Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Fare embriyonik kök hücresinin nöron hücrelerine farklılaşması protokolüne ek olarak, farklılaşma sürecini kapsamlı bir şekilde analiz edebilen bir dizi deney de gösteriyoruz. Bu teknikler, erken ektodermal embriyonik gelişim ile ilgilidir ve araştırmacılara nöron hücresi farklılaşmasını analiz etmek için seçenekler sunar. Bu prosedürü denerken, en uygun durumda kök hücrelerle başlamak çok önemlidir.

Bu nedenle, EB'lerin, MPC'lerin ve nöronların taze ve optimum ortamda kültürlenmesi önemlidir. Bu protokolün görsel gösterimi önemlidir, çünkü başarısını ve etkinliğini etkileyebilecek küçük ayrıntılar, özellikle de farklılaşma kısmı içerir. Asılı bir damla hücre kültürü kurarak başlayın.

10 santimetrelik bir hücre kültürü plakası için, konsantrasyonu 20 mikrolitre farklılaşma ortamı başına 500 hücreye ayarlayın. 50 adet 20 mikrolitrelik damlacık için yeterli hücre süspansiyonu hazırlayın. 20 mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlacıklarını bir doku kültürü plakasının kapağına yerleştirmek için bir mikro pipet veya tekrarlayıcı pipet kullanın ve damlacıkların birleşmelerini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun.

Plakayı beş ila 10 mililitre PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice plakaya geri koyun. Kültürü 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. İki gün sonra, damlacıkları kapaktan toplayın ve bunları 10 mililitre farklılaşma ortamı ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirin, ardından plakayı inkübatörde düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

İki gün sonra, hücreleri üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Embriyoid cisim farklılaşmasını nöral progenitör hücrelere indüklemek için, hücreleri beş mikromolar retinoik asit ile farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Plakayı iki gün boyunca inkübe edin, ardından plakayı eğerek ve pipetleyerek ortamın en az yarısını taze ortamla değiştirin.

Hücreleri iki gün sonra, üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyerek ve süpernatanı çıkararak toplayın. Embriyoid cisimciklerini ve nöral progenitör hücreleri PBS'de% 4 PFA ile oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin. Daha sonra PFA'yı çıkarın ve hücreleri PBS'de beş dakika boyunca yıkayın.

Hücreleri, 25 ila 28 santigrat derecede PBS 10, 20 ve% 30 sükroz çözeltilerinde seri olarak inkübe edin, her inkübasyon, hücreler tüpün dibine yerleşene kadar 30 dakika veya daha uzun sürer. Ve numuneyi bir Cryomold'un merkezine aktarmak için kullanın ve fazla sıvıyı pipetleyin. Numuneyi yeniden askıya almadan kalıba dikkatlice optimum kesme sıcaklığı veya OCT solüsyonu ekleyin, ardından fazla kabarcıkları bir pipetle çıkarın.

Numuneyle birlikte kalıbı 15 dakika boyunca düşük hızda bir laboratuvar karıştırıcısına yerleştirin, bu da embriyoid cisimciklerini ve nöral progenitör hücreleri OCT çözeltisinin dibine yerleştirecektir. Daha sonra kalıbı sıvı nitrojen içine yerleştirerek numuneyi hızlı bir şekilde dondurun. Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 10 normal eşek serumunda ve% 0.1 Triton X-100'de nöronları içeren OCT bölümlerini veya kültür odalarını bloke edin.

Daha sonra numuneleri, gece boyunca dört santigrat derecede% 5 normal eşek serumu ve% 0.05 Triton X-100 PBS'de seyreltilmiş birincil antikorda inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri PBS'de %0.1 Triton X-100 ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Bunları% 5 normal eşek serumu ve% 0.05 Triton X-100 içinde seyreltilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Triton X-100 ve PBS'deki yıkamaları tekrarlayın, ardından numuneyi mililitre başına bir mikrogram DAPI'de inkübe edin. Numuneyi bir kapak kayması ve bir miktar montaj ortamı ile monte edin, kurumasını bekleyin ve bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Nöron farklılaşmasını gerçekleştirmek için, E14 hücreleri, fibroblast popülasyonu seyreltilene kadar gama ile ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültürlendi.

E14 hücrelerinin pluripotentliği alkalen fosfataz boyaması ile doğrulandı. Farklılaşmadan sonra, embriyonik cisimler sürekli olarak artan yuvarlak bir şekle sahipti. 10. günde, nöronlara farklılaşan nöral progenitör hücreler, uzun bir hücre şekline sahipti.

İmmünofloresan deneyleri, sekizinci günde nöral progenitör hücreler üzerinde ve 12. günde nöronlar üzerinde yapıldı. Nöral progenitör hücrelerde yuvalanma ve nöronlarda nörofilament için pozitif boyanma gözlendi. Sox1 promotörü güdümlü GFP raportörünü eksprese eden bir fare embriyonik kök hücre hattı farklılaştırıldı ve embriyonik kök hücreler ve nöral progenitör hücreler üzerinde akış sitometrisi yapıldı.

NPC evresindeki toplam hücrelerin %58.7'sinin GFP pozitif, ESC evresindeki hücrelerin %0'ının GFP pozitif olduğu bulundu. E14 embriyonik kök hücreleri, embriyoid cisimleri ve nöral progenitör hücreler üzerinde RNA dizi deneyleri yapıldı. RNA dizisi ısı haritasındaki genler, ekspresyon seviyelerine göre sıralandı.

Dört gen kümesinin gen ontolojisi analizi, bunların farklı hücresel fonksiyonlara veya yollara karşılık geldiğini gösterdi. Bu protokolü gerçekleştirirken, EBS küresel, kararmış hücre kütleleri olarak görünmelidir. EBS'nin bu şekilde büyümesini sağlamak için, ortam sarımsı olmaya başlarsa, ortamı ilk gün değiştirin.

Aynı yaklaşım MPC kültürü için de önemlidir, çünkü hem EB'ler hem de MPC'ler erken embriyonik gelişimin kritik bir aşamasındadır. Nöron farklılaşmasının farklı aşamalarından ChIPseek ve kromatin doğrulama yakalama testleri gibi diğer fonksiyonel genomik tahliller, altta yatan biyolojik süreçleri anlamak için gerçekleştirilebilir. Nöron farklılaşma sürecinde kimyasal ve fonksiyonel genomik tahlillerle entegrasyon, araştırmacıların erken embriyonik gelişimin moleküler mekanizmalarını daha iyi tanımlamasına olanak tanır.