Name: Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, yetişkin insan beyin dokusundan primer mikroglia izolasyonu için bu sağlam protokolü. Trypsin EDTA ve immünositokimya kullanarak yüksek verimli hücre elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ'nin laboratuvarı IITJ'nin kurumsal hibeleri ile kurulmuş olup, Biyoteknoloji Bakanlığı (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ve Hindistan Elektronik ve Bilgi Teknolojileri Bakanlığı (No.4(16)/2019-ITEA) tarafından finanse edilmektedir. İnsan beyin dokusu bölümleri Kurumsal Etik Komitesi izni sonra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur elde edildi. Biz Mayank Rathor, Tasarım ve Sanat Derneği IIT Jodhpur B.Tech Öğrenci üyesi, videografi desteği için teşekkür ederiz.

Tüm dokular, Indian Institute of Technology Jodhpur ve All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur'un etik komitelerinden etik izin aldıktan sonra edinilmiştir.
1.Doku edinimi ve işlenmesi (Gün 0)
<ol><li>10 mL buz gibi suni beyin omurilik sıvısı (aCSF) (2 mM CaCl2,2H2O, 10 mM glikoz, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,2,5 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2°6H2O, 202 mM sucrose)içeren 50mL tüpte dokuyu toplayın 20 . Doku farklı bir yere transfer edilmesi gerekiyorsa tüp buz üzerinde tutulur emin olun. NOT: Otoklavlı distile suda aCSF hazırlayın. Laminar kaputta 0,22 μm şırınga filtresi ile filtreleyin. Bu 4 °C'de 1 ay saklanabilir.</li>
	<li>Toplama tüpünü %70 alkolle dikkatlice silin ve aseptik laminar hava akış odasına aktarın.</li>
	<li>ACSF'yi dikkatlice atın ve aseptik durumda dokuyu tarttı. Doku ağırlığı sonraki adımlar için gerekli tripsin-EDTA hacmini hesaplamak için gereklidir.</li>
	<li>37 °C'de 5 dakika taze sıcak aCSF doku tutun. Bu adım hücre ölümü önlemek için önemlidir.</li>
	<li>37 °C'de 1x PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir kez aCSF atın ve doku yıkayın. Tüm kanın tekrarlanan PBS yıkıntıları (gerektiği gibi) ile yıkandığından emin olun.</li>
	<li>5 dakika boyunca, 37 °C sıcak PBS doku kuluçka.</li>
	<li>PBS'yi dikkatlice atın ve sterilize edilmiş petri kabına doku aktarın. PBS bir pipet ile kaldırılabilir. Bu herhangi bir doku kaybını önleyecektir.</li>
	<li>Steril bir neşter kullanarak dokuyu küçük (en az 1 mm3)parçalara ayırın. İnce doğranmış doku, tripsin-EDTA ile daha yüksek verim sağlayarak doku ayrışması için daha yüksek doku yüzey alanı sağlar.</li>
	<li>Doğranmış dokuyu %0,25 tripsin-EDTA içeren 10 mL/g doku içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL serolojik pipet ile boru ile karıştırın. Petri kabına 2 mL tripsin/EDTA ekleyin ve pipet yardımıyla tabağı iyice yıkayın. Bu tripsini şahin tüpüne geri ekle. Bu doğrama sırasında doku ve hücre kaybını en aza indirir.</li>
	<li>Tüpü 37 °C'de 250 rpm'de 30 dakika çalkalayın. Bu adım dokudan hücrelerin dissociation artırır.</li>
	<li>Kuluçka sonunda, tripsin nötralize etmek için 10 mL nötralize ortamı (%50 DMEM/%50 F12 glutamin, %1 penisilin-streptomisin, %10 FBS) ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile karıştırın. Eklenen nötralize ortam miktarı kullanılan trypsin miktarına eşit olmalıdır.</li>
	<li>Tüpü 2.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant atın ve kültür orta 1 mL pelet yeniden askıya (%50 DMEM/50% F12 glutamin ile, 1% penisilin-streptomisin, 20% L929 supernatant, 10% FBS). NOT: L929 hücreleri DMEM'de kültürdür (Glutaminli DMEM, %1 penisilin-streptomisin, %10 FBS). HÜCRE KÜLTÜRÜ için ATCC önerilen kültür yöntemi takip edilmelidir. Supernatant en az% 75 confluent olan kültür şişesi toplanmalıdır. Büyüme faktörlerinin bozulmasını önlemek için toplu olarak toplanabilir ve -80 °C'de saklanabilir. Bu stok kültür ortamına ekleyerek yerine şişelerde ayrı ayrı L929 supernatant eklenmesi önerilir.</li>
	<li>Bir T-25 şişesi, yapışık hücreler için uygun hücreleri plaka ve ek kültür orta 4 mL ekleyin. Şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Dikkatlice homojen doku dağıtmak için şişe sallamak. Bu kontaminasyon şansını artırabilir gibi, titreme sırasında, şişenin boynuna medya getirerek kaçının.</li>
</ol>2.Hücre kültürü (Gün 2)
<ol><li>Her tüpte eşit hacimli ortam toplayarak, 1,5 mL'lik üç santrifüj tüpünde 0.gün hazırlanan T-25 kültür şişesinden ortam toplayın. Şişeyi 1 x PBS ile bir kez yıkayın. Sol herhangi bir kalıntı doku parçaları kaldırmak için yavaşça şişe çalkalayın. Herhangi bir kalıntı parçaları kültürü olumsuz etkilemez gibi şişe sert sallayarak kaçının. Şişeye 5 mL taze kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Toplanan ortamları 4 °C'de 1.466 x g (4000 rpm) 4 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Her tüpten supernatant atın ve tüplerbirine kültür orta 1 mL ekleyin. Pipet ile iyice karıştırın. Seri diğer tüplere hücreleri ile karışık ortam ekleyin. Pipet ile iyice karıştırın ve bir tüp içinde hücreleri havuz.</li>
	<li>Hücreleri yapışık hücreler için uygun ayrı bir T-25 şişesine koyun. 4 mL kültür ortamı ekleyin ve şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de inkübedin.</li>
</ol>3.Hücre kültürü (Gün 4)
<ol><li>Her iki şişeden de ortam atın ve şişeye yeni 5 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Şişeyi 37 °C'de %5 CO2 ile 2 gün kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. Hücre Kültürü (Gün 6)
<ol><li>Hücreler daha fazla deney için hazır olacak.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikroglia normal beyinde homeostaz sağlamak ve çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezi rol oynamak4. Mikroglia nörogelişim ve sinaps oluşumuiçinmerkezi 2 . Mikroglial çalışmalar, çeşitli nörolojik hastalıkların gelişimi ve ilerlemesini anlamada önemli bir değer kanıtlamıştır4. Kemirgen mikroglia birincil mikroglial çalışmalar için tercih yaygın modeli olsa bile, kemirgen microglia önemli yönleriyle birincil insan mikroglia farklıdır<s...

Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar ve glial hücrelerden oluşan karmaşık bir ağ inşa edilmiştir1. Glial hücreler arasında, CNS doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak mikroglia fonksiyonu2,3. Microglia sağlıklı CNS4homeostaz korumak için sorumludur. Mikroglia da nörogelişim önemli bir rol oynamaktadır, sinaps budama tarafından2. Mikroglia dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezidir; Alzheimer hastalığı5, Parkinson hastalığı6, inme7, multipl skleroz8, travmatik beyin hasarı9, nöropatik ağrı10, omurilik yaralanması11 ve gliomas gibi beyin tümörleri12.
CNS homeostaz ve hastalıklar ile ilgili çalışmalar maliyet etkin ve zaman etkin insan birincil mikroglia izolasyon protokolleri13bir eksikliği nedeniyle kemirgen microglia kullanır. Kemirgen mikroglia Iba-1, PU.1, DAP12 ve M-CSF reseptörü gibi genlerin ekspresyonunda birincil insan mikroglia benzer ve normal yanı sıra hastalıklı beyin13anlamada etkili olmuştur. İlginçtir, TLR4, MHC II, Siglec-11 ve Siglec-3 gibi birçok bağışıklık ilişkili genlerin ekspresyonu insan ve kemirgen microglia13arasında değişir. Çeşitli genlerin ekspresyonu da zamansal ekspresyon ve her iki türde nörodejeneratif hastalıklarda değişir14,15. Bu önemli farklılıklar insan mikroglia homeostaz ve hastalık mikroglia fonksiyonu çalışma için gerekli bir model olun. Birincil insan mikroglia da potansiyel ilaç adaylarının preklinik tarama için etkili bir araç olabilir16. Yukarıda belirtilen nedenler birincil insan mikroglia izolasyonu için maliyet etkin protokoller için artan ihtiyaç altını çizmektedir.
Tümör rezeksiyonları veya diğer cerrahi rezeksiyonlar için oluşturulan cerrahi pencere sonucunda toplanan erişkin insan beyin dokusundan birincil insan mikrogliasının izolasyonu için bir protokol geliştirdik. Buradaki yöntem mevcut yöntemlerden oldukça farklıdır. Doku toplama alanından laboratuvarda izolasyon protokolüne başlamak için yaklaşık 75 dakikalık bir geçiş süresinden sonra mikrogliayı izole etmeyi ve kültürü kültürü eleyebildik. Biz izole mikroglia büyümesini teşvik etmek için L929 fibroblast hücrelerinin supernatant kullandık. Bu yöntem özellikle sadece birincil mikroglia nın kültürü ve gelişimine odaklanır. Ortaya çıkan kültür yaklaşık% 80 microglia olduğunu. Diğer protokoller yoğunluk gradyan santrifüj, akış sitometri ve manyetik boncuklar tarafından mikroglia zenginleştirilmiş bir kültür sağlarken, protokol kültür birincil insan microglia17,18,,19,20hızlı, basit, sağlam ve maliyet etkin bir yoldur. Kadavralardan sabit beyin dokuları yerine cerrahi olarak çıkarılan canlı beyin dokusunu kullanabilme yeteneği mevcut prosedürlerin aksine bu yöntemin ek bir avantajını kanıtlıyor18,21.

<table><tbody><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik çözelti</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (4 &deg; C)</td> <td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Yeni Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin Himedia</td><td></td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>ile DMEM ortamı Fetal sığır serumu</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Flacon tüp (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Ricinus communis aglütininin-1</td><td>Vektör</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr> ile Fluoroshield <tr><td>İnkübatör çalkalayıcı</td><td>Yeni Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>NCTC klonu 929 [L hücresi, L-929, Suş L'nin türevi] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr> <tr><td>Laminer hava akışı</td><td>Thermo Fsiher Scientific &nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Monosodyum fosfat</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Besin Karışımı F-12 Jambon Orta</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Duran Grubu</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Himedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0.2&mu;, 25 mm çap)</td> <td>Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 doku kültürü şişeleri, yapışık hücre kültürü için uygundur.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>Gibco&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin İnsan beyin dokusundan İnsan mikroglia elde

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Mikroglia merkezi sinir sisteminin yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir (CNS). Microglia gelişim sırasında kritik bir rol oynar, homeostaz bakımında, ve enfeksiyon veya yaralanma sırasında. Birçok bağımsız araştırma grupları otoimmün hastalıklarda, otoinflamatuar sendromlarda ve kanserlerde mikroglianın oynadığı merkezi rolü vurgulamıştır. Bazı nörolojik hastalıklarda mikroglia aktivasyonu doğrudan patojenik süreçlere katılabilir. Primer mikroglia beyinde bağışıklık yanıtları anlamak için güçlü bir araçtır, hücre-hücre etkileşimleri ve hastalıkta disregulated mikroglia fenotipler. Primer mikroglia in vivo mikroglial özelliklerini ölümsüzleştirilmiş mikroglial hücre hatlarını daha iyi taklit. İnsan yetişkin mikroglia insan fetal ve kemirgen mikroglia ile karşılaştırıldığında farklı özellikleri sergiler. Bu protokol yetişkin insan beyninden birincil mikroglia izolasyon için etkili bir yöntem sağlar. Bu mikroglia çalışma dahil olmak üzere Mikroglia ve CNS diğer yerleşik hücresel popülasyonlar arasındaki hücre hücre etkileşimleri içine kritik anlayışlar sağlayabilir, oligodendrocytes, nöronlar ve astrositler. Ayrıca, farklı insan beyninden mikroglia kişiselleştirilmiş tıp ve terapötik uygulamalar sayısız için benzersiz bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için kültürlü olabilir.

Yukarıda bahsedilen protokolü kullanarak(Şekil 1),birincil insan mikrogliasını cerrahi olarak rezeke edilmiş canlı beyin dokularından izole etmeyi başardık. Kültürlü hücreler ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) mikroglia için lektin ile boyandı (yeşil) ve glial fibrillary asidik protein ile (GFAP) astrositler için (kırmızı) (Şekil 2) daha önce açıklandığı gibi22,23</...

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Protokolün genel amacı canlı yetişkin insan beyin dokularından birincil mikroglia hücreleri izole etmektir. Bizim durumumuzda ameliyat sırasında cerrahi pencere olarak toplanmıştır. Bu başlangıçta buz soğuk PBS beyin dokuları toplayarak gerçekleştirilir, doku sonra 1-mm küp küçük parçalar halinde doğranmış, ve ben sadece trippsin EDTA yardımıyla yaptım.Bunu takiben, hücreler santrifüj ile hasat edilir ve 48 saat boyunca androjen hücre kültürüne uygun bir şişe ye kaplanır. Hücreler bir kez daha şişeden hasat edilir ve daha fazla kullanıma kadar kültürlenir. Birincil insan mikroglia hücreleri artık immünositokimya kullanılarak karakterize edilebilir ve daha fazla deney için kullanılabilir.Yetişkin insan beyin dokularından mikroglia hücrelerini izole etmek için protokolümüzün en büyük avantajı, birincil yetişkin insan mikroglia hücrelerini çok uygun maliyetli bir şekilde etkin bir şekilde sağlamasıdır. Protokol sağlamdır ve varolan protokollerde kullanılan adım sayısını azaltarak hücre kaybını azaltır. 10 mL buz gibi aCSF içeren 50 mL'lik falcon tüpünde dokuyu toplayın.Toplama tüpünü %70 alkolle dikkatlice silin ve aseptik laminar hava akış odasına aktarın. ACSF'yi dikkatlice atın ve Falcon tüpündeki dokuyu tartının. Boş Falcon tüpünün ağırlığını hesaplayarak dokunun yaklaşık ağırlığını hesaplayın.37 santigrat derece sıcak taze aCSF. Beş dakika boyunca sıcak aCSF doku tutun. Bu adım hücre ölümü önlemek için önemlidir.aCSF'yi dikkatlice atın. Ve 1X PBS ile bir kez doku yıkayın 37 santigrat dereceye ısıtılır. Tüm kanın gerektiğinde tekrarlanan PBS yıkıntıları ile yıkandığından emin olun.5 dakika sıcak PBS doku kuluçka. PBS'nin yarısını dikkatlice atın. Kalan PBS ile birlikte dokuyu sterilize edilmiş petri kabına aktarın.Kalan PBS'yi 1 mL pipetle dikkatlice çıkarın. Bu doku kaybını önleyecektir. Steril bir neşter kullanarak en az 1 mm küp küçük parçalar halinde bu sorunu zar.Petri kabına %0,25 tripsin EDTA'dan 2 mL ekleyin ve pipet yardımıyla tabağı iyice yıkayın. Doğranmış dokuyu gram başına 10 mL ve %0.25 tripsin EDTA içeren 50 mL'lik falcon tüpüne aktarın. 10 mL serolojik pipet ile pipetleme ile karıştırın.37 santigrat derece ve 250 rpm hızda 30 dakika boyunca bir shaker üzerinde tüp kuluçka. Tripsin nötralize etmek için 10 mL nötralize ortamı ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile iyice karıştırın.Tüpü 2000G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve kültür orta 1 mL pelet resuspend. Hücreleri androjen hücreleri için uygun bir T25 şişesine yerleştirin ve 4 mL ek kültür ortamı ekleyin.Kültür ortamı %20 L929 supernatant ve %1 streptomisin içerecektir. Bu stok kültür ortamına ekleyerek yerine şişelerde ayrı ayrı L929 supernatant eklenmesi önerilir. Dokuyu homojen bir şekilde atmak için şişeyi bitirdik.Bu kontaminasyon şansını artırabilir gibi sallayarak şişenin boynuna medya getirerek kaçının. Şişeyi 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. T25 kültür şişesi santrifüj tüpler de gün 0 hazırlanan medya toplamak.Toplanan medyayı 1, 466G'de 4 derece santigrat derecede 4 dakika santrifüj edin. Toplanan ortam santrifüj edilirken, günü 1X PBS ile bir kez 0 şişeyı yıkayın. Sol herhangi bir kalıntı doku parçaları kaldırmak için yavaşça şişe çalkalayın.Herhangi bir kalıntı parçaları kültürü olumsuz etkilemez gibi şişe sert sallayarak kaçının. Şişeye 5 mL taze kültür ortamı ekleyin. Santrifüjlü tüplerden supernatant atın.Tüplerden birine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. Seri diğer tüplere hücreleri ile karışık ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri androjen hücreler için uygun ayrı bir T25 şişesine yatırın.Şişeye 4 mL taze kültür ortamı ekleyin. Her iki şişeyi de 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. Ortamı her iki şişeden atın ve yeni 5 mL kültür ortamı ekleyin.Şişeleri 37 santigrat derecede %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın. Altıncı gün, hücreler daha fazla deney için hazır olacak. Burada gösterilen görüntülerde.Bölümün ilk paneli A astrositleri GFAP ile boyanmış, yeşil renkli. İkinci panelde, rca ile bölüm A mikroglia leke, renkli yeşil. B mikroglia rca ile boyanmış bölümünde, hangi renk yeşil, ve astrositler GFAP ile boyanmış, renkli kırmızı.Görüntülerin yer kaplaması birlikte microglia ve astrositler gösterir. Resimlerden, kültürdeki hücrelerin çoğunun mikroglia olduğu açıktır. Görüntüler kör kontrol ile ölçüldü ve sonuç bölüm C.The sonuçlar hazırlanan kültür hücrelerinin yaklaşık% 80 mikroglia hücreleri olduğunu gösterdi temsil edilmektedir.Bu teknik yaklaşık bir buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben yetişkin insan beyin dokularından priming mikroglia nasıl seçebilirim iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, hangi daha fazla downstream deneyler için kullanılabilir.

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Video, yetişkin bir fare beyninin korteksinden mikroglia'yı izole etmek için bir tekniği göstermektedir. İlk olarak, korteks, mikroglia'yı koruyarak nöronları ve diğer glial hücreleri uzaklaştırmak için segmentasyon ve homojenizasyona uğrar. Bunu takiben, hücre süspansiyonu, anti-miyelin manyetik mikro boncuklara ve bir manyetik alana maruz bırakılır, bu da mikroglia ve miyeloid hücreleri miyelin kalıntılarından ve miyelin içeren hücrelerden etkili bir şekilde ayırır.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.

İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.

Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği

Öğrenin, yetişkin insan beyin dokusundan primer mikroglia izolasyonu için bu sağlam protokolü. Trypsin EDTA ve immünositokimya kullanarak yüksek verimli hücre elde edin.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Daha fazla video keşfet