda kuluçkaya yatırın ve ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlayın.</li>
	<li>Sulu fazı temiz bir tüpe aktarın ve 500 μL izopropil alkol ekleyin. Numuneleri 21 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin. Sulu süpernatantı pipetleme ile epire edin. İzole RNA tüpte bir pelet olarak mevcut olacaktır.</li>
	<li>Daha sonra, RNA peletini pipetleme ile% 75 etanol 1 mL ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı kurutun ve RNA peletini oda sıcaklığında (21 °C) havayla kurutun. Daha sonra, peletin 50 μL çekirdeksiz suda seyreltin.</li>
	<li>Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ve kalitesini 260 nm olarak belirleyin. Kullanıma kadar RNA'yı -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>DNA'yı DNase I ile sindirerek RNA örneklerinden çıkarın. Ardından, 5 μL 10x reaksiyon tamponu ekleyin ve ardından 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. Karışıma 1 μL EDTA ekleyerek DNase I'i devre dışı bırak ve ardından 65 °C'de 10 dakika kuluçka.</li>
</ol>5. cDNA sentezi ve PCR
<ol><li>Oligo dT ve ters transkriptaz kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezlemek. Her 1 μg RNA için 1 μL oligo DT (500 μg/mL), 1 μL 10 mM dNTP karışımı ve 12 μL'lik son hacme çekirdeksiz damıtılmış su ekleyin. Karışımı 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Reaksiyon karışımını 4 °C'ye soğutun. Tüpü 1.050 x g'da30 sn sn santrifüjleyin ve ardından 4 μL reaksiyon tamponu, 2 μL 0,1 M DTT ve 1 μL ribononik önleyici (40 U/μL) ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 1 μL ters transkriptaz (200 U) ekleyin. Daha sonra, reaksiyon karışımını 37 ° C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından reaksiyonun 70 ° C'de 15 dakika boyunca inaktive edin.</li>
	<li>Kullanmadan önce cDNA'yı -20 °C'de saklayın. NOT: Sentezlenen cDNA'nın kalitesini doğrulamak için, sentez in vitrosunu gerçekleştirmeden önce RABV N geninin 761 bp'lik bir parçasının amplifikasyonunun gerçekleştirilmesi gerçekleştirilir. Aşağıdaki 5.5. adımda açıklandığı gibi Loza-Rubio ve ark.11 tarafından açıklanan protokolü kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar altında Taq DNA polimeraz kullanarak PCR gerçekleştirin. Reaksiyon kurulumini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 20 mM MgCl 2,0,2mM dNTP içeren 10x Taq tamponu, 1 U Taq polimeraz, her astarın 10 μM'si (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ ve SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2.5 μL cDNA ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme.</li>
	<li>Aşağıdaki bisiklet koşullarını kullanarak bir termosikleyicide amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 95 ° C; 30 s için 95 ° C 35 döngü, 30 s için 60 ° C ve 1 dakika için 72 ° C; 7 dakika boyunca 72 °C'lik bir döngü.</li>
	<li>% 1 agarose jel kullanarak 761 bp PCR ürünlerinin varlığını değerlendirin.</li>
</ol>6. Tüp bebek transkripsiyon
NOT: In vitro transkripsiyon hedef genin mRNA'ını oluşturur. Tam RABV N genini yükselten ve qRT-PCR tahlili için pozitif kontrol olarak kullanılan bir astar çifti kullanın. Bu astarlar, tam RABV N genini güçlendirmek ve T7 polimerazını (TAATACGACTCACTATAG) tanıyan bir promotör eklemek için tasarlanmıştır.
<ol><li>Tüm N geni RABV'yi güçlendirmek için Trans-Nrab ileri (5ʹ gatgagtcactcgaatatattcttctt 3ʹ) ve ters (5ʹ caataatacgactcactataggatgccgacaagatt 3ʹ) ve yüksek kaliteli bir PCR kiti kullanın.<ol>
<li>Her reaksiyon için, temiz bir PCR tüp reaksiyon tamponu 10x ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, her astarın 10 μM'si, 0,5 U yüksek kaliteli polimeraz, 1,5 μL cDNA (adım 5'te hazırlanmış) ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme kadar.</li>
		<li>Amplifikasyon için aşağıdaki koşullara ayarlanmış bir termosikler kullanın: 1 dakika boyunca 94 °C; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 40 °C ve 2 dakika için 72 °C döngü; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 60 °C ve 2 dakika için 72 °C 35 döngü; 2 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR ürününü in vitro sentez için bir şablon olarak kullanmak ve enzimatik reaksiyonun bileşenlerini adım 6.1.2'den çıkarmak için, PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre sütun tabanlı bir yoğunlaştırıcı kiti kullanarak arındırın ve ardından bir spektrofotometre kullanarak ölçün.</li>
	<li>RNA sentezi için, aşağıdaki reaksiyon karışımına sahip bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın: 5 μL T7 Transkripsiyon 5x tampon, her trifosfat nükleotitten 1,9 μL, 10 μg saflaştırılmış RABV N DNA VP2 DNA ve enzim karışımının 2,5 μL'si. Daha sonra, karışımı 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyon karışımına 1 μL 1 U/μg RNase Içermeyen DNaz ekleyin ve DNA kirlenmesini ortadan kaldırmak için 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüp bebek transkriptif RNA'sını saflaştırın ve fenol:kloroform:izoamil alkol kullanarak konsantre edin (25:24:1).</li>
	<li>Saflaştırılmış RNA peletini 70 μL TE arabelleğine yeniden depolayın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>PCR protokolünü adım 6.1'den yaklaşık 5 μg PCR ürünü elde edilene kadar tekrarlayın. Saflaştırma ve konsantrasyondan sonra, in vitro transkript N gen mRNA 4.711 μg / μL konsantrasyonda mevcut olacaktır.</li>
	<li>In vitro transkriptörlü mRNA'nın bu protokolün 5.</li>
</ol>7. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)
<ol><li>qRT-PCR için, üreticinin talimatlarına göre hibridizasyon probları kullanan ticari bir tek adımlı qRT-PCR kiti ile birlikte pozitif bir kontrol olarak tam N genini kodlayan bir in vitro mRNA transkript kullanın. RABV geni N'nin korunmuş bir bölgesini tespit etmek için Carneiro ve ark.(2010) 23 tarafından açıklanan prob ve astarları kullanın (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, ve BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Aşağıdaki termal bisiklet koşullarını kullanın: 10 dakika için 50 °C 1 döngü ve 2 dakika için 95 °C; 15 s için 95 °C 40 döngü ve 30 sn için 50 °C.</li>
</ol>8. Kalibrasyon eğrisi veya standart eğri
<ol><li>Altı dektil seyreltme elde edilene kadar 1 μg/μL mRNA'yı tüplere seri olarak pipetleme yaparak in vitro transcribed mRNA'nın seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Tüpleri standart eğriyi oluştururken kullanılmak üzere üç taraflı olarak 100 μL hacimde hazırlayın. QRT-PCR'ı 7.</li>
	<li>QRT-PCR'yi, çeşitli beyin örneklerini standart eğriyi oluşturmak için çalışan reaksiyonlarla aynı anda işleyerek ve hücre kültüründen izole edilmiş pozitif kontroller, negatif kontroller ve süpernatantlar kullanarak bir rotorlu termosikler halinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Testin algılama, test etkinliği ve duyarlılığı sınırını değerlendirmek için, aynı koşullar altında üç taraflı olarak standart bir eğri kullanın.</li>
</ol>9. biyolojik örneklerin qRT-PCR'si
<ol><li>RABV gen N'nin tespiti için, 7.</li>
	<li>Sığır beyin örneklerinde bulunan RABV genomunun kopya sayısını belirlemek için, standart eğri ve biyolojik örneklerden ve kalibrasyon eğrisi denkleminden enterpolasyonlu olanlardan Ct verileri elde edin.</li>
</ol>

<ol><li>Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+human+rabies%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorld+Journal%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances.</a> ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).</li>
<li>CDC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html">https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html</a> (2019).</li>
<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).</li>
<li>Prabhu, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+comparative+evaluation+of+fluorescent+antibody%2C+immunohistochemistry%2C+and+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+tests+for+the+detection+of+rabies+virus+antigen+or+nucleic+acid+in+brain+samples+of+animals+suspected+of+rabies+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India.</a> Veterinary Science. 5 (1), 24(2018).</li>
<li>Woldehiwet, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+advances+in+the+detection+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).</li>
<li>Singh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+-+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+public+health+concerns+and+advances+in+diagnosis+and+control%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review.</a> Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).</li>
<li>David, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+RT-PCR+method+in+ante-mortem+%26+post-mortem+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis.</a> Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).</li>
<li>Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+for+the+diagnosis+of+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies.</a> Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).</li>
<li>Wacharapluesadee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+detection+of+rabies+RNA+by+NASBA%2C+real-time+PCR+and+conventional+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR.</a> Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).</li>
<li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+ante+mortem+and+post-mortem+diagnosis+of+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li>
<li>Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+strains+of+rabies+virus+RNA+using+primers+designed+to+target+Mexican+vampire+bat+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants.</a> Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).</li>
<li>Dedkov, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+RT-qPCR+assay+for+fast+and+sensitive+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).</li>
<li>Boldbaatar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+rabies+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).</li>
<li>Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+to+determine+the+stability+of+rabies+virus+genome+in+brains+kept+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).</li>
<li>Dacheux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+combined+Real-Time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+for+the+diagnosis+of+Lyssavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812(2016).</li>
<li>Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentos+de+la+reacci%C3%B3n+en+cadena+de+la+polimerasa+%28PCR%29+y+de+la+PCR+en+tiempo+real%5BTitle%5D)+AND+%22Investigigaci%C3%B3n+en+Discapacidad%22%5BJournal%5D)">Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.</a> Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).</li>
<li>Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p">https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p</a> (2018).</li>
<li>Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ante-and+post-mortem+diagnosis+of+rabies+using+nucleic+acid-amplification+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests.</a> Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2017).</li>
<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).</li>
<li>Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecci%C3%B3n+de+un+virus+r%C3%A1bico+de+origen+vampiro+para+utilizarse+como+cepa+de+desaf%C3%ADo+en+bovino%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinaria+M%C3%A9xico%22%5BJournal%5D)">Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino.</a> Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).</li>
<li>Mendez-Ojeda, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rabies+virus+in+organs+unrelated+to+the+central+nervous+system+of+experimentally+inoculated+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+M%C3%A9xicana+de+Ciencias+Pecuarias%22%5BJournal%5D)">Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats.</a> Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).</li>
<li>Carneiro, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+RNA+in+naturally+infected+vampire+bats%2C+Northeastern+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil.</a> Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).</li>
<li>Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html</a> (2020).</li>
<li>Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+molecular+typing+of+rabies+virus+in+samples+stored+in+inadequate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection+in+Developing+Countries%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).</li>
<li>Finke, S., Cox, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transcription+attenuation+of+rabies+virus+genes+by+intergenic+regions%3A+generation+of+recombinant+viruses+overexpressing+the+polymerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%22">Rabies</a>. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).</li>
<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Önceki çalışmalar, DFA'nın RABV'i sadece numunenin oda sıcaklığında (21 °C)14'tedepolanmasının yedi gün içinde tespit dabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, bu çalışma, numuneler 12 gün boyunca oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra RT-PCR'nin hassasiyetinin azalmaya başladığını göstermiştir. Bu nedenle RABV genom, 23 güne kadar oda sıcaklığına maruz kalan örneklerde qRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu, daha fazla ayrışmış numuneler için qRT-PCR duyarlılığının nispeten daha yüksek olduğunu gösterm...

Kuduz, beyin, cilt, idrar veya tükürükteki viral nükleik asitlerin tespitini sağlayan çeşitli tekniklerle ante-mortem ve post-mortem olarak doğrulanabilir1. Kuduz virüsü nükleoprotein(N)geninin tespiti öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. Bu gen viral genotipleme için de kullanılır. Kuduz, etkilenen beynin herhangi bir bölümünü kullanarak hayvanlarda teşhis edilebilir; bununla birlikte, kuduz olasılığını dışlamak için, beyindeki en az iki bölgeden doku test edilmelidir2. Hayvanlarda kuduz tespiti için çeşitli tanı yöntemleri mevcuttur; bununla birlikte, doğrudan immünofluoresans testi standart referans tekniği olmaya devam etmektedir3. Diğer testler arasında fare aşılama, doku kültüründe enfeksiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)4içeren biyolojik testler yer almaktadır. Tüm bu teknikler, insanlarda ve hayvanlarda kuduz tanısı için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından önerilmektedir, sırasıyla5.
Nükleik asit tespiti ve amplifikasyon teknikleri son yıllarda kuduz tanısında devrim sağlamıştır6 ve bu teknikler insan kuduzunun ante mortem tanısında önemli rol oynamaktadır. Ante-mortem ve post-mortem kuduz tanıları7,8,9,10için konvansiyonel testleri tamamlamak için çeşitli PCR tabanlı testler değerlendirilmiştir. Çoğu tahlil, viral genom 1,11'deen çok korunan bölge olan amplifikasyon için kuduz viral nükleoprotein genini hedefalmaktadır. Son 20 yılda RABV tanısı koymak için çeşitli moleküler tahliller geliştirilmiş ve bu testlerden bazıları virüs karakterizasyonu için kullanılmıştır. Çoğu çalışma, viral genomdaki korunmuş genleri tespit etmeyi amaçlamıştır, en yaygın olarak geleneksel veya nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tahlillerikullanılarak 12,13.
PCR, bu dokular ayrıştığında bile dokular içindeki belirli bir patojenin genomlarını tespit edebilen son derece hassas bir tanı tekniğidir. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, bir DNA nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir14. floresan probları (örneğin, TaqMan) veya DNA bağlayıcı boyaları (örneğin, SYBR Green) içeren qRT-PCR, RABV'yi hem antehem de post- mortem'i yüksek hassasiyetle teşhis etmek için çalışmalarda kullanılmıştır; ancak, böyle bir yaklaşım özel ekipman gerektirir. Bu sınırlamayı aşmak için, RABV'nin tespiti için düşük maliyetine, basitliğine ve arzu edilen özelliklerine dayanarak ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) önerilmiştir. Bu tahlil özellikle gelişmekte olan ülkelerde kullanılabileceği için önemlidir15.
qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicelleştirilmesine dayanır. Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. SYBR Green DNA bağlayıcı boya veya florofor ve quencher taşıyan sıraya özgü oligonükleotid problar gibi spesifik olmayan interkaling boyalar genellikle qRT-PCR'deki floresan okumayı sağlamak için kullanılır. Bu tahlil, daha kısa bir test süresi (2-4 saat), kapalı tüp sistemi nedeniyle kontaminasyon riskinin azalması (güçlendirilmiş ürünlerin PCR sonrası manipülasyon eksikliği) ve aynı anda farklı hedefleri tespit etme yeteneğini içeren geleneksel RT-PCR'ye göre avantajlar sunar16. qRT-PCR, tükürük ve diğer örneklerden kuduz ante-mortem tanısı koymak için kullanılabilir. Bu test, farklı Lyssavirus türlerinin veya RABV15soylarının tespiti için evrensel bir gerçek zamanlı test olarak da kullanılabilir. Bu kombo RT-PCR yaklaşımında iki reaksiyon kullanılır. Birincisi RABV'nin farklı genetik linajlarını, ikincisi ise Lyssavirus türlerini tespit eder. Her iki adım da qRT-PCR tahlillerini içerir, burada ilki hibridizasyon probları kullanır ve ikincisi boyalarkullanır 15. Bu tekniği kullanarak RABV'nin başarılı bir şekilde moleküler olarak tespit edildiğini gösteren çok sayıda test sayesinde, mevcut OIE Karasal El Kitabı (2018), RABV17'ninmoleküler tespiti için PCR kullanılmasını önermektedir.
Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus'un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir. Bu nedenle, México'da sığır paralitik kuduzunun (BPR) önlenmesi ve kontrolü için daha fazla araç geliştirmek önemlidir. Buna dayanarak, bu çalışmanın amacı kuduz enfeksiyonuna bağlı ölümü takiben sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı.
RABV pozitif sığırlardan elde edilen altı beyin, aşağıda açıklanan qRT-PCR protokolünün geliştirilmesinde kullanılmak üzere harici bir laboratuvar tarafından bağışlanmıştır. Sığır beyin yapısı örnekleri inifap CENID-MA laboratuvarı BSL-2 tesisine soğuk zincirle taşınmış ve kullanıma kadar -80 °C'de saklanmıştır. Beyinler Campeche, Yucatán ve Querétaro eyaletlerindeki hayvanlardan elde edildi. Makbuzdan önce, beyinlerden çeşitli yapılar parçalandı. Bu yapılar Ammon boynuzu, serebellum, korteks, medulla, pons ve talamus18,19'uiçeriyordu. Genetik materyal aşağıda açıklandığı gibi çıkarılmıştır. RABV tanısı doğrudan floresan antikorlar (DFA) kullanılarak doğrulandı20. Pozitif kontrol olarak RABV21 ile aşılanmış fare beyinleri kullanılmıştır. Ayrıca, dört RABV negatif sığır beyni (DFA tarafından belirlendiği gibi) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Kloroform</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Mineral yağ ile kaplanmış PCR'lerin sulu fazının geri kazanımını kolaylaştırır.</td></tr><tr><td>DNA Temiz & Konsantratör-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>DNA Temiz & Konsantratör-500 (DCC-500), hızlı, geniş formatlı saflaştırma ve 500 & mikroya kadar konsantrasyon için tasarlanmıştır; büyük ölçekli kısıtlama endonükleaz sindirimleri ve saf olmayan DNA preparatları dahil olmak üzere numunelerden elde edilen g yüksek kaliteli DNA.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Nükleik asitlerin saflaştırılması</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR Sistemi kiti, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Rastgele baz değişikliklerinden kaçınarak PCR ürünlerinin amplifikasyonu için yüksek kaliteli enzim</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td></td><td>BioRad XR +</td> <td>Daha büyük protein ve DNA jellerini analiz eder</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Yeni nesil nükleik asit jel boyaları, boyaların canlı hücrelerdeki nükleik asitlerle etkileşime girme şansını en aza indirmek için tasarlanmış yeni kimyasal özelliklere sahiptirler.</td></tr><tr><td>iCycler Termal Döngüleyici Gradyanı</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>Sıcaklık, cihaz algoritması, numune içi prob veya numune blok modları ile izlenebilir ve kontrol edilebilir</td></tr><tr><td>iTaq Üniversal Problar Tek Adımlı Kit</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>TaqMan tipi hibridizasyon probları kullanılarak PCR reaksiyonlarını gerçek zamanlı olarak gerçekleştirmek için reaksiyon karışımı</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Nükleik asitlerin çökelmesi</td></tr><tr><td>QIAquick jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>QIAquick Kitleri, DNA'nın yüksek tuzlu tamponda bağlanması ve düşük tuzlu tampon veya su ile elüsyon için bir silika membran düzeneği içerir. Saflaştırma prosedürü, DNA örneklerinden primerleri, nükleotidleri, enzimleri, mineral yağı, tuzları, agarozu, etidyum bromür ve diğer safsızlıkları giderir</td></tr><tr><td>M-MLV Ters Transkriptaz</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Moloney Murine Lösemi Virüsü Ters Transkriptaz (M-MLV RT), tamamlayıcı bir DNA zincirini sentezlemek için bir primer varlığında tek sarmallı RNA veya DNA kullanır.</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Mikrohacimli Spektrofotometre</td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 astar</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>Oligo (dT)18 astarı, 5'- ve 3'-hidroksil uçlu sentetik tek sarmallı 18-mer oligonükleotiddir.</td></tr><tr><td>RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri kiti SP6 ve T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>İn vitro transkripsiyon reaksiyonları, rekombinant DNA şablonlarından RNA problarının mikrogram miktarlarını sentezlemek için kullanılır. RNA probları oluşturmak için tasarlanan çoğu transkripsiyon reaksiyonu, büyük miktarlarda RNA Taq DNA Polimeraz Invitrojen üretmek yerine radyoaktif işaretli ribonükleotidlerin dahil edilmesini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#EP0402</td><td>Taq DNA Polimeraz, termofilik bakteri Thermus aquaticus'un oldukça termostabil bir DNA polimerazdır. Enzim 5'i katalize eder ve 3' DNA &nbsp; sentezi;</td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol reaktifi, yüksek kaliteli toplam RNA'nın izolasyonu veya çeşitli biyolojik numunelerden RNA, DNA ve proteinlerin aynı anda izolasyonu için tasarlanmış eksiksiz, kullanıma hazır bir reaktiftir.</td></tr></tbody></table>

Çeşitli sığır beyin yapılarında kuduz virüsünün nicelliği

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Sığır paralitik kuduz (BPR), büyük bir zoonotik risk oluşturduğu Latin Amerika'da önemli ekonomik öneme sahip bir viral ensefalit şeklidir. Burada amacımız, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklı sığır beyin anatomik yapılarında kuduz virüsü (RABV) genomunun bağıl kopya numarasını belirlemek için bir laboratuvar protokolü kullanmaktı. qRT-PCR, bir numunede bulunan belirli gen kopyalarının sayısını, örnekte bulunan hedef nükleik asit miktarıyla doğru orantılı olan amplifikasyondan sonra yayılan floresan bazlı olarak ölçendir. Bu yöntem, kısa süresi, kontaminasyon riskinin azalması ve farklı numunelerdeki viral nükleik asitleri diğer tekniklere göre daha kolay tespit etme potansiyeli nedeniyle avantajlıdır. Altı kuduz hayvanın beyni altı anatomik yapıya, yani Ammon boynuzu, beyincik, korteks, medulla, pons ve talamusa ayrılmıştır. Doğrudan immünoresans testinde tüm beyinlerin RABV antijenleri için pozitif olduğu belirlendi. Dört RABV negatif sığırın beyninden elde edilen anatomik yapıların aynısı da değerlendirildi. RNA her yapıdan çıkarılmış ve qRT-PCR için kullanılmıştır. RABV genlerinin kopya numaralarını belirlemek için in vitro transkript edilmiş nükleoprotein geni kullanılarak bir test yapıldı. Viral RNA'yı ölçmek için kullanılan standart eğri% 100 verimlilik ve 0.99 doğrusallık gösterdi. Analizler, korteks, medulla ve talamusun, bu yapıların en yüksek RABV seviyelerine sahip olduğu gözlemine dayanarak, RABV tespitinde kullanılmak üzere ideal CNS bölümleri olduğunu ortaya koydu. Test özgüllüğü %100 idi. Tüm örnekler pozitif çıktı, yanlış pozitif tespit olmadı. Bu yöntem BPR tanısı sırasında düşük düzeyde RABV içeren örneklerde RABV'yi tespit etmek için kullanılabilir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61429/61429fig01.jpg"> <stro...

Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Çeşitli sığır beyin yapılarında kuduz virüsünün niceliği. Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus'un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir.Kuduz virüsünün saptanması nükleoprotein N geni öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, dna nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir. qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicemine dayanır.Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. Buna dayanarak, çalışmanın amacı, kuduz enfeksiyonuna bağlı olarak, ölümden sonra sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı. Toplam RNA, aşağıdaki protokole göre organik bir ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrudan sığır beyinlerinden çıkarılmıştır.Guanidinium izotiyosiyanat içeren ticari olarak mevcut bir reaktif kullanarak toplam RNA'yı çıkarmak için her anatomik yapıdan 100 miligram beyin dokusu kullanın. Mikrotüp içinde küçük bir pestil bulunan bir Dounce homojenizatını maksimum hızda 15 saniye boyunca kullanarak girdaplayarak guanidinyum izotiyosiyanat reaktifinin bir mililitresinde her yapıdan toplam 100 miligram dokuyu manuel olarak homojenize edin. Numuneleri beş dakika boyunca buzun üzerinde kuluçkaya yatırın ve ardından 200 mikrolitre kloroform ekleyin.Numuneleri 15 saniye boyunca kuvvetlice karıştırın. buz üzerinde iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 12.000 x g'da 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sulu fazı temiz bir tüpe aktarın ve 500 mikrolitre izopropil alkol ekleyin.Numuneleri 21 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatır. Numuneleri 12.000 x g'da 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sulu süpernatantı pipetleme ile epire edin.İzole RNA tüpte bir pelet olarak mevcut olacaktır. Daha sonra, RNA peletini% 75 etanol bir mililitre ile pipetleme ve santrifüj ile 7, 500 x g dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın. Süpernatantı kurutun ve RNA peletini oda sıcaklığında 21 derece kurutun.Daha sonra, peletı 50 mikrolitre çekirdeksiz suda seyreltin. Spektrofotometre kullanarak 260 nanometrede RNA konsantrasyonunu ve kalitesini belirleyin. In vitro transkripsiyon bir hedef genin mRNA'ını oluşturur.Tam RABV N genini yükselten bir astar çifti ve qRT-PCR tahlili için pozitif kontrol olarak kullanılan bir astar çifti kullanın. Bu astarlar, tam RABV N genini güçlendirmek ve T7 polimerazını tanıyan bir promotör eklemek için tasarlanmıştır. Tüm N geni RABV'yi güçlendirmek için trans ve RAB primerlerini ileri ve geri ve yüksek doğrulukta bir PCR kiti kullanın.Her reaksiyon için, her astarın 10 mikromolar ve 0,5 birim yüksek kaliteli polimeraz ile temiz bir PCR tüp reaksiyon tamponu ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın. PCR ürününü in vitro sentez için bir şablon olarak kullanmak ve enzimatik reaksiyonun bileşenlerini çıkarmak için, üreticinin talimatlarına göre, PCR ürününü sütun bazlı bir yoğunlaştırıcı kiti kullanarak arındırın. Ve sonra spektrofotometre kullanarak ölçün.RNA sentezi için, aşağıdaki reaksiyon karışımına sahip bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın:beş mikrolitre T7 transkripsiyon 5X tampon, her trifosfat nükleotitten 1,9 mikrolitre, 10 mikrogram saflaştırılmış RABV N DNA ve enzim karışımının 2,5 mikrolitresi. Daha sonra, karışımı dört saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyon karışımına mikrogram Rnase Içermeyen DNaz başına bir üniteden bir mikroliter ekleyin ve DNA kirlenmesini ortadan kaldırmak için 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.Tüp bebek transkriptif RNA'sını arındırın ve ardından fenol:kloroform:izoamil alkol kullanarak 25:24:1 oranında konsantre edin. Saflaştırılmış RNA peletini 70 mikrolitre TE arabelleğine yeniden depolayın ve kullanıma kadar 80 santigrat derecede saklayın. Yaklaşık beş mikrogram PCR ürünü elde edilene kadar PCR protokolünü tekrarlayın.Saflaştırma ve konsantrasyondan sonra, in vitro transkript N gen mRNA mikroliter başına 4.711 mikrogram konsantrasyonda mevcut olacaktır. In vitro transkriptörlü mRNA'nın bu protokolün beşinci adımını takiben N genine karşılık geldiğini onaylayın ve bunu gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için pozitif bir kontrol olarak kullanın, qRT-PCR. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için, pozitif kontrol olarak tam N genini kodlarken bir in vitro mRNA transkript kullanın.Ticari bir tek adımlı qRT-PCR kiti ile birlikte, üreticinin talimatlarına göre hibridizasyon probları kullanmak. Aşağıdaki termal bisiklet koşullarını kullanarak RABV'nin korunmuş bir bölgesini tespit etmek için Coronado ve iş arkadaşı 2010 tarafından açıklanan astarlarda probu kullanın. Altı ayrık seyreltme elde edilene kadar mRNA'nın mikroliteri başına bir mikrogramı tüplere seri olarak pipetleme yaparak in vitro dilimlenmiş mRNA'nın seri seyreltmelerini gerçekleştirin.Tüpleri standart eğriyi oluştururken kullanılmak üzere üç taraflı olarak 100 mikroliter hacimde hazırlayın. Daha önce açıklandığı gibi qRT-PCR gerçekleştirin. Standart bir eğri oluşturmak için çalışan reaksiyonlarla eş zamanlı olarak çeşitli beyin örneklerini işleyerek ve hücre kültüründen izole edilmiş pozitif kontroller, negatif kontroller ve süpernatantlar kullanarak bir rotorlu termal çevrimde qRT-PCR gerçekleştirin.Testin algılama, test etkinliği ve duyarlılığı sınırını değerlendirmek için, aynı koşullar altında üç taraflı olarak standart bir eğri kullanın. RABV gen N'nin tespiti için, daha önce açıklanan PCR kitini kullanarak qRT-PCR gerçekleştirmek için alan örneklerinden, pozitif kontrollerden, negatif kontrollerden ve hücre kültürü süpernatantlarından RNA'yı kullanın. Sığır beyin örneklerinde bulunan RABV genomunun kopya sayısını belirlemek için, standart eğriden ve biyolojik örneklerden ve kalibrasyon eğrisi denkleminden enterpolasyonlu olanlardan CT verileri elde etmek Bu şekil, sığır beyin dokularının doğrudan immünofluoresansa göre pozitif lekelenme gösterdiğini göstermektedir.Sonuçlar korteks, talamus, medulla, pons ve boynuzda sırasıyla RABV için %100%100%83.3%66 ve %50 pozitiflik göstermektedir. Bu sonuçlar önceki sonuçları doğrular ve her beyinden incelenen yapılardan en az üçü RABV için pozitifti. Öte yandan, standart eğrinin denklemi, örnekteki RABV genetik içeriği miktarı ile PCR güçlendirilmiş parçanın boyutu arasındaki ilişkiyi gösterir.Nanogramlardaki RABV genetik içerik miktarı, bu şekilde sunulan denklem kullanılarak kalibrasyon eğrisinde BT değerlerinin enterpolasyonu ile ortaya çıkarılmıştır. Bu denklem kullanılarak, viral RNA'nın mikroliteri başına bir kez 10 ila beşinci mikrogram algılama sınırının RABV genomunun 36 kopyasına karşılık geldiği bulunmuştur. Bu sonuçlar, tahlilin hassas olduğunu ve düşük sayıda RABV N geni içeren örneklerde virüsü tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.Tahlilin verimliliği, 3.28 olan standart eğrinin eğimi kullanılarak hesaplandı. qRT-PCR için kullanılan örneklerde RABV N geninin amplifikasyonu saptandı. Mevcut viral kopya sayısını belirlemek için, her numunenin CT değerleri kalibrasyon eğrisi denklemi kullanılarak enterpolasyona alındı.Nanogramlarda elde edilen sonuçlar burada açıklanan formüle ikame edildi. Bu tabloda qRT-PCR ve DFA arasındaki karşılaştırmalı sonuçlar göster gösterdir. qRT-PCR tahlillerinin sonuçları DFA kullanılarak elde edilenlerle tutarlıydı.C ve D olgularında qRT-PCR testinde elde edilen sonuçlara göre talamus, RABV N geninin en yüksek sayıda kopyasına sahip yapıdır. Bu, hipotalamik ve talamik nöronların erken enfeksiyonunun, bu nöronların bir hayvanın vejetatif işlevlerini kontrol ettiği göz önüne alındığında, hastalığın gelişiminde önemli olduğunu göstermektedir. Her numunenin her yapısında tespit edilen RABV N geninin kopya numaraları şunlardır: qRT-PCR testinin hassasiyeti ve özgüllüğü tüm örnekler pozitif olduğu için ikimiz de%100'dür.Bu sonuç, örneklerin ilk teşhisleriyle tutarlıdır. qRT-PCR oldukça hassas bir tekniktir. Bazı adımlar en iyi sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir.Bunlardan biri, RNA ekstraksiyonu için numunelerin uygun şekilde işlenmesidir. RNA kolayca bozuldu ve sonuçlar bu nedenle etkilenebileceği için bu adım çok önemlidir. Numuneyi soğuk koşullarda, işlem sırasında yaklaşık dört derecelik bir derecede korumayı düşünün.Ek olarak, in vitro transkripsiyonda belirtildiği gibi birkaç tur PCR uygulamasının gerçekleştirildiğini düşünün. Bu çalışmada yapılan qRT-PCR tahlili, rabv N geninin miligram doku başına 36,3 kadar kopyasını tespit edebilir. qRT-PCR için en uygun beyin yapıları korteks ve talamusu içeriyordu.Bu, bu yapılarda RABV N geninin daha yüksek konsantrasyonlarının tespit edildiği ve RABV referans testi kullanılarak da pozitif olduklarının tespit edildiği gözlemlerine dayanmaktadır. Test, çeşitli örneklerde virüsün dokuzuncu kopyalarına kadar 0.00023 çarpı 0.00023 çok düşük konsantrasyonları tespit edebildi. Örnekteki viral parçacıkları ölçmenin yanı sıra, test burada sunulan RABV'nin tespiti için iyi bir alternatif tanı ve araştırma aracı sağladığı görülmektedir.

quantitation-of-rabies-virus-in-various-bovine-brain-structures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Virüs, serebral korteksteki piramidal nöronları enfekte eder ve eksprese edilen viral proteinler, inklüzyon cisimcikleri olarak bilinen intrasitoplazmik granüler yapılar içinde lokalize olur.

Kuduz Virüsü ile Enfekte Fare Beyin Dokusunda Viral Proteinlerin Tespiti

Bu video, enfekte fare beyin dokusunda kuduz virüsü antijeni tespiti için immünohistokimya boyamayı göstermektedir. Süreç, deparafinizasyon ve alkol tedavisini, ardından antijen erişilebilirliğini artırmak için proteolitik tedaviyi içerir. İmmünohistokimya boyama, doku bölümünde kuduz antijenlerinin varlığını doğrulayan kırmızı çökeltileri ortaya çıkarır.

Kuduz Virüsü Antijenlerinin Saptanmasına Yönelik Bir İmmünohistokimya Boyaması

Kaynak: Zaeck, L.,  et al. Solventten Arındırılmış Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).  Bu video, enfeksiyon ilerlemesini değerlendirmek için kuduz virüsü (RABV) ile enfekte olmuş fare beyin dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesi sürecini göstermektedir. Floresan işaretleyicilerle doku boyama, dehidrasyon, temizleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu için montaj dahil olmak üzere üç boyutlu bir temsilin oluşturulmasıyla...

Fare Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

Doğrudan hızlı immünhistokimyasal test (DRIT), kuduz tanısı için doğrudan floresan antikor (DFA) testine alternatif olarak tanınan hayvan sağlığı ve Dünya Sağlık Örgütü (OIS/WHO) için bir dünya organizasyonu sunmaktadır. Bu test, ışık mikroskobu kullanarak beyin gösterimleri üzerine yaklaşık 1 saat içinde gerçekleştirilebilecek alan tabanlı uygulamalar için izin verir.

Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi

Bu protokolün amacı, kuduz testi için tatmin edici doku örnekleri elde etmek için küçük ve büyük hayvanlarda güvenli Otopsi teknikleri göstermektir.

Büyük ve küçük hayvanlarda kuduz Necropsy teknikleri

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

Burada, nanopor teknolojisini kullanarak kuduz virüsü (RABV) genomlarını karakterize etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. İş akışı, kuduz kontrol önlemlerine rehberlik etmek için dolaşımdaki RABV soyları ve bunların bölgesel filogeniler içindeki yerleşimleri hakkında bilgi sağlayarak yerel düzeyde genomik bilgili sürveyansı desteklemeyi amaçlamaktadır.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Keşfedin: qRT-PCR ile sığır beyin yapılarında kuduz virüsü N geni nicelendirmesi. Bu yöntem, düşük viral yükleri tespit ederek hayvan sağlığı araştırmalarına ve epidemiyolojik çalışmalara katkı sağlar.

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

Daha fazla video keşfet