Omurilik Yaralanmasını Takiben Faredeki İdrar Kesesinin Moleküler Analizi için Tek Hücreli Ayrışma Yaklaşımı

Bu protokol önemlidir, çünkü yüksek hücre canlılığına sahip tek hücreli bir süspansiyonun oluşturulmasını kolaylaştırmak için biyolojik bilgileri kullanır. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek hücre canlılığını ve izole hücre tiplerinin uygun bir temsilini koruyan tek hücreli süspansiyonlar üretme yeteneğidir. Cerrahi prosedürü göstermek, laboratuvarımdaki bir arkadaş olan Hüseyin Atta olacak.

Doku ayrışma prosedürünü gösteren Ali Hashemi ve FACS analizi Yaser Heshmati olacak. Anestezi uygulanmış yetişkin bir farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, torasik omurgadaki en belirgin spinöz süreci palpe edin. Ameliyattan önce analjezi ve antibiyotik uygulanır.

Farenin arkasında, boynun alt kısmından en belirgin dikenli sürecin hemen altına kadar ve orta hattın her iki yanında bir santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir dikdörtgen tıraş edin. Maruz kalan cildi, kesi bölgesinden başlayarak dışa doğru dairesel bir şekilde sıralı% 10 povidon iyot ve% 70 etanol mendillerle üç kez dezenfekte edin. Son silme işleminden sonra, fareyi cerrahi alanın üzerinde bir pencere bulunan steril dört x dört inçlik bir gazlı bez süngeri ile örtün.

Omurilik yaralanmasını indüklemek için önce sırtın ortasında 1,5 santimetrelik bir kesi yapın ve kasları dikenli süreçlerden ve T9, T10 ve T11 omurlarının laminalarından ayırmak için keskin künt diseksiyon kullanın. T10 spinöz işleminin bilateral laminektomisini gerçekleştirmeden önce interspinöz bağları T9 ve T10 ve T10 ve T11 arasında keskin bir şekilde bölmek için ince makas kullanın. Laminalar tamamen eksize edildiğinde, omuriliği kesmek için makası kullanın.

Yan sütunları tamamen kesmek için, ince makasın ucunu her iki taraftan nazikçe süpürün. Herhangi bir kanamayı sıkıştırmak için steril bir pamuk ucu uygulaması kullanın. Homeostazı sağladıktan sonra, cildi 7-0 poliglactin910 sürekli sütürlerle kapatın ve ameliyat sonrası dehidrasyonu önlemek için deri altına bir mililitre salin solüsyonu verin, ardından hayvanı tam yaslanana kadar izleme ile taze bir kafese geri koyun.

Her 12 saatte bir, hayvanı bir elinizle tutarak ve diğer elinizle alt karın bölgesine masaj yaparak, hayvan kendi başına idrar yapabilene kadar manuel mesane ifadesini uyarmak için şişmiş idrar kesesini bulmak ve hafifçe sıkıştırmak için işaret parmağını ve başparmağınızı kullanın. İlgilenilen mesane hücre tiplerinin aşağı akış analizi için, uygun deneysel zaman noktasında ve hayvan yeterince anestezi uygulandıktan sonra, pelvisten diyaframa bir orta hat laparotomisi yapın ve diyaframı kaburgalardan kesin. Sternuma paralel kemik kıkırdak sınırını takiben, diyaframdan başlayarak ilk kaburgaya doğru ilerleyerek hayvanın her iki yanındaki kaburgalar boyunca toraksı açın.

Ön torasik duvarı hayvanın kafasının üzerine sabitledikten sonra, perikardımı kesmek için ince makas kullanın ve perfüzyon aparatına 23 gauge bir iğne bağlayın. İğneyi sol ventriküle yerleştirin ve dokuyu delmeden iğneyi yavaşça aort içine ilerletin. İğne yerine oturduğunda, dokuyu dakikada 15 mililitre akış hızında PBS ile infüze etmeye başlayın ve sağ atriyumda hızlı bir şekilde küçük bir kesi yapmak için bir çift ince makasın uçlarını kullanın.

Drenaj berraklaştığında ve açık bir karaciğer rengi gözlendiğinde, perfüzyonu durdurun ve mesaneyi vasküler pediküllerden ve üretradan kurtarın, ardından mesaneyi buz gibi Tyrode solüsyonu içeren mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, tüm mesaneler toplandığında, 100 mikrolitre Tyrode çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü yırtın. Tartıldıktan sonra, mesaneleri 100 mikrolitre Tyrode çözeltisi içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında kıyın ve doku parçalarını mesane başına 2,5 mililitre sindirim tamponuna aktarmak için geniş delikli bir pipet ucu kullanın.

Dokuyu bir Nutator karıştırıcı üzerinde 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin ve ayrışmış hücreleri ve dokuları santrifüjleme ile toplamadan önce numuneyi bir dakika boyunca ezmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Peleti bir mililitre hücre ayırma solüsyonunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 dakika daha Nutator karıştırıcıya yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti bir mililitre kırmızı hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Bir dakika sonra, dokuz mililitre PBS ilavesiyle lizisi durdurun ve hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe süzün, ardından hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti FC bloğu ile desteklenmiş 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, ışıktan korunan buz üzerinde 20 dakika boyunca uygun hacimde florofor konjuge antikor ana karışımında yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre hücre boyama tamponu ile yıkayın ve peleti, beş mikrolitre FITC Annexin V ve bir mikrolitre propidyum iyodür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre taze hücre boyama tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Oda sıcaklığında 15 dakika bekletildikten sonra, hücrelere 400 mikrolitre Annexin bağlayıcı tampon ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, önce hücrelerin yan ve ileri saçılma parametrelerini ayarlamak için boyanmamış bir hücre örneği kullanın, ardından ölü hücreleri dışlamak için floresan emisyonunu 530 nanometrede ve 575 nanometreden daha büyük ölçün. İlk bozunmadaki negatif popülasyonu tanımlamak için her nokta lekesindeki ızgaraları kullanın ve negatif ve pozitif popülasyon ortamları hizalanana kadar spektral örtüşmeyi düzeltmek için floresan eksi bir kontrollerini kullanın.

Daha sonra, hücrelerin 100.000 olayını, ilgilenilen belirli belirteçlerle ölçün ve gerektiğinde ilgilenilen hücre popülasyonları için kapılar oluşturun. Tüm numuneler çalıştırıldığında, uygun akış sitometrik analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Kollajen 1A1, kollajen 3A1, kollajen 1A2 ve kollajen 6A1, fare mesanesinde en bol bulunan kollajen türleridir.

Kollajen bir, üç, altı ve hyaluronanın mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek için yapılan analiz, bu hücre dışı matris bileşenlerinin ekspresyonunun mezenkimal hücre popülasyonlarında ürotelyumdan daha yaygın olduğunu ortaya koymaktadır. Akış sitometrik analizi, birden fazla farklı enzimatik sindirim protokolünün oldukça canlı hücre popülasyonları verdiğini ve bu analizde kullanılan üçüncü sindirim protokolünün hücre korumasında en etkili olduğu belirlendiğini göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak, omurilik yaralanması olan farelerin mesanelerinden izole edilen toplam hücre sayısında, kontrol mesaneleriyle karşılaştırmak için önemli bir artış elde edilebilir.

Kontrollerle karşılaştırıldığında, omurilik yaralanması olan hayvanlardan alınan mesaneler de CD45 pozitif hücrelerde önemli bir artış göstermektedir. Adım 7.1, kardiyak popülasyonda tanımlama için önemlidir. Geçit stratejisi, ilgili hücreler tarafından bilgilendirilmelidir.

SCI hayvanlardan elde edilen mesaneler farklı hücre popülasyonuna sahiptir. Bu protokol, hücre sıralaması, birincil hücre kültürü, tek hücre dizilimi ve canlı tek hücreler gerektiren diğer molekül ve hücresel aşağı akış prosedürleri için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi gibi tek hücreli analiz teknikleri için kilit bir nokta olan yüksek canlılık ve dolayısıyla düşük hücre popülasyonu kaybı sağlar.