Name: Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans'ın büyük ölçekli kültür yöntemini omik araştırmalar için. Bu teknik, milyonlarca solucan üreterek çoklu omik platformlarda karşılaştırmalı analizleri destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Edison Lab üyelerine bu makale hakkında yararlı tartışmalar ve geri bildirimler için teşekkür ederiz; Özellikle, B.M Garcia. Bazı suşlar NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC ve NSF Living Collections CSBR 1930382 tarafından finanse edilen CeNDR tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma NIH'den (U2CES030167) bir hibe ile desteklendi.

<ol><li>Félix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li>
<li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).</li>
<li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839(2017).</li>
<li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+%28BH4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li>
<li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li>
<li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li>
<li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUTI-1%3A+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117(2009).</li>
<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
<li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804(2011).</li>
<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
<li>Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li>
<li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html</a> (2020).</li>
<li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li>
<li>Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKevin%2C+S+%22C.+elegans.+Methods+in+Molecular+Biology%22">C. elegans. Methods in Molecular Biology</a>. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li>
<li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeNDR%2C+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li>
<li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

LSCP olarak çeşitli gemiler kullanılabilir. Bu protokolde standart bir cam fırın kabı kullanılmıştır. Kullanılan LSPC'ler 35,56 x 20,32 cm dış boyutlara, 27,94 x 17,78 cm iç boyutlara ve yaklaşık 4,45 cm derine sahipti ve takılı bir kapakla birlikte geldi. Böylece, burada kullanılan bakteri miktarı, büyük bir karma aşama solucan popülasyonu elde etmek için yukarıdaki boyutlara sahip bir LSCP için optimize edilmiştir. Bakteri hacmi ve konsantrasyonu deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde ayarlanabilir.
Küf, mantar veya diğer bakteri kaynakları tarafından kontaminasyon LSCP yönteminin herhangi bir adımında ortaya çıkabilir, bu nedenle numuneleri dikkatli bir şekilde kullanın. Protokolde herhangi bir adıma başlamadan önce, çalışma alanının% 70 etanol ve% 10 çamaşır suyu ile temizlendiğini sağlayın. Varsa, kullanılmış alanları 30 dakika boyunca UV ışığıyla tedavi edin ve her adımı başlatmadan önce 30 dakika önce hepa hava filtresini açın.
LSCP'yi kontrollü bir ortamda(yani20 °C'de ayarlanmış bir CT odasında) büyüterek, kullanıcı numunenin büyümesini daha kolay takip edebilir ve olası kontaminasyonu belgeleyebilir. LSCP'nin yüzeyi kirlenirse, mümkün olduğunda kontaminasyonu kesin ve kontaminasyonun kontrol edilmesi mümkün değilse numunenin büyümeye devam etmesine veya atılmasına izin verin. İstenmeyen büyümeyi azaltmak ve kaynaklar için solucanları geride kalmadığından emin olmak için kontaminasyonu hızlı bir şekilde ele almak zorunludur.
Bu yöntem, C. elegans'ınbüyük ölçekli karma nüfus kültürlerini büyütmek isteyenler içindir. LSCP'de, ticari olarak mevcut Petri yemeklerinde ve sıvı kültüründe olduğu gibi senkronize solucan popülasyonlarını büyütmek mümkün olsa da, yazarlar bu seçeneği test etmemişlerdir. Ayrıca, kullanıcılar belirli bir örnekte ortalama olarak yaklaşık 2,4 milyondan fazla solucan yetiştirmek istiyorlarsa, farklı bir yöntem önerilir4. Büyüme başarısı, boru hattında işlenen zorlanmaya bağlıdır. Yazarlar, yöntemin sağlam olduğunu gösteren 15 C. elegans suşunun en az beş biyolojik çoğaltmasında yaklaşık 2,4 milyon solucan popülasyonunu başarıyla büyütebildiler.
Deneye başlamadan önce, belirli bir solucanın yaşının ve sağlığının doğurganlığı ve sonraki nüfus artış süresini etkileyebileceğini unutmayın. Solucanların bu işlem hattında kullanılmadan önce en az stresle sağlıklı koşullarda muhafaza edildiklerinden emin olun. Zaman içinde genetik sürüklenmeyi azaltmak için stok örneklerinin oluşturulduğu, dondurulduğu ve -80 °C'de tutulduğu varsayılıyor.
Belirli bir deneyin ihtiyaçlarına bağlı olarak, LSCP'de gravid yetişkinlerin başlangıç sayısı değiştirilebilir. LSCP'deki başlangıç gravid yetişkinlerinin sayısını değiştirmek, büyüme hızını ve dolayısıyla hasat süresini değiştirecektir. Aşağıdaki nedenlerden dolayı her LSCP'nin tohumunu almak için beş gravid yetişkin kullanılır: (1) Birçok C. elegans suşunu LSCP'lere aynı anda tohumlamak için basit, hızlı ve verimli bir yol gerekiyordu ve (2) büyüme heterojenliğine yol açabilecek gravid yetişkinler arasındaki yaş farklarını azaltmak için.
Bu yöntem, kullanıcının tüm yaşam döngüsü aşamaları mevcut olan büyük solucan popülasyonlarını toplamasını sağlar. Mevcut yöntemlerle, büyük ölçekli C. elegans örneklerinin toplanması, aşağı akış çalışması için istenen solucan sayısını elde etmek için ağartıcı senkronizasyonu gerektirir. Bu yaklaşım göz önüne alındığında, artık çamaşır suyu senkronizasyonu ve çoklu elleçleme adımlarıyla ilgili zorluklar olmadan fermentörlerde veya büyük ölçekli sıvı kültürlerinde mümkün olduğunca çok solucan yetiştirilebilir. Protokolümüz, ilgi suşlarını verimli bir şekilde hedeflemeye, numunenin kendisini büyütmede minimum işlem süresini kullanmaya ve solucanların veya popülasyonun aşamalarını aşağı akış boru hatlarında gerektiği gibi izole etmeye izin verir.
LPFC, belirli bir LSCP'deki nüfus dağılımını ve boyutunu belgeleme aracı olarak kullanılmıştır. Kullanılan LPFC, solucanları boyutlarına (TOF) ve optik yoğunluğa göre analiz eden, sıralayan ve dağıtan sürekli bir akış sistemidir. Belirli bir solucan akış hücresinden geçerken, eksenel ışık kaybı dedektörü, bir solucanın geçmesi için gereken süre boyunca 488 nm-solid durum lazeri tarafından engellenen sinyal ışığı miktarını yakalar ve kullanıcıya solucanın TOF'sini ve optik yoğunluğunu verir. Floresan toplama optikleri ve dedektörleri, her numunede floresan hassasiyetini ve koleksiyonunu en üst düzeye çıkarmak için de kullanılabilir. LPFC toplama parametreleri enstrümana göre değişir. Kullanıcılar solucan boyutunu yakalamak için çeşitli platformlar kullanabilir ve bir LPFC yoksa bu protokolü kullanmakla sınırlı değildir.
Yazarlar, Sıvı Kromatografi – Kütle Spektrometresi, NMR spektroskopisi ve RNA dizilimi yoluyla C. elegans'ın çeşitli suşlarındaki bilinmeyen metabolitleri tanımlamak için burada açıklanan yöntemde yetiştirilen örnekleri kullanmaktadır. Yazarlar, bu boru hattı kullanılarak kolayca yeni ilgi suşları işlenebildiğinden, bu boru hattındaki örneklerin çeşitli C. elegans suşlarıyla büyümesi için bu yöntemi kullanmaya devam etmeyi planlıyorlar.

C. elegans, dünya çapında çeşitli doğal yaşam alanlarında bulunan küçük bir serbest yaşayan nematoddur1. Göreceli büyüme kolaylığı, hızlı üretim süresi, üreme sistemi ve şeffaf vücudu, onu gelişim biyolojisi, yaşlanma, nörobiyoloji ve genetik alanında yaygın olarak incelenmiş güçlü bir model organizma haline getirir2,3. C. elegans üzerindeki bol çalışma, fenotipleri karmaşık biyolojik bileşenlerle ve belirli bir organizmadaki ilişkileriyle kapsamlı bir şekilde ilişkilendirmek için -omics çalışmalarında kullanmayı birincil aday haline getirir.
C. elegans'ı işbirlikçi -omiks araştırmalarında kullanmak için, tek bir örneğin bölünebileceği ve karşılaştırmalı analizler için çeşitli platformlar ve araçlar arasında kullanılabileceği büyük karma aşama hayvan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır. Böyle bir örnek oluşturmak için bir boru hattı oluşturmak diyet, çevre, stres, nüfus yapısı ve numune işleme ve toplama konusunda keskin bir farkındalık gerektirir. Bu nedenle, standart ve tekrarlanabilir kült oluşturma koşullarının büyük ölçekli boru hatlarına entegre edilmiş olması çok önemlidir. C. elegans araştırmasında, solucanları kültüre etmek için iki geleneksel yöntem kullanılır - agar Petri yemekleri ve sıvı kültürü4.
Tarihsel olarak, büyük miktarlarda C. elegans gerektiğinde, sıvı kültüründe yetiştirilirler4. Sıvı kültüründe büyük bir solucan popülasyonu oluşturmada yer alan adımlar, genellikle gravid yetişkin manikürlerini yırtmak için beyazlatma senkronizasyonunu içeren ve istenen popülasyon büyüklüğüne ulaşmak için embriyoları serbest bırakan birden fazla işleme adımı gerektirir. Bununla birlikte, çamaşır suyu senkronizasyonu kullanıldığında, nüfus artışı nüfus sayımı büyüklüğüne bağlıdır ve bu nedenle sonraki büyüme ve nüfus sayılarını etkiler. Ek olarak, C. elegans suşları tiksel hassasiyetlerinde, maruz kalma sürelerinde ve çamaşır suyu senkronizasyonu için stres tepkilerinde değişiklik gösterir, bu da birçok suşu aynı anda test etmeyi zorlaştırır5,6,7,8,9.
Ek olarak, sıvı kültüründe solucan büyümesi birkaç transfer adımı gerektirir, çünkü hasattan önce sadece bir nesil solucan yetiştirilmesi önerilir, çünkü aşırı kalabalık birden fazla nesil için yetiştirilirse kolayca oluşabilir ve yiyeceklerin varlığına rağmen lahana oluşumuna yol açabilir10. Dauer oluşumu, genellikle "dauer feromonları" olarak adlandırılan ascarosides gibi küçük sinyal molekülleri yoluyla meydana gelir11,12,13,14, sıvı ortama salınır ve popülasyonun büyümesini etkiler. Ayrıca, sıvı kültüründe büyüyen büyük solucan popülasyonları, kültürde aşırı bakteri birikimine yol açarak, aşağı akış fenotipik tahliller için temiz bir örneğe ihtiyaç duyulduğunda zorluklar yaratır. Son olarak, bir sıvı kültürü kirlendiğinde, mantar sporları veya bakteri hücreleri medya boyunca kolayca dağıldığı için bakımı daha zordur15.
C. elegans yetiştirmenin diğer geleneksel yöntemi agar Petri tabaklarıdır. Piyasada bulunan Petri yemekleri, sıvı kültürlerinde görüldüğü gibi aşırı kalabalık ve yüksek lahana turşusu oluşumunun hızlı etkileri olmadan birden fazla nesil karışık aşama solucanı kolayca yetiştirmeye izin verir. Bununla birlikte, geleneksel agar Petri yemeklerinde solucan büyümesinin bir dezavantajı, piyasada bulunan en büyük Petri kabının, bir ağartıcı senkronizasyon adımı eklemeden bir -omics çalışması için büyük solucan popülasyonları sağlamamasıdır. Özetle, C. elegans'ın karışık aşama popülasyonlarını agar Petri tabaklarında kültleme yapmak - omics verilerini toplamak için daha uygundur, ancak sıvı kültleme olmadan çok büyük nüfus boyutları oluşturmak için bir yönteme ihtiyacımız vardı.
Burada, büyük ölçekli kültür plakalarında (LSCP) büyük karışık aşama C. elegans popülasyonlarını kültüre ve toplamaya yönelik bir yöntem sunuyoruz. Bu işlem hattı aracılığıyla numune toplamak, fenotipik ve popülasyon verilerini toplamak için yeterli örnek ve -omics deneyleri için gerekli tüm verileri(örneğin,genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik) verir. Buna ek olarak, LSCP yöntemi hayvanların minimum manipülasyonu, daha az kullanıcı hazırlık süresi gerektirir, sıkı çevresel kontrol sağlar ve her numunenin işlenmesinin genel tekrarlanabilirlik için çalışma boyunca tutarlı olmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>10 mL Steril Serolojik Pipetler</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10 UL pipet ucu</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>100 UL pipet uçu</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Dereceli Silindir</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>1000 UL pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik borular</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>190 Proof Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>2 L Geniş Boyunlu Erlenmeyer Matarası</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik borular</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>BVC Kontrol G Sıvı Aspirasyon Sistemi</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorox Çamaşır Seriştesi</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Konviron Kontrol Sıcaklık Odası</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Black, Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC ile İşlenmiş Mikroplaka</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Bilimsel Accuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düz Tabanlı 24 Kuyu Plakası</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Honeywell Gerçek HEPA Temizleyici 465 ft kare.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Ölçekli Kültür Plakası (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Kırmızı Kapaklı Pyrex 2-quart Cam Fırınlama Kabı</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Düz Slaytları</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Filtresi</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Cihazlar ImageXpress</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Model Numarası: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Yazarlar MetaXpress Yazılımı Sürüm 6.5.4.532 kullandılar</td></tr><tr><td>Nistatin (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabları (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Kontrolörü</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasssium Hidroksit</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Flürosans Mikrosferler</td><td>Çok bilimler</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Ansusuz</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Standart Gilson Pipet Seti</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin (100mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , yazarlar tarafından kullanıldı: Flow Pilot yazılım sürüm 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

büyük Ölçekli karma aşama caenorhabditis elegans popülasyonlarının kültürü ve tahlilleri

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) gelişim biyolojisi, yaşlanma, nörobiyoloji ve genetiği incelemek için değerli bir model organizma olmuştur ve olmaya devam etmektedir. C. elegans üzerindeki büyük çalışma gövdesi, karmaşık biyolojik bileşenleri ve başka bir organizmayla ilişkilerini parçalamak için büyük popülasyonlu, tam hayvan çalışmalarına entegre olmak için ideal bir adaydır. C. elegans'ı işbirlikçi -omiks araştırmalarında kullanmak için, karşılaştırmalı analizler için tek bir örneğin çeşitli platformlarda bölünebileceği ve tahlil edilebileceği büyük hayvan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır.
Burada, büyük ölçekli bir kültür plakasında (LSCP) bol miktarda karışık aşama C. elegans popülasyonu ve sonraki fenotipik verileri kültürlemek ve toplamak için bir yöntem sunulmuştur. Bu boru hattı, -omics deneyleri (genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik) için gerekli tüm verilerle birlikte fenotipik ve popülasyon verilerini toplamak için yeterli sayıda hayvan verir. Buna ek olarak, LSCP yöntemi hayvanların kendileri için minimum manipülasyon gerektirir, daha az kullanıcı hazırlama süresi sağlar, sıkı çevresel kontrol sağlar ve genel tekrarlanabilirlik için her numunenin işlenmesinin çalışma boyunca tutarlı olmasını sağlar. Son olarak, belirli bir LSCP'de C. elegans yaşam evrelerinin nüfus büyüklüğünü ve nüfus dağılımını belgeleme yöntemleri sunulmuştur.

C. eleganların LSCP yöntemini kullanarak büyümesi, 12,2 gün boyunca örnek başına ortalama 2,4 milyon karma aşama solucanı verir. LSCP yöntemini kullanan C. eleganların büyümesi, kullanıcıların hayvanların çok az elleçlenerek ve manipülasyonuyla büyük karma aşama C. elegan popülasyonları oluşturmalarını sağlar, bu da büyük ölçekli -omik çalışmaları için idealdir (Şekil 1). Bir LSCP yetişkin solucanlarla dolduğunda, büyük bir nüfus büyüklüğüne ulaştığında ve minimum bakteri kaldıktan sonra, kullanıcılar popülasyon boyutunu hasat edebilir ve tahmin edebilir. Bu nokta, popülasyonun bir -omics işlem hattında kullanmak için yeterli olup olmadığını değerlendirerek bir kalite kontrolü görevi de yapabilir (Şekil 2). Nüfus dinamikleri, türün kendisine, suşun davranışına(yani,yuvalama suşlarının daha düşük solucan iyileşmesine sahip olma eğiliminde olduğu) ve büyüme başarısına (yani kirlenmeye)bağlıdır. LSCP yöntemi, Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutantları ve Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) vahşi suşlarının bir karışımını içeren15C. elegans suşu üzerinde test edildi 25 . Gerinim genotipleri Ek Tablo 3'te açıklanmıştır.
LSCP yöntemi yaklaşık 94.500 ila 9.290.000 arasında nüfus büyüklüğü sağladı. Referans suşu, PD1074 ve suşlar arasındaki ortalama popülasyon büyüklüğü yaklaşık 2,4 milyon solucandı(Şekil 3). Ortalama 12,2 LSCP büyüme günü boyunca C. elegans suşları arasında tahmini nüfus büyüklüklerinde anlamlı bir fark bulunmadı (Şekil 4). PD1074 LSCP'lerin tam karma aşama popülasyona çıkması 10 - 14 gün arasında sürdü. PD1074 genelinde ortalama büyüme süresi 10 gündü. En yavaş büyüyen suş en fazla 20 gün, en hızlı büyüyen suş ise en az 10 gün büyüdü(Şekil 4).
Bu nedenle, bu LSCP yöntemini kullanarak, kullanıcılar yeni ilgi alanlarını gelişimsel zamanlama ve arka plan uzmanlığı hakkında çok az bilgiye sahip bir çalışmaya kolayca entegre edebilir. Toplama ile sürdürülmesi gereken, doğurganlık kusurları olan, heterozipöz olan veya büyüme kusurları olan suşların ve fenotiplerin bu işlem hattında iyi çalışmayabileceğini unutmayın.
Büyük parçacık akış sitometrisi ve örneklerin görüntülenmesi, kullanıcıların nüfus dağılımını belgelemelerini sağlar. Başarılı nüfus artışını ölçmek için çok çeşitli platformlar kullanılabilir.
Tekrarlanabilir -omik ölçümleri için tutarlı kültürler yetiştirmek önemlidir. Kültürün tekrarlanabilirlik ölçümleri solucan sayısı ve belirli bir suş için tutarlı bir boyut dağılımıdır. LPFC 23 ,26 ve mikro konfokal mikroskop görüntülerini büyüme başarısı için proxy olarak kullanarak orijinalN2Bristol suşunun bir çeşidiolanPD1074 referans suşu için örnek dağılımını gösteriyoruz. Solucanlar LPFC dağılımında L1 aşamasından gravid yetişkine kadar ölçüldüğünden (Şekil 5), sonraki görüntüleme (Şekil 6) ve örnekler arasındaki popülasyon dağılımındaki varyasyon (Şekil 7), bu boru hattının karışık aşama C. eleganspopülasyonu oluşturduğunu görebiliriz.
Karma aşama örneklerimizin nüfus dağılımına daha yakından bakmak için, tüm Uçuş Süresi (TOF)(yanivücut uzunluğu) dağılımı boyunca her bölgeye giren solucanların yüzdesine bakarak 35 PD1074 LSCP'nin dağılımına baktık (Şekil 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Şekil 1: LSCP solucan büyüme ardışık düzenine genel bakış. (A) Laboratuvarda alındıktan sonra, tüm suşlar hazırlandı ve -80 °C2'deuzun süreli depolama için donduruldu. (B) Dondurulmuş bir solucan stoğundan bir "ana öbek" plakası hazırlandı ve bir aydan uzun süre kullanılmamak üzere 15 °C'de saklandı. (C) Her örnek, LSCP'de büyümeden önce nesil stresini azaltmak için art arda dört öbekleme adımından geçti. ( D ) Adım(D)'deki "öbek 4" 6 cm plakadan 5 bireysel gravid yetişkin seçildi ve LSCP'nin beş belirli alanında ağartıldı. (E) LSCP Kontrollü Sıcaklık odasına yerleştirildi ve LSCP yetişkin solucanlarla dolu olana, büyük bir nüfus büyüklüğüne ulaşana ve minimum bakteri kalana kadar 20 ° C'de yetiştirildi. (F) Solucan popülasyonu hasat edildi ve aşağı akış adımları için toplandı. (G) Aliquots LSCP'den oluşturuldu ve aşağı akış istenen uygulamalar için flaş donduruldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Şekil 2: LSCP hasadına ve nüfus büyüklüğünü tahmin etmeye genel bakış. (A) 50 mL M9, solucanları NGMA yüzeyinden yıkamak için kullanıldı. Solucan süspansiyonu 50 mL konik bir tüpe pipetlendi. Adım (A) iki kez tekrarlandı. (B) 15 mL solucan süspansiyonu yeni bir 15 mL konik tüpe döküldü. Solucanlar santrifüjle topaklandı. M9 + enkaz rahatsız edici solucan pelet olmadan aspire edildi. Adım (B), 150 mL solucan süspansiyonunun tamamı toplanana kadar tekrarlandı. (C) Solucan peleti, kalan kalıntıları ortadan kaldırmak için M9 ile üç kez yıkandı ve santrifüjlendi. Örnek temizlendikten sonra, solucan peleti 10 mL ddH2O. (D) olarak yeniden yaratıldı Solucan popülasyon boyutunu tahmin etmek için numunenin seri seyreltilmesi oluşturuldu. Solucanların doğru sayılmasına izin veren seyreltme faktörleri kullanılmıştır. Kullanılan seyreltme faktörleri LSCP'nin popülasyon büyüklüğüne bağlı olarak değişti. (E) Seyreltme faktörleri seçildikten sonra, bu seyreltmenin üç aliquot tekrarından tüm solucanlar temiz bir slayta pipetlendi ve solucanlar bir diseksiyon mikroskobu altında sayıldı. (F) Örnek uygun büyüklükte aliquotlara bölündü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Şekil 3: Ortalama 2,4 milyon karma evre solucan popülasyonunda oluşturulan LSCP yöntemi. LSCP, en küçük nüfus artışlarında yaklaşık 94.500 ve en büyük nüfus artışlarında yaklaşık 9.290.000 nüfus büyüklüğüne sahiptir. Tüm suşlarda ortalama nüfus büyüklüğü 2,4 milyon solucandı. C. elegans strain adlarının altındaki çubuklar, bir suşunun CGC mutant mı yoksa CeNDR doğal izole mi olduğunu gösterir. Her gerinim için LSCP örnek boyutu görüntülenir. Tukey'in HSD Testi kullanılarak tüm çiftler için karşılaştırmalar yapıldı. C. elegans suşları (F(14.108) = 0.7, p = 0.77) genelinde tahmini nüfus büyüklükleri arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Renkli çubuklar, ilgili C. elegans gerinim gösterimi için standart renkli ekranları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Şekil 4: LSCP yöntemi 10 - 20 gün içinde büyük karma aşama solucan popülasyonları oluşturdu. Belirli bir C. elegans LSCP, örnek yetişkin solucanlarla dolu olana, büyük bir nüfus büyüklüğüne ulaşana ve minimum bakteri çimi kalana kadar büyüdü. LSCP'lerin zorlanmaya bağlı olarak tam bir karma aşama popülasyona büyümesi 10 ila 20 gün sürdü. Suşlar boyunca ortalama büyüme süresi 12.2 gün idi. Her gerinim için LSCP örnek boyutu görüntülenir. Her hata çubuğu ortalamadan 1 standart sapma kullanılarak oluşturulmuş. Aynı harfle bağlanmayan düzeyler önemli ölçüde farklıdır. Tukey'in HSD Testini kullanan tüm çiftler için karşılaştırmalar. C. elegans suşlarında (F(14.108) = 8.8, s < 0.0001*) LSCP'de ihtiyaç duyulan büyüme süresi miktarında önemli bir fark bulunmuştur. Renkli çubuklar, ilgili C. elegans gerinim gösterimi için standart renkli ekranları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Şekil 5: Vahşi tip referans suşunun karışık popülasyonu ve büyüme ölçümü, PD1074. Orijinal N2 Bristol suşunun bir varyantı olan vahşi tip referans suşunun bir LSCP büyümesinin temsili LPFC dağılımı (PD1074), karma aşama popülasyonunun boyut dağılımını ve olay sayılarını belgelemektedir. X ekseni, sıralanan solucanların uzunluğunu (Uçuş Süresi, TOF) görüntüler. y ekseni, sıralanmış solucanların optik yoğunluğunu (optik yok olma, EXT) görüntüler. Her veri noktası, örnekte belgelenmiş bir solucandır. Görüntü analizi için kullanılan her TOF bölgesi farklı bir renkte görüntülenir. 50 ila 2050 tof arasında değişen yirmi TOF bölgesi (R2 – R21) oluşturuldu. Her TOF bölgesiyle ilgili ayrıntılar Ek Tablo 1'de bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Şekil 6: R2 – R12 arasında değişen TOF bölgelerinden sıralanmış solucanların görüntüleri PD1074 LPFC dağılımını gösterir. R2 bölgesinde, L1 solucanları tanımlanabilir ve bölgede R9 ağırlıklı olarak gravid yetişkinler tanımlanır, bu da bize dağıtımda aşamaların beklendiği akış sitometresi dağılımı içinde yaklaşık bölgeler veren iki gelişimsel larva uçlarını kapsar. Ölçek çubuğu 1 mm'dir. Şekil 5'tegörüntülenen LPFC dağıtımından temsili görüntüler alınmıştır ve renkli kutular Şekil 5'tekibölgelere karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Şekil 7: Vahşi tip referans türü PD1074'teki uçuş zamanı (TOF) bölgeleri arasındaki nüfus dağılımı. Solucanların bulunduğu bölgeleri gösteren tüm TOF bölgesine solucanların dağılımı. Her PD1074 LSCP ayrı bir renk olarak temsil edilir. (A) X ekseni, LSCP için gözlemlenen ve sayılan yirmi TOF bölgesini (R2 – R21) gösterir ve tüm boyut dağılımını görüntüler. y ekseni, belirli bir TOF bölgesine düşen bir gövde boyutuna sahip belirli bir LSCP'den solucanların yüzdesini gösterir. (B) Solucan popülasyonunun daha küçük bir kısmı R7-R21 bölgeleri arasına düştüğü için, nüfus dağılımını görüntülemek için her bölgeye düşen solucanların yüzdesinin günlüğü alınmıştır. X ekseni R7-R21 TOF bölgelerini görüntüler. y ekseni, belirli bir TOF bölgesine düşen bir gövde boyutuna sahip belirli bir LSCP'den solucanların yüzdesinin günlüğünü görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: LSCP'nin yetiştirildiği ve işlenildiği büyüme koşullarının ortalama günlük sıcaklığı (°C). Kontrollü Sıcaklık (BT) odasının bildirilen sıcaklıkları, altı aylık numune büyüme ve toplama süresi boyunca belgelendi ve toplandı. Ortalama günlük sıcaklık burada bildirilmektedir. Proje süresince LCSP'nin büyüdüğü sıcaklık arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Tüm sıcaklık farkı, altı aylık numune büyüme ve üretim süresi boyunca 0,003 °C'den fazla değildi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 1: Solucanları görüntüleme için 384 kuyu plakasına sıralamak için kullanılan TOF kapılı bölgeler. Binned bölgeleri, 50 - 2050 yılları arasında tüm TOF dağıtımı boyunca 100'lük bir TOF'a yayılmak üzere oluşturulmuştur. Kapılı bölgeler ihtiyaçlarınıza göre değiştirilebilir ve optimize edilebilir. Görüntü analizi için kullanılan her TOF bölgesi farklı bir renkte görüntülenir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 2: TOF bölgelerinin 384 kuyu plaka şablonu ve çoğaltma düzeni. Her örnek görüntüleme için 384 kuyu plakasına göre sıralandı. Sıralama için seçilen her bölge için dört çoğaltma oluşturuldu. Kapılı bölgeler ihtiyaçlarınıza göre değiştirilebilir ve optimize edilebilir. Bu iletişim kuralında oluşturulan ve kullanılan belirli geçişli bölgeler için Tamamlayıcı Tablo 1'e bakın. Görüntü analizi için kullanılan her TOF bölgesi farklı bir renkte görüntülenir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 3: Bu protokolde kullanılan C. elegans suşları CGC ve CeNDR suşlarının bir karışımını içerir. Gerinim, genotip, gerinim kaynağı ve ayrıntılar bu tabloda açıklanmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Omiks araştırmalarında Caenorhabditis elegans (C. elegans)kullanmak için, karşılaştırmalı analizler için platformlar arasında tek bir numunenin ölçülebileceği büyük solucan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır. Burada, C. elegans popülasyonlarını büyük ölçekli kültür plakalarında (LSCP' ler) kültüre ve nüfus artışını belgelemek için bir yöntem sunulmuştur.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Bu teknik, minimum manipülasyonla birden fazla omik platformu için kullanılacak büyük ölçekli solucan popülasyonlarını toplamamızı sağlar. Bu teknik, her numunenin bütünsel bir resmini elde etmek için birden fazla omik deneyi boyunca karışık aşama C.elegans popülasyonlarını toplamamızı sağlar. Gravid yetişkinlerin büyük ölçekli kültür plakalarına lekeli ağartması için, bir Solucan topunun üzerine bir Bunsen brülörünün üzerine alevlendirin ve bakteri çimlerinin kenarından büyük ölçekli bir kültür tabağına taze E.coli almak için kazmayı kullanın.Spot ağartma için dördüncü parça plakasından tek bir gravid yetişkin seçin ve E.coli çimlerinden uzakta büyük ölçekli kültür plakasının bir köşesine beş mikrolitre taze hazırlanmış alkalin hipoklorit çözeltisi ekleyin. Gravid yetişkini alkali hipoklorit çözeltisine yerleştirin ve manisi bozmak ve yumurtaları serbest bırakmak için nematoda dokunun. Toplam beş yetişkin aynı şekilde E.coli çimlerinin etrafına eşit olarak yerleştirildiğinde, kapağı tekrar tabağa yerleştirin.Büyük ölçekli kültür plakalarından numune toplamak için, bir büyük ölçekli kültür plakası yüzeyine 50 mililitre M9 çözeltisi dökün ve M9'un tüm nematod büyüme ortamı agarose yüzeyini kapladığından emin olmak için plakayı döndürün. M9 ile steril bir serolojik pipet astarlayın ve plakayı, M9 ve solucan popülasyonunun plakanın bir köşesinde toplanması için eğin. Solucan süspansiyonu aspire etmek ve solucanları 50 mililitrelik konik bir tüpe eklemek için astarlı pipeti kullanın.Herhangi bir bakteri kümelerini ve döküntülerini bozmak için tüpü bir rocker üzerine yerleştirin. Solucanların tümü üç plakadan da toplandığında, her tüpten 15 mililitre solucanı üç 15 mililitre konik tüpün her birine aktarın ve solucanları santrifüjleme ile tüplere çökeltin. Solucan topaklarını bozmadan süpernatantları dikkatlice emiş ve her tüpe 13 mililitre solucan süspansiyonu ekleyin.Peletleri yeniden yıkamak ve mümkün olduğunca fazla bakteri ve döküntüsü yıkamak ve solucanları tekrar santrifüjlemek için tüpleri ters çevirin. Her solucan popülasyonu toplandığında, solucan topaklarını yıkama başına 10 mililitre taze M9 çözeltisinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, temizlenen her solucan peletini 10 mililitre çift damıtılmış suda yeniden ıslatın.Nüfus büyüklüğü tahmini için, her tüpten üç adet 100 mikrolitre solucan örneğini numune başına 900 mikrolitre M9 çözeltisinde hızla seyreltin ve seri seyreltmeler yapmak için aliquotları kullanın. Aliquotlar sayılırken kültürlerin sürekli hareketi için stok solucanı örnek süspansiyonlarını bir rocker üzerine yerleştirin ve solucan seyreltmelerini homojen olana kadar karıştırın. Cam mikroskop kaydırağına ilkinden 10 solucan örneğine beş mikrolitre çözelti ekleyin ve solucanları hafif mikroskopi ile sayın.Örnekte 50'den az solucan varsa, 1:100 ve 1:1, 000 seyreltmeleri sayın. 50'den fazla solucan varsa, bir sonraki seri seyreltmeye geçin. Her seyreltmenin her aliquot çoğaltmasını üç kez saydıktan sonra, solucanın tahmini popülasyon boyutunu belirlemek için ortalama seyreltme sayısı.Daha sonra solucan örneklerini uygun deneysel aliquotlara bölün ve numuneleri eksi 80 santigrat derece depolama için sıvı nitrojende dondurun. Büyük parçacık akış sitometrisi için bir solucan örneği hazırlamak için, dördüncü karışık aşama solucan aliquot'u 10 mililitrelik son bir M9 çözeltisi hacmine yaklaşık beş kez seyreltin ve solucan süspansiyonu için mililitre E.coli başına bir miligramdan 200 mikrolitre ve 0,5 mikromoler kırmızı floresan mikrokürez çözeltisinin 1:50 seyreltilmesini ekleyin. Sallanma ile oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, solucanları ve mikroküreleri santrifüjleme ile toplayın ve solucanları taze M9 çözeltisi ile iki kez yıkayarak fazla bakterileri ve ilgisiz mikroküreleri giderin.İkinci yıkamadan sonra, peletı beş mililitre M9 çözeltisinde yeniden kullanın. Pelet temiz görünüyorsa, solucanlara 50 milimoler sodyum azit ile desteklenmiş beş mililitre M9 ekleyin ve doğru sayım ve boyutlandırma için solucanları hem düzleştirmek hem de ötenazi yapmak için tüpü bir rocker üzerine yerleştirin. Nüfus dağılımı belgeleri için, kalibre edilmiş 384 kuyu plakası şablonunun açılışını açın ve şablonu, numunenin 20 çubuk bölgesinin her biri için her kapılı bölgenin dört teknik çoğaltmasını elde etmek üzere 20 kapılı nesneyi dört kuyuya dağıtacak şekilde ayarlayın.Büyük parçacık akışlı sitometreye 40 mililitrelik bir solucan örneği yükleyin ve numuneden kalibre edilmiş 384 kuyu plakasına nesnelerin yerleştirilmesini ve aynı anda dağıtılmasını önlemek için numuneyi sürekli karıştırırken numuneyi otomatik olarak sıralamaya başlayın. Numunenin tamamı sıralandıktan ve maksimum kapılı bölge sayısı 384 kuyu plakasına dağıtıldıktan sonra, numuneyi sitometreden çıkarın ve cihazı temizleyin. Büyük ölçekli kültür plakası yöntemi, Caenorhabditis Genetics Center mutantları ve Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource vahşi suşlarının bir karışımı da dahil olmak üzere 15 C.Elegans türü üzerinde test edildi.Bu analizde, büyük ölçekli kültür plakası yöntemi yaklaşık 94, 500 ila 9, 290,000 arasında nüfus büyüklüğü sağlamıştır. Referans suş PD1074 ve suşlar boyunca ortalama popülasyon büyüklüğü yaklaşık 2,4 milyon solucandı. Ortalama 12,2 büyük ölçekli kültür plakası büyüme günü boyunca C.elegans suşları arasındaki tahmini nüfus boyutlarında anlamlı bir fark bulunmadı.PD1074 büyük ölçekli kültür plakalarının ortalama 12,2 günlük büyüme süresi ile tam bir karma aşama popülasyona büyümesi 10 ila 14 gün sürdü. En yavaş büyüyen suş en fazla 20 gün, en hızlı büyüyen suş ise en az 10 gün büyüdü. PD1074 için bu örnek dağılımında, solucanlar L1 aşamasından gravid yetişkine kadar büyük bir parçacık akış sitometresi üzerinde ölçüldü.Daha sonra örnekler arasında popülasyon dağılımındaki varyasyonların görüntülenmesi ve görselleştirilmesi, boru hattının karışık bir C.elegan popülasyonu oluşturduğunu ortaya koydu. Solucanları örnek toplama boyunca doğru bir şekilde saymak önemlidir, böylece büyümeler ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilir veriler elde edersiniz. Bu toplama yaklaşımı, C.elegans popülasyonlarında meydana gelen karmaşık dinamikleri anlamamızı genişletmek için RNA dizileme, genomik ve diğer omik analizlerine uygulanabilir.Bu teknik, her numunenin bütünsel bir resmini elde etmek için birden fazla omik deneyi boyunca karışık aşamalı C.elegans popülasyonlarını toplamamızı sağlar.

culture-assay-large-scale-mixed-stage-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Sürekli kimyasalların Trans-ve çok jenerasyonel etkileri, çevre ve insan sağlığı üzerinde uzun vadeli sonuçlarını yargılamak için esastır. Ücretsiz yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak Trans-ve çok jenerasyonel etkileri incelemek için yeni ayrıntılı Yöntemler sağlıyoruz.

Toxicants Trans ve çok jenerasyonel etkileri okumak için Caenorhabditis elegans kullanma

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Burada sunulan, mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazlarda katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşım, bireysel hayvanların, aktivite, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi ve hayatta kalma dahil olmak üzere yaşlanma ve sağlıkla ilgili çeşitli fenotipler için yaşamları boyunca izlenmesini sağlar.

Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Öğrenin Caenorhabditis elegans'ın büyük ölçekli kültür yöntemini omik araştırmalar için. Bu teknik, milyonlarca solucan üreterek çoklu omik platformlarda karşılaştırmalı analizleri destekler.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Daha fazla video keşfet