Name: Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Öğrenin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobisi kullanarak primer nöronlarda proteinlerin ve sinaptik belirteçlerin eş lokalizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem, yaklaşık 100 nanometre çözünürlükte sinaptik protein etkileşimlerini çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar edoardo Micotti'ye el yazmasına yönelik yapıcı eleştirileri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma BrightFocus A2019296F, Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale by la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ve Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK) tarafından desteklenmiştir.

1. Birincil kültürler
<ol><li>#1.5 (0.17 mm) kapak kalınlığı için objektif gereksinime uyan odalı kapaklı dudaklarda (Ibidi μ-Slide 8 Kuyu veya Nunc Lab-Tek Odalı Coverglass gibi) kültür faresi hipokampal primer nöronlar.</li>
	<li>100 μL poli-L-lizin (100 μg/mL) ile paltolu kapaklar.</li>
	<li>Ertesi gün, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odalı kapakları yıkayın.</li>
	<li>Fare birincil nöronlar elde etmek için, P1-P4yavru23gelen hipokampi izole .</li>
	<li>Diseksiyon Media(Tablo 1)10 mL diseksiyon hipokampi yerleştirin ve onları tüpün altına yatırın.</li>
	<li>Steril bir pipet kullanarak, dikkatle Diseksiyon Medya kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.</li>
	<li>Hippocampi'ye 10 mL Medya(Tablo 1)ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Steril bir pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde Medya 1 kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.</li>
	<li>10 mL Media 2(Tablo 1)ekleyin ve (kapaklı) santrifüj tüpünü kaputun altında yatay olarak 45 dakika bekletin.</li>
	<li>Santrifüj tüpün dikey olarak durmasını bekleyin ve dokunun tüpün dibine yerleşmesini bekleyin.</li>
	<li>Steril bir pipet kullanarak Media 2'yi dikkatlice çıkarın ve hipokampiyi santrifüj tüpünün altında rahatsız edilmeden bırakarak.</li>
	<li>2 mL Ortam 3(Tablo 1) ekleyin.</li>
	<li>Filtrelenmiş uçlu bir p1000 pipet kullanarak hücreleri dokudan mekanik olarak ayırın.</li>
	<li>İzole nöronların bulunduğu süpernatantı 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 300 x g'da (RT) 2 dk santrifüj edin.</li>
	<li>Santrifüjden sonra hücreler santrifüj tüpünün alt kısmında yer alır. Steril bir pipet kullanarak supernatant atın.</li>
	<li>Media 4'ün 1 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Çözünmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için 70 μm filtre kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 19 μL'sine %0,4 Trypan mavisi çözeltinin 1 μL'sini ekleyerek Bürker odasındaki canlı hücreleri sayın.</li>
	<li>70.000 hücre/kuyudaki plaka hücreleri kuyu başına 200 μL hacimdedir.</li>
	<li>Hücrelerin 37 °C ve %5 CO 2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 saat boyuncabağlanmasınaizin verin.</li>
	<li>Odacıklı kapakları kuvözden alın ve ortamı 200 μL Kültür Medya ile dikkatlice değiştirin.</li>
	<li>Odacıklı kapakları 37 °C ve %5 CO2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bırakın.</li>
	<li>Her 5-7 günde bir ortamın üçte birini taze kültür medyası ile değiştirin.</li>
	<li>Hipokampal primer nöronlar tamamen olgunlaşmış kadar bekleyin (12-14 gün kaplama sonra) co-lokalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için.</li>
</ol>2. İmmünofluoresans boyama
<ol><li>Kuvözdeki odacıklı kapakları alın.</li>
	<li>Ortamı çıkarın.</li>
	<li>Kuyuları 200 μL PBS ile hızlıca yıkayın.</li>
	<li>PBS'de (200 μL/well) nöronlara hızlı bir şekilde düzeltmek için %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.</li>
	<li>HÜCRELERI 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PFA çözümlerini çıkarın.</li>
	<li>% 0.2 Triton X-100 (200 μL/ iyi) ile PBS ekleyerek hücreleri permeabilize.</li>
	<li>RT'de 1 dakika kuluçka.</li>
	<li>Çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS'de %1 büyükbaş serum albumini (BSA) ile (200 μL/iyi) 1 saat boyunca RT'de analiz için alakasız bir proteinle plakanın tüm serbest bağlayıcı yüzeylerini pasif olarak kaplayın. Triton X-100 olmadan BSA tabanlı engelleme tamponu, %0,2 Triton X-100 ile aynı tampondan daha verimli bir şekilde antikor arka planını azaltır.</li>
	<li>Çözümü çıkarın.</li>
	<li>%1 BSA ve %0.2 Triton X-100 içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikor (antikor seyreltmesi ve kullanılabilirliğine bağlı olarak 120-200 μL/kuyu) ekleyin. Örnekleri 2 saat kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Negatif kontrol olarak, kuyulardan birine herhangi bir birincil antikor eklemeyin. Farklı hedeflere karşı farklı türlerin birden fazla antikorları aynı anda kullanılabilir. TAVUKTA YÜKSELTİlEN MAP2 (nöronal belirteç) karşı bir antikor, farede yetiştirilen PSD95 veya sinaptophysin'e karşı bir antikor ve tavşanda yetiştirilen bir hedef proteine karşı bir antikor kullanın. Bu, üç renkli SIM analizleri sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.</li>
	<li>%1 BSA ve %0,2 Triton X-100 (200 μL/well) içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlar (dyLight ve Alexa sekonder antikorlar kullanılabilir). Rt'de 1 saat boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.</li>
	<li>Çekirdekleri lekelemek için PBS'de (200 μL/iyi) seyreltilmiş 1 μg/mL konsantrasyonda Hoechst boyaekleyin. Rt'de 10 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS ile kuyuları iki kez hızlıca yıkayın.</li>
	<li>SIM uyumlu bir montaj antonu kullanarak hücreleri monte edin. 10 μL/well prolong cam antifade mountant kullanın.</li>
	<li>Hücreleri bir kapak camı (örn. 8 mm çapında yuvarlak bir kapak lı cam) ile kaplayın ve koruyun. Kare olanlar da kullanılabilir.</li>
	<li>Odacıklı kapakları RT'de saklayın ve görüntü almadan önce en az 48 saat bekleyin. Diamond Glass süper çözünürlüklü satın almadan önce en az iki gün kür gerektirir.</li>
</ol>3. Antikor özgüllük kontrolü
NOT: Antikor özgüllüğünü sağlamak için iki strateji kullanın. İlk strateji, aynı substratı hedefleyen en az iki farklı antikor kullanmaktır. İkinci strateji saflaştırılmış protein hedefi veya antikor yükseltmek için kullanılan epitop ile kuluçka ile antikor nötralizasyon olduğunu.
<ol><li>PBS'de %1 BSA'da 1 saat boyunca rekombinant hedef veya epitopun beş kat fazlasıyla tercih edilen antikora inkübün.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2.11 boyama için her zamanki konsantrasyonda nötralize antikor kullanın.</li>
</ol>4. Mikroskop kalibrasyonu
NOT: Nikon tarafından üretilen n-sim süper çözünürlüklü mikroskop sistemini süper çözünürlüklü çalışmalar için rutin olarak kullanıyoruz. Ancak, diğer birçok şirket de kendi kataloglarında süper çözünürlüklü mikroskoplar sunuyoruz. Nikon'un N-SIM sistemi için özel endikasyonlar açıklansa da, takip eden talimatlar diğer sistemlere genellenebilir. SIM görüntülerin edinilmesinden önce, sistem belirli alt çözünürlüklü boyutta floresan boncuklar ile uygun bir kalibrasyon gerektirir. Buna bir örnek TetraSpeck mikroküreleridir. Bu boncuklar farklı floresan boyalar ile tek bir örnek ile farklı lazerlerin kalibrasyonu sağlamak için boyanmıştır.
<ol><li>Bir su banyosu nda 10 dakika boyunca 1.8 x 108 floresan mikrosferler civarında sonicate. Nikon'un N-SIM sistemi kalibrasyon için seyrek nüfuslu çok renkli boncuk örneği gerektirir. Bu alt çözünürlük boyutu floresan boncuk yoğun bir tek katman gerektiren diğer sistemler için farklı olabilir. Floresan partiküllerin sayısını buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Floresan mikrosferleri 1:500'ü çift distile suda seyreltin.</li>
	<li>Ek bir 10 dakika için ikinci kez Sonicate.</li>
	<li>Pipet 15 l sulandırılmış boncuklar odalı bir kapak bir kuyuiçine.</li>
	<li>Çözeltinin RT'de 5 dakika kurutulmasına izin verin.</li>
	<li>Montaj çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin ve üzerine 8 mm'lik bir kapak kaydırın.</li>
	<li>Uygun kür izin vermek için en az 48 saat bekleyin.</li>
	<li>Mikroskobu ve lazerleri açın.</li>
	<li>Tüm mikroskop bileşenlerinin termal dengesine ulaşmak için sistemin ısınmasına izin verin. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop Sistemi en az 3 saat sürer.</li>
	<li>100x hedefini seçin.</li>
	<li>Lazerleri kırınım ızgara bloğunun ortasına hizalayarak kalibrasyonu başlatın. N-SIM sisteminde, bir mikrometre knob ve özel bir kamera, ışık demetlerinin hedefe ortalanmasına olanak sağlar.</li>
	<li>Görüntülemek için odacıklı kapak fişini mikroskopa yerleştirin. Objektif düzeltme yakasını ayarlayarak sistemi odalı kapak kalınlığına ayarlayın. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop sistemleri ile sağlanan tescilli yazılım Olan NIS yazılımı, düzeltme yakalarını düzenlemek için otomatik bir fonksiyona sahiptir.</li>
	<li>Numune üzerinde odaklanmış yapılandırılmış desen aydınlatması sağlamak için her kanal için ızgara bloğu odağı ayarlayın. NIS yazılımı bu görev için otomatik bir işlev sağlar.</li>
	<li>Ardından, çok renkli mikrokürelerin ham 3D-SIM görüntülerini edinin. Biyolojik görüntülerin analizi için mikroskop yazılımı veya açık kaynak yazılım platformu kullanarak süper çözümlü görüntü elde etmek için ham görüntüleri yeniden oluşturmak ImageJ24 ve eklenti fairSIM25.</li>
	<li>Her ayrılmış dalga boyu için 4,14'te elde edilen süper çözümlü görüntünün Fourier dönüşümünü hesaplayın. Dönüştürülen görüntü doğru çiçek benzeri bir desen elde edemezse, süper çözünürlük elde edilemediğinden kalibrasyonu 4,11'den yeniden başlatın.</li>
	<li>Süper çözümlü görüntüde, elde edilen çözünürlüğü ölçmek için tek bir mikrosfer seçin ve her kanal için yoğunluk profilini hesaplayın. Şimdi yanal olarak 100 nm yakın olmalıdır.</li>
	<li>Ardından, mikrokürelerin çok kanallı bir edinimi kaplayarak kanal kaydı gerçekleştirin. Amaç, tüm kanal sinyallerini yanal ve eksenli olarak harmanlamaktır. Bu, farklı kanalların yanlış hizalanması nedeniyle renk sapmalarını ortadan kaldırır ve birlikte yerelleştirme analizine yardımcı olur.</li>
	<li>Açık kaynak uygulaması ImageJ için bir eklenti paketi olan SIMcheck26'nın"Aydınlatma Faz Adımları" ve "Aydınlatma Desen Odağı" işlevlerini kullanarak kalibrasyon kalitesini onaylayın. Bu amaçla, yoğun bir TetraSpeck mikroküre tabakası elde etmek ve numunenin 3D SIM görüntüsünü elde etmek için odacıklı bir kapak fişi hazırlayın. ImageJ'deki görüntüyü analiz edin ve sapmalar tespit edilirse, 4.11 adımdan mikroskop kalibrasyonünü yeniden başlatın.</li>
</ol>5. Satın alma
<ol><li>Confocal veya widefield modunda 40x hedefi kullanarak örnek analiz başlayın. Bu, iyi ayrıntıları ve geniş bir görüş alanı koruyarak, örnek navigasyon sağlar.</li>
	<li>Nöronal süreçleri temsil eden bir alanı belirlemek için MAP2 antikor sinyalini kullanın.</li>
	<li>Boyama kalitesini belirlemek için numunenin konfokal modda görüntülerini edinin. Düşük konfokal kalite, düşük SIM kalitesini yansıtacak, bu nedenle numunelerin atılmasını gerektirecektir.</li>
	<li>Görüntülerin alanı ve kalitesi tatmin ediciyse, hedefi 100x'e geçin.</li>
	<li>100x hedefine yağ uygulayın.</li>
	<li>Süper çözümlenmiş görüntünün kalitesini değerlendirmek için daha sonra kullanılacak geniş alan veya konfokal görüntü elde edin (Şekil 1A,B).</li>
	<li>3D-SIM moduna geçin.</li>
	<li>Edinme parametrelerini ayarlamak için iletişim pencerelerini kullanarak, renk bilgilerini en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilen en yüksek bit derinliği ayarını seçin. Genellikle, 16-bit standart seçimdir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranını artırmak için, 1 MHz gibi satın alma için düşük frekans değeri seçin.</li>
	<li>Histogram pencereleri kullanarak, sinyal doğrusal bir yanıt elde etmek için lazerler güç ayarlayın. Bilgi kaybını önlemek için görüntülerdeki doymuş pikselleri sınırlayın. N-SIM sistemi Andor iXon3 kamera kullanır. 16 bit'te çalışırken, kameranın doğrusal tepkisini sağlamak için 16.000 hedef yoğunluğu seçin. Alternatif olarak, satın alma dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için 30.000-45.000 arasında bir aralık seçin.</li>
	<li>Numuneleri görüntülerken %0,1 ile %50 arasında lazer gücü ve 50 ms ile 2 s arasında maruz kalma süreleri ayarlayın. %50'nin üzerindeki lazer güçleri, kullanımdaki floroforların hızlı fotobeyazrlanmasına neden olabilir.</li>
	<li>Görüntüleri 3D-SIM modunda edinmeye başlayın.</li>
	<li>Raw görüntülerin edinim kalitesini değerlendirmek için ImageJ için ücretsiz eklentipaketi olan SIMcheck'i kullanın.</li>
	<li>SIMCheck herhangi bir yapı veya kalite sorunu algılamazsa, istatistiksel analize izin vermek için 4 teknik kopyadan en az 10 görüntü elde edin.</li>
</ol>6. Post-prodüksiyon: görüntü rekonstrüksiyonu
NOT: 3D-SIM edinilmiş görüntüler, yeniden oluşturulmuş süper çözümlü görüntüleri elde etmek için işlenmesi gereken ham görüntülerdir. Ham görüntülerin yanlış yeniden yapılandırılması, örneklerin analizini etkileyecek yapılara yol açabilir. Bu nedenle rekonstrüksiyon parametrelerinin doğru şekilde seçilmesi için büyük dikkat edilmelidir.
<ol><li>Süper çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için mikroskop rekonstrüksiyon analiz yazılımını kullanarak ham görüntüleri işleyin(Şekil 1C). Alternatif olarak, ham görüntüleri yeniden oluşturmak için serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentifairSIM kullanın.</li>
	<li>Mikroskop rekonstrüksiyon yazılımı veya ImageJ eklentisi SIMCheck kullanarak süper çözülmüş görüntülerin Fourier dönüşümünü hesaplayın. İyi bir yeniden oluşturulmuş görüntü, her kanal için, bir çiçek gibi görüntü dönmek gerekir. Yeniden yapılandırıladaki görüntüler çiçek benzeri bir şekli yeniden oluşturamazsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodization ve sıfır sıra bastırma27gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden oluşturun. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözülmüş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, parametreleri değiştirmek i) Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, ii) Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve iii) Odak Dışı Bastırma.</li>
	<li>Daha sonra, nanoj-SQUIRREL28kullanarak tarafsız bir şekilde eserler tespit etmek için yeniden oluşturulmuş görüntü analiz , süper çözülmüş görüntülerin kalitesini değerlendirmek için bir ImageJ tabanlı eklenti.</li>
	<li>NanoJ-SINCAP yapıları algılarsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodizasyon ve sıfır sıra bastırma gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden yapılandırın. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözümlenmiş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve Odak Dışı Bastırma parametrelerini değiştirin.</li>
	<li>Ortak yerelleştirme profilini ve/veya Pearson ve Mander'in katsayılarını hesaplamak için süper çözümlenmiş görüntüleri kullanın.</li>
</ol>7. Profil analizi ile birlikte yerelleştirme
NOT: Sinaptik belirteçler ve ilgi çekici bir protein arasındaki birlikte lokalizasyonu incelemek için ilk adım olarak, süper çözümlenmiş bir görüntü alın ve sinyal çakışmasını belirlemek için tek bir lokusu analiz edin.
<ol><li>Süper çözümlenmiş görüntüde tek bir locus tanımlayın.</li>
	<li>İlgi çekirgelerinin floresan sinyallerinin yoğunluk profillerini elde edin.</li>
	<li>Verileri dışa aktarın.</li>
	<li>Tüm sinyal tepelerini normalleştirmek ve locus'a özgü eş yerelleştirmeyi belirlemek amacıyla her kanal için karşılaştırılabilir sinyal yoğunlukları elde etmek için GraphPad Prizma veya benzer bir analiz yazılımı kullanın.</li>
</ol>8. Pearson ve Mander katsayıları quantification
NOT: Profil analizi tek lokus eş lokalizasyonu önermişse, Pearson ve Mander'in katsayıları29,30hesaplanarak tüm resmin daha genel bir analizi yapılabilir.
<ol><li>Co-localizasyon iki parametre: Pearson ve Mander's: belirlemek için JACoP31kullanın , bir ImageJ eklentisi.</li>
</ol>9. İstatistiksel analiz
<ol><li>JACoP ile toplanan verileri işlemek için GraphPad Prizma'yı veya benzer bir analiz ve grafik yazılımLarını kullanın.</li>
	<li>Grafikleri elde etmek ve istatistiksel alaka düzeyi için analiz edilen her durum için en az 40 SIM görüntü kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+M+%22A+textbook+of+physiology%2C+part+three%3A+The+central+nervous+system+%287th+ed.%29%22">A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.)</a>. , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).</li>
<li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li>
<li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li>
<li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy%3A+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).</li>
<li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133(2019).</li>
<li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy%3A+The+Treachery+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li>
<li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361(2009).</li>
<li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290(2016).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptopathy%3A+dysfunction+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li>
<li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia%3A+Insights+from+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li>
<li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+spectrum+disorder+causes%2C+mechanisms%2C+and+treatments%3A+focus+on+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li>
<li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li>
<li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li>
<li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases%3A+a+trafficking+problem%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803(2013).</li>
<li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980(2016).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy%3A+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li>
<li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoJ-SQUIRREL%3A+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%E2%80%99s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li>
<li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li>
<li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases%3A+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li>
<li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan32. Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir aydınlatma deseni kullanarak, normalde 0,03 ile ...

Anlayış ve sinaps görünümü 18971Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi3. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyalizasyon 4içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.
Anlayış kazanımları kısmen sinapsların boyutuna uygun geleneksel ışık mikroskobu kırınım sınırını aştı süper çözünürlük teknikleri nedeniyle daha iyi5,6,7,8,9,10. Kırınım sınırı nedeniyle, optik mikroskop yanal olarak 200 nm üzerinde bir çözünürlüğe ulaşamaz11,12. Bu sınırı atlamak için, farklı yaklaşımlar kullanılarak ve farklı alt kırınım sınır kararlarına ulaşan süper çözünürlük teknikleri oluşturuldu: SIM, STED (Uyarılmış Emisyon Tükenmesi Mikroskopisi), PALM (FotoAktislokalizasyon Mikroskopisi) ve STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM uyarma ışını yolu15içine bir kırınım ızgara ekleyerek lazer tabanlı geniş alan mikroskobu sistemlerinin mekansal çözünürlüğü iki katına çıkar. Hareketli ızgara, lazer ışınlarını difüzörlererek bilinen bir aydınlatma deseni oluşturur, genellikle çizgiler. Bu amaçla yapılandırılmış ışık deseni floresan boyanın (numunenin) bilinmeyen mekansal dağılımına yerleştirilir. İki modelin oluşturduğu girişim saçaklar, normal geniş alan mikroskobu yla ayırt edilemeyen ince ayrıntıları kodlar. Son süper çözümlü görüntü, kırınım ızgarasının çevirileri ve rotasyonları ile elde edilen aynı örneğin birkaç ham görüntüsünün matematiksel yöntemlerle birleştirilmesi ve kodlanması ile elde edilir. Süper çözülmüş görüntülerin çözünürlüğü lateral de 100 nm ve eksenel yönlerde 500 nm'ye ulaşır 2D-SIM15 veya 100 nm lateral de xeksensel yönlerde 3D-SIM16.
Sinaps yeni anlayış sinaptik disfonksiyon başlangıçlı ve ilerleme önemli bir rol oynar birçok nörolojik bozukluklar ışığında daha da önemlidir17,18. Alzheimer hastalığı, Down sendromu, Parkinson hastalığı, prion hastalıkları, epilepsi, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri arasında kırılgan X sendromu sinaptik kompozisyon anormallikleri ile bağlantılı olmuştur, morfoloji ve fonksiyon19,20,21,22.
Son zamanlarda, SUMO özgü antikorlar bir dizi kullanarak, biz süper çözünürlük düzeyinde pre-ve post-sinaptik belirteçleri sinapofiz ve PSD95 ile SUMO proteinlerinin primer hipokampal nöronlarda co-lokalizasyon göstermek için SIM kullanılır23. Bu, nöronlarda SUMO lokalizasyonuna dair biyokimyasal ve konfokal mikroskopi kanıtlarını doğrulamamızı sağladı.
Burada, fare hipokampal primer nöronlarda proteinlerin lokalizasyonunu inceleyen bir protokol uyguluyoruz. Aynı zamanda, bu protokol birincil nöronal kültürlerin farklı adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15250061</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>70 & M filtresi&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher</td> <td>Bilimsel-Antikor</td><td></td></tr> <tr><td>Antikoru SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>B27 Ek</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504044</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Odacıklı lameller</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher Scientific-Antikor</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FluoSpheres karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler, 0.1 & mu; m, sarı&ndash; yeşil floresan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>G8769</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>H3537</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>L-Cystein ve nbsp;</td><td>Merck Yaşam Bilimleri&nbsp;</td><td>C6852-25g</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Antikoru</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21575022</td><td>Orta</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>M8266</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR Uluslararası</td><td>1.091.371.000</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Nörobazal A</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10888022</td><td>Orta</td></tr><tr><td>N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop</td><td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Yaşam Bilimleri ve nbsp;</td><td>P-3125</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>paraformaldehit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Kalem/Strep 10x</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu tuzlu su&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Poli-L lizin</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>ProLong Elmas Cam Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>PSD95 ve nbsp;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Yuvarlak kapak camı</td><td>Termo</td><td>12052712</td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Sinaptofizin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S5768&nbsp;</td><td>antikor</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Tripsin inhibitörü ve nbsp;</td><td>Merck Yaşam Bilimleri&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Kimyasal</td></tr></tbody></table>

primer nöronlarda proteinlerin ve sinaptik belirteçlerin eş lokalizasyonunun İncelenmesinde süper Çözünürlüklü görüntüleme

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm'lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.

Burada nöronal proteinlerin eş lokalizasyonunu incelemek için standart iş akışını sıyoruz. Önce mikroskobu kalibre ettik ve ardından numunelerin SIM analizini yaptık. Sistemi kalibre etmek için 0,1 m çapında floresan mikroküreler kullandık. Boncukların süper çözümlü 3D-SIM görüntüleri elde edildikten sonra, temel deki görüntü verileri, bunları uzamsal frekans gösterimine dönüştürmek için Fourier dönüştürülmüştür. Şekil 2A'da,farklı çiçek deseni süper çözünürlük ayrıntı düzeylerinin bir göste...

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir.Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun birincil nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskobunun uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nanometrelik bir detaya ulaşan desenli bir ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.Ancak, süper çözünürlük düzeyinde analize izin vermenin anahtarı, satın alma sırasında kullanılan odacıklı kapaklar ve hedefin kırınım indeksi ile uyumlu montaj çözümleri gibi reaktiflerdir. Bir fare hipokampal birincil nöron elde etmek için, P1 P4 yavruhipokampi izole. Plaka hücreleri 70, kuyu başına 000 hücre kuyu başına 200 mikrolitre lik bir hacimde.Hipokampal primer nöronlar tamamen olgunlaştı kadar bekleyin 12 için 14 gün sonra ortak lokalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kaplama. Hızlı bir şekilde düzeltmek için nöronlar için iyi pbs 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit, PFA, ekleyin. Çözeltiyi çıkarın ve numuneleri %1 büyükbaş serum albumini olan BSA ile, PBS'de 200 mikrolitre de oda sıcaklığında bir saat boyunca, analiz için alakasız bir proteinle plakanın serbest ciltli tüm yüzeylerini pasif olarak kaplayın.Triton X-100 olmadan BSA tabanlı engelleme tamponu, %0,2 Triton X-100 ile aynı tampondan daha verimli bir şekilde antikor arka planını azaltır. Birincil antikor ekleyin. Negatif kontrol olarak, kuyulardan birine herhangi bir birincil antikor eklemeyin.Sim uyumlu bir montaj antonu kullanarak hücreleri monte edin, örneğin ProLong Glass Antifade Mountant. Kapak ve bir coverglass ile hücreleri korumak, örneğin, sekiz milimetre çapında yuvarlak bir coverglass.Kare olanlar da kullanılabilir. Odacıklı kapakları oda sıcaklığında saklayın ve görüntü elde etmeden önce en az 48 saat bekleyin. Elmas cam süper çözünürlüklü satın almadan önce kür en az iki gün gerektirir.Antikor özgüllüğünü sağlamak için iki strateji kullanın. Bunlardan ilki, aynı substratı hedefleyen en az iki farklı antikor kullanımıdır. İkinci strateji saflaştırılmış protein hedefi ile kuluçka ile antikor nötralizasyon, ya da antikor yükseltmek için kullanılan.Analizlerimiz için Nikon tarafından üretilen N-SIM süper çözünürlüklü bir mikroskobu rutin olarak kullanıyoruz. İzleyen talimatlar, sim görüntülerin mikroskobundan bağımsız olarak elde edilmesi için tasarlanmıştır. Ayrıca, düzeltme halkası, lazer hizalama ve ızgara blok odaklama dahil olmak üzere cihazların doğru bir kalibrasyon gerçekleştirmek için mikroskop performansını en üst düzeye çıkarmak için önemlidir.SIM görüntülerin edinilmesinden önce, sistem belirli alt çözünürlüklü boyutta floresan boncuklar ile uygun bir kalibrasyon gerektirir. Buna bir örnek TetraSpeck mikrokürelerdir. Bu boncuklar farklı floresan boyalar ile tek bir örnek ile farklı lazerlerin kalibrasyonu sağlamak için boyanmıştır.Bir su banyosunda, 10 dakika boyunca 8 floresan mikrosferler için 1.8 kat 10 civarında sonicate. Floresan mikrosferleri 500'de bir oranında çift distile suda seyreltin. Ek bir 10 dakika için ikinci kez Sonicate.Pipet 15 mikrolitre seyreltilmiş boncuklar odalı bir kapak kuyusu içine. Çözelti oda sıcaklığında beş dakika kurutulalım. Montaj çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin, örneğin.ProLong Glass ve üstüne sekiz milimetrelik bir kapak kaydırın. Uygun bir kür izin vermek için en az 48 saat bekleyin. Mikroskobu ve lazerleri açın.Tüm mikroskop bileşenlerinin termal dengesine ulaşmak için sistemin ısınmasına izin verin ve SIM süper çözünürlüklü mikroskop sistemi en az üç saat gerektirir. 100X hedefini seçin. Lazerleri kırınım ızgara bloğunun ortasına hizalayarak kalibrasyonu başlatın.N-SIM sisteminde, bir mikrometre knob ve özel bir kamera, ışık demetlerinin hedefe ortalanmasına olanak sağlar. Görüntülemek için mikroskobun odacıklı kapak fişini takın. Objektif düzeltme kapağını ayarlayarak sistemi odalı kapak kalınlığına ayarlayın.N-SIM süper çözünürlüklü mikroskop sistemleri ile sağlanan tescilli yazılım Olan NIS Software, renklerin düzeltilmesini düzenleyen otomatik bir fonksiyona sahiptir. Numune üzerinde odaklanmış yapılandırılmış desen aydınlatması sağlamak için her kanal için ızgara bloğu odağı ayarlayın. Yazılım bu görev için otomatik bir işlev sağlar.Çok renkli mikrokürelerin ham 3D SIM görüntülerini edinin. Her ayrı dalga boyu için süper çözülmüş görüntünün Fourier dönüşümünü hesaplayın. Dönüştürülmüş görüntü doğru çiçek benzeri bir desen elde edemezse, süper çözünürlük elde edilmediğından kalibrasyonu yeniden başlatın.Süper çözümlü görüntüde, elde edilen çözünürlüğü ölçmek için tek bir mikrosfer seçin ve her kanal için yoğunluk profilini hesaplayın. Şimdi yanal olarak 100 nanometreye yakın olmalıdır. Mikrokürelerin çok kanallı bir edinimi kaplayarak kanal kaydı gerçekleştirin.Amaç, tüm kanal sinyallerini yanal ve eksenli olarak harmanlamaktır. Bu, farklı kanalların yanlış hizalanması nedeniyle renk sapmalarını ortadan kaldırır ve birlikte yerelleştirme analizine yardımcı olur. Açık kaynak uygulaması ImageJ için bir eklenti paketi olan SIMcheck'in aydınlatma fazı adımı ve aydınlatma desenli odağı işlevlerini kullanarak kalibrasyon kalitesini onaylayın.Confocal veya widefield modunda 40X hedefi kullanarak örnek analiz başlayın. Bu, iyi ayrıntı ve geniş bir görüş alanı koruyarak, örneğin gezinme sağlar. Nöronal süreçleri temsil eden bir alanı tespit etmek için MAP2 antikor sinyalini kullanın.Boyama kalitesini belirlemek için numunenin konfokal modda görüntülerini edinin. Hedef 100X'e geçin. 100X hedefine yağ uygulayın.Süper çözümlenmiş görüntünün kalitesini değerlendirmek için daha sonra kullanılacak geniş alan veya konfokal görüntü elde edin. 3B SIM moduna geçin. Edinme parametrelerini ayarlamak için diyalog pencerelerini kullanarak, renk bilgilerini en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilen en yüksek bit derinliği ayarını seçin.Genellikle, 16 bit standart seçimdir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranını artırmak için, bir megahertz gibi satın alma için düşük frekanslı bir değer seçin. Histogram pencereleri kullanarak, bilgi kaybını önlemek için doğrusal bir sinyal yanıtı elde etmek için lazer gücü ayarlayın, görüntülerdeki doymuş pikselleri sınırlayın.N-SIM sistemi Andor iXon3 kamera kullanır. 16 bit'te çalışırken, kameranın doğrusal tepkisini sağlamak için 16.000 hedef yoğunluğu nu seçin. Alternatif olarak, satın almaların dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için 30,000 ile 45, 000 arasında bir aralık seçin.Lazer gücünü, numuneleri görüntülerken %0,1 ile %50 arasında, pozlama sürelerini ise 50 milisaniye ile iki saniye arasında ayarlayın. %50'nin üzerindeki lazer güçleri, kullanımdaki floroforların hızlı fotobeyazrlanmasına neden olabilir. Görüntüleri 3B SIM modunda edinmeye başlayın.Raw görüntülerin satın alma kalitesini değerlendirmek için ImageJ için ücretsiz eklentiler paketi olan SIMcheck'i kullanın. SIMcheck herhangi bir yapı veya kalite sorunu algılamazsa, istatistiksel analize olanak sağlamak için tam teknik kopyalardan en az 10 görüntü elde edin. Edinilen görüntüler, daha fazla analiz için kullanılacak yeniden oluşturulmuş SIM görüntüleri elde etmek için işlenmesi gereken ham verilerdir.Protokolde sinapsin ve PSD-95'i sinaptik belirteçler öncesi ve sonrası olarak kullanmanızı öneririz. Ancak, ek işaretçiler kullanılabilir. Literatür büyük bir vücut sinaptik belirteçleri olarak drebrin ve fagot gibi diğer proteinlerin kullanımını destekler.3D SIM edinilmiş görüntüler, yeniden oluşturulmuş süper çözümlü görüntüler elde etmek için işlenmesi gereken ham görüntülerdir. Ham görüntülerin yanlış yeniden yapılandırılması, örneklerin analizini etkileyecek yapılara yol açabilir. Bu nedenle rekonstrüksiyon parametrelerinin doğru şekilde seçilmesi için büyük dikkat edilmelidir.Süper çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için mikroskop rekonstrüksiyon analiz yazılımını kullanarak ham görüntüleri işleyin. Alternatif olarak, ham görüntüleri yeniden oluşturmak için serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentifairSIM kullanın. Mikroskop rekonstrüksiyon yazılımı veya ImageJ eklentisi SIMcheck kullanarak süper çözülmüş görüntülerin Fourier dönüşümünü hesaplayın.İyi bir yeniden oluşturulmuş görüntü, her kanal için, bir çiçek gibi görüntü dönmek gerekir. Yeniden yapılandırılan görüntüler çiçek benzeri bir şekli yeniden oluşturamazsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve doğrusal filtreleme, apodization ve sıfır sıra bastırma gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek bunları yeniden oluşturun. Parametrelerin değiştirilmesinin son çözümlenmiş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanan NIS Yazılımında, parametrenin aydınlatma modülasyonu kontrastını, yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma sını ve odak bastırma dışı karşılaştırmasını değiştirin.Süper çözümlü görüntülerin kalitesini değerlendirmek için ImageJ tabanlı bir eklenti olan NanoJ-SQUIRREL'i kullanarak yapıları tarafsız bir şekilde algılamak için yeniden oluşturulmuş görüntüyü analiz edin. Ortak yerelleştirme analizimizde iki yaklaşım kullandık. İlki, tek bir birlikte yerelleştirme olaylarını gösteren ve her kanalın katkısını tanımlayan profil analizine dayalı görsel bir yaklaşımdır.Sinaptik belirteçler ve ilgi proteini arasındaki birlikte lokalizasyonu incelemek için ilk adım olarak, süper çözümlenmiş bir görüntü alın ve sinyal çakışmasını belirlemek için tek bir lokus analiz edin. Süper çözümlenmiş görüntüde tek bir locus tanımlayın. Floresan sinyallerin yoğunluk profillerini ilgi çekisine alın.Profil analizi tek lokus eş lokalizasyonu önermişse, Pearson ve Mander'in katsayıları hesaplanarak tüm görüntünün daha genel bir analizi yapılabilir. Co-localizasyon, Pearson ve Mander's iki parametre belirlemek için JACoP, bir ImageJ eklentisi kullanın. Sistemi kalibre ettikten ve yeniden yapılandırılan görüntülerin kalitesini değerlendirdikten sonra MAP2, nöronal belirteç, psd-95, postsinaptik belirteç ve hedef protein SUMO1'e karşı antikor ile boyanmış primer nöronal kültürleri analiz etmeye başladık.İlk olarak 40X hedefiyle dört kanallı konfokal mikroskopi yapılan numuneyi analiz ettik. Nöronal süreçleri temsil eden bir alan seçtikten sonra, 100X hedefine geçtik. NanoJ-SINCAP ile yeniden yapılanma kalitesini değerlendirmek ve ortak yerelleştirme analizi yapmak için aynı alanın hem konfokal hem de SIM görüntülerini elde ettik.Sinapsın yapısını ve bileşiminin aydınlatılması, hafıza yı ve bilişi düzenleyen hem fizyolojik hem de patolojik süreçlerin anlaşılması açısından çok önemlidir. Normal durumda sinapslar bellek yapı taşları iken, onlar da karmaşık nörolojik bozuklukların temelinde, demans Alzheimer hastalığının en yaygın formlarından biri gibi. Burada açıklanan protokol, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu adı verilen süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile sinapsların protein bileşiminin incelenmesine olanak sağlamaktadır.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Bu rapor gösteriyor bağlı presinaptik BOUTONS istinat bireysel canlı nöronların mekanik izolasyon için kullanılan bir tekniktir. Vibrodissociated nöronlar, hızlı üretim, mükemmel farmakolojik kontrolü ve komşu hücrelerden etkisi olmadan gelişmiş uzay-klemp avantajlara sahip. Bu yöntem, sinaptik elemanları ve yama klemp kayıt görüntüleme için kullanılabilir.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Öğrenin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobisi kullanarak primer nöronlarda proteinlerin ve sinaptik belirteçlerin eş lokalizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem, yaklaşık 100 nanometre çözünürlükte sinaptik protein etkileşimlerini çalışmanıza olanak tanır.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Daha fazla video keşfet