Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında
11 Ağustos 2020
Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.
Conpokal, örnek yüzeyini dürtmek için bir sonda kullanarak konfokal mikroskopi ile atomik kuvvet mikroskobu yla birleştirir. Her iki teknik de bireysel olarak etkili olmasına rağmen, Conpokal mekanik karakterizasyon ile floresan ko-lokalizasyonu kolaylaştırır. Conpokal tekniğinin en büyük avantajı, yakın eşzamanlı çift mikroskopi olduğunu.
Konfokal, alana özgü mekanik özellikler sağlayan AFM sondası öncesi ve sonrası sitoskeletve diğer hücresel süreçleri inceler. Bu teknik, örneğin, beyin hücreleri elektriksel impulslar ve kuvvet hareketi incelemek için fizyolojik koşullar altında incelenmiş olabilir gibi mekanobiyoloji alanında etkili. Analize başlamadan önce, istenilen veri toplama için uygun bir AFM kantili seçin ve eldiven, AFM yonga montaj aşaması, cımbız ve talaşı cam bloğa monte etmek için küçük bir tornavida kullanın.
AFM çipini cam bloğun ortasına dikkatlice yerleştirin. Cantilever artı AFM çipçok küçük bir kısmı cam bloğun görünür, opak olmayan kısmında olmalıdır. Talaş cam blok karşı rahat olana kadar vida sıkmak için tornavida kullanın ve çip doğru odaklı olup olmadığını kontrol etmek için bir lens kullanın.
Talaş düzgün bir şekilde yönlendirildiğinde, cam bloğu AFM kafasına uygun yönde yerleştirin ve cam bloğu yerine kilitleyin. Kalibrasyon kabının alt kısmını parlak alan mikroskobu yla tespit ettikten sonra, AFM cantilever 2000 mikronlarını numunenin üzerine taşımak için AFM sistemi Z step motor kontrol panelini kullanın. Parlak alan aydınlatması ve Z step motor kontrol paneli kullanarak, AFM ucunu Petri kabına çarpmamak için AFM çipini 100 ila 200 mikron arasında cam kabın dibine kadar yavaşça indirin.
X Y'yi kontrol eden manuel mikrometreleri veya AFM kafasının düz harekethalinde cihaz platformunda bulun. AFM'nin gölgesi karardınve şekil keskinleştikçe, AFM kafasını düzeltmek ve AFM cantilever'in görüş alanı içindeki konumunu ayarlamak için manuel mikrometreleri kullanın. Şu anda, arama tablolarının ayarlanması gerekebilir.
AFM ucunun yemeğin altına yaklaştığını gösteren mikroskop yazılımı görünümünde bir gölgenin görünmesini izleyin. Uç çoğunlukla odak ta ki AFM ucunu düşürmek için küçük adımlar kullanmaya devam edin. Lazer konumalırken, lazer hizalama kadranlarını kullanarak lazeri afm ucunun bulunduğu yerin arka tarafına yerleştirin.
Lazer hizalama paneli sıfır volttan daha büyük bir toplam sinyali göstermelidir. AFM ucunda kalırken maksimum toplam sinyali elde edilene kadar lazeri, AFM kantilinin tüm yönlerinde küçük bir mesafeyi hareket ettirin. Lazer konumu ayarlandıktan sonra, dikey ve yanal sapma sıfır manuel olarak kontrol sapma kadranları kullanın.
Hedefin ortalanması ve lazer hizalama panelinde dikey veya yanal sapma olmaması için dedektörü hizalamak için dikey ve yanal sapma düğümlerini kullanın. Kalibrasyon penceresini açın ve tüm deneylere özel bilgileri girin. Lazer ışık filtresini değiştirin.
Kalibre etmeden önce, konfokal mikroskop ışık kaynağını kapatın ve oda ışık veya titreşimlerinden kaynaklanan olası gürültüyü azaltmak için AFM kasasını kapatın. Sistemin ucu otomatik olarak kalibre etmesine izin vermek için Kalibrasyon düğmesine basın. Kalibrasyon tamamlandığında, kantilever sertliği ve hassasiyeti Kalibrasyon panelinde görüntülenir.
Ardından, tarama başlatma düğmesine basmadan önce, ipucunu örnek yemeğin altına düşürmek ve cilt alanının boyutunu, çözünürlüğü, ayar noktasını, Z uzunluğunu ve piksel süresini ayarlamak için Otomatik Yaklaşım Komutu düğmesini kullanın. Mikroskop yazılımında konfokal mikroskop görüntülemeiçin konfokal yetenekleri etkinleştirin ve numuneleri lekelemek için kullanılan boyalara uygun lazer çizgilerini seçin. Örnekteki bu özellikleri heyecanlandırmak ve görüntülemek için bir veya birden çok lazer çizgisi seçin ve kazancı örnek floresanını optimize eden ancak gürültü miktarını sınırlayan bir değere ayarlayın.
Dinamik aralığı en üst düzeye çıkarırken doymuş pikselleri önlemek için lazer gücünü ayarlayın ve optik kesit çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği boyutunu bir alan birimine ayarlayın. Gerekirse, değerleri örnek parlaklığına göre ayarlayın. Piksel çalışma süresini ayarlamak için yaklaşık iki mikrosaniyelik bir yaşam süresiyle başlayın ve gerektiğinde örnek parlaklığını yansıtacak şekilde ayarlayın.
Seçili hedef için piksel boyutunu seçmek için, enstrümanın Nyquist seçeneği düğmesi ve görüntüdeki seçilen piksel sayısını kullanarak piksel boyutunu hesaplamasına izin verin. Ardından, Tscan seçeneğini seçin ve veri toplamaya başlayın. Örnek özelliklerini en net formunda temsil eden odak düzlemini, veri toplamaya başlamak için Scan düğmesini ve iki boyutlu bir görüntü yakalamak için Yakalama düğmesini bulmak için odak düğmesini kullanın.
Nyquist seçeneği ile piksel boyutunu kontrol eden paneli kullanarak, yalnızca tek bir hücreyi saran tarar'ın alan boyutunu küçültün. Toplama aracını etkinleştirin ve yalnızca örnekteki bir özelliği en net şekilde aydınlatan lazer çizgisiyle altseçeneğini kullanarak, düzlemler arasında önerilen boşluk kullanılarak ölçülecek ses düzeyi için başlangıç ve bitiş düzlemlerini ayarlayın. Dosyayı adlandırın ve ilişkili klasöre kaydedin.
Alternatif olarak, numune kalınlığı hakkındaki priori bilgimiz varsa, sesi tanımlamak için odağı ayarlayarak en parlak, en keskin, orta düzlemi seçin ve orta düzlemin üzerinde örnek kalınlığına sahip olacak şekilde üst kısmı, orta düzlemin altındaki kalınlığa sahip alt kısmı ayarlayın, ardından uygun adım boyutunu seçin. Şimdi Çalıştır düğmesine basarak satın almayı çalıştırın. Edinme bittiğinde, dosyayı uygun klasöre kaydedin.
Deneyin sonunda, cam bloğu çıkarırken eldiven giyin ve montaj istasyonuna yerleştirin. AFM çipini dikkatlice çıkarmak için kauçuk kulplu cımbız kullanın ve kullanılmış ucu, kullanıldığını belirtmek için erişimkapalı olarak yönlendirilen depolama kutusunun konumuna geri yerleştirin. İleride başvuru için, denemede hangi ipucunun kullanıldığını not edin.
Burada, yaşayan bir HEK hücresi üzerinde temsili bir AFM tonu gösterilir. Bu hek hücresinin yüksekliği, hat tararcının gösterdiği gibi yaklaşık 10 mikron civarındaydı. Burada, uygun olmayan bir AFM ipucu seçimi nedeniyle kötü bir tarama örneği görülebilir.
Bu resimde, afm PA bölgesinin büyük hücre yüksekliği nedeniyle kapsama alanı dışında olduğunu gösteren hücrenin en tepesinde siyah pikseller belirdi. AFM kantilinin ucu, hücre yüksekliğine göre yetersiz uç yüksekliğiyle birleşen uç ofset nedeniyle görüntüde de görünür. AFM görüntüdeki bu yapılar, hücreyi görüntülemek için farklı bir AFM ipucunun seçilmesi gerektiğini gösterir.
Üç renk konfokal görüntüleme yapılabilir. Örneğin, hücre çekirdeğini, mikro tübülleri ve lipophilic membranı görselleştirmek için. Nano mekanik model ile birlikte uç girintilerinin analizi, yüzeyin bir modül haritası nın üretimine olanak sağlar.
Burada lazer konfokal Z yığınının karşılık gelen 3Boyutlu projeksiyonu gösterilmiştir. Streptococcus mutans bakterisinin bu temsili analizinde gözlendiği gibi, AFM taramaları ve ölçülen modül haritaları mikroplar için de elde edilebilir. Gösterildiği gibi, geleneksel konfokal mikroskopi ile daha iyi bir çözünürlük AFM ile bu ölçekte elde edilebilir.
Yapıştırıcı kuvvet haritalama moleküler etkileşimleri görselleştirmek için conpokal ile yapılan bir tekniktir. Örneğin, bağlayıcı kinetik gözlemlemek için hücre yüzey moleküllerinin modülasyon çalışma. Conpokal, tıbbi mikrobiyolojide yapı fonksiyon ilişkilerini keşfetmek için yeni bir yol açmaktadır.
Örneğin, fiziksel ve kimyasal olaylar ve peptidoglikan tabakası, antibiyotik direnci ile bağlantılı olabilir.
Genel Bakış
Conpokal tekniği, konfokal ve atomik kuvvet mikroskobunu entegre ederek canlı biyolojik örneklerin neredeyse eşzamanlı görüntülemesini ve mekanik karakterizasyonunu sağlar. Bu yöntem, floresan görüntüleme ile birlikte mekanik özellikler hakkında ayrıntılı bilgiler sağlayarak hücresel süreçlerin incelenmesini geliştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mekanobiyoloji
- Hücresel Görüntüleme
- Biyofiziksel Karakterizasyon
Arka Plan
- Conpokal, iki güçlü mikroskopi tekniğini birleştirir.
- Floresan eşlokalizasyonu ile mekanik karakterizasyonu sağlar.
- Bu teknik, özellikle fizyolojik koşullar altında beyin hücrelerinin incelenmesinde kullanışlıdır.
- Araştırmacıların canlı hücrelerde elektriksel impulslar ve kuvvet işlemlerini incelemesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Conpokal tekniği için bir protokol sağlamak.
- Biyolojik araştırmalarda çift mikroskopinin avantajlarını göstermek.
- Hücresel mekanik ve süreçlerin anlaşılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- AFM kantilevrelerinin seçimi ve montajı.
- AFM sisteminin kalibasyonu.
- Konfokal görüntüleme kurulumu ve optimizasyonu.
- Veri toplama ve analiz prosedürleri.
Ana Sonuçlar
- Konfokal ve AFM görüntülemenin başarılı entegrasyonu.
- Canlı hücrelerin mekanik özellik haritasının gösterimi.
- Mekanik stres altında hücresel davranışın geliştirilmiş anlaşılması.
- Araştırmada tekrarlanabilirlik için ayrıntılı bir protokol sağlanması.
Sonuçlar
- Conpokal tekniği, mekanobiyolojide değerli bir araçtır.
- Hücresel mekanik ve süreçlerin kapsamlı analizini sağlar.
- Bu yöntem, biyolojik araştırmalarda yeni bilgilere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Conpokal enables near simultaneous confocal imaging and atomic force microscopy, providing co-localized mechanical and fluorescence data from live cells. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking in target validation by linking subcellular structures to nanoscale mechanical properties such as elastic modulus and adhesion. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by enabling direct correlation of cytoskeletal dynamics with force transmission in physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating cytoskeletal organization with localized mechanical responses in live cells.
- Operational Value: Enables area-specific mechanical property mapping (e.g., elastic modulus, adhesion) alongside subcellular fluorescence signals.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by revealing how molecular perturbations affect cellular mechanophenotypes under near-physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated live-cell systems for quantitative nanomechanical readouts that complement fluorescence-based assays.
- Operational Value: Standardizes probe-sample interaction through calibrated AFM cantilever selection and controlled indentation parameters.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across cell types (e.g., HEK cells, Streptococcus mutans) for consistent mechanical phenotyping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links nanoscale mechanical maps (e.g., modulus, adhesion) to subcellular components via fluorescence co-localization, supporting biomarker alignment in mechanobiology.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of cellular responses to mechanical or chemical perturbations in live microbiological samples.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies structural-functional relationships (e.g., peptidoglycan layer changes linked to antibiotic resistance) that inform go/no-go decisions in antimicrobial development.
Pipeline & Workflow Integration
Conpokal fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing orthogonal mechanical and imaging data from the same cellular region.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how cytoskeletal drugs or genetic edits alter local stiffness and adhesion in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative nanomechanical outputs (e.g., force maps, modulus distributions) when AFM parameters are standardized and calibrated.
- Analytics: Generates co-localized datasets where mechanical properties are directly overlaid with confocal signals (e.g., tubulin, nucleus, membrane) for multiparametric analysis.
- Translational Research: Connects nanomechanical phenotypes to disease-relevant systems (e.g., microbial biofilms, neuronal cultures) only when supported by parallel fluorescence readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable core facility capability for mechanophenotyping across diverse live-cell models without requiring sample fixation or fixation-induced artifacts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking fluorescence-identified structures to quantified mechanical properties at subcellular resolution.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized AFM tip calibration, laser alignment, and deflection zeroing prior to data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, multi-parametric evidence of target engagement effects on cellular mechanics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to normalize pathological mechanophenotypes in disease-relevant live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both confocal microscopy and atomic force microscopy, including probe selection and laser safety.
- Dependent on instrumentation capable of near-simultaneous modality integration, including synchronized scanning stages and dual-detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of indentation parameters (set point, Z length, pixel time) for reproducible mechanical mapping across labs.
- Requires adaptation of AFM cantilever stiffness and tip geometry to match sample topography (e.g., avoiding tip-offset artifacts in high-height cells like HEK).
- Practical limitation: Accurate mechanical mapping depends on proper tip-sample contact and avoidance of artifacts from insufficient tip height or PA zone saturation, as demonstrated in failed scans.
