Name: Omurilik Yaralanmasını Takiben Faredeki İdrar Kesesinin Moleküler Analizi için Tek Hücreli Ayrışma Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Keşfedin, omurilik yaralanması sonrası fare idrar kesesinde tek hücreli ayırma yöntemiyle yüksek canlılıkta hücre süspansiyonu oluşturma tekniğini. Bu protokol, akış sitometrisi ile hücre popülasyonlarının moleküler analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 DK077195'ten R.M.A'ya, R01 DK104641'den R.M.A ve D.R.R..B'a) verilen hibelerle desteklendi. Hematoloji/Onkoloji Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Pediatri Bölümü, Harvard Tıp Fakültesi ve Dana-Farber Kanser Enstitüsü'nde Dr. Stuart Orkin'in değerli katkılarını kabul ediyoruz. Ayrıca Kyle Costa'nın farelerin ameliyat sonrası bakımında, Mary Taglienti ve Dr. Habiballah Shojaeisaadi'nin (Dr. Yang Shi Laboratuvarı, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi) teknik yardım ve yararlı tartışmalar için desteğini kabul ediyoruz.

<ol><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Urology%22%5BJournal%5D)">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24(2013).</li>
<li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+miRNA-regulated+networks%2C+hubs+of+signaling%2C+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I%3A+architecture%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Burada açıklanan fare omurilik yaralanması modeli, mesane kasılması ve dış üretral sfinkter gevşemesi arasındaki koordinasyon kaybı nedeniyle fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu da, ürotelial ve düz kas bölmelerinin genişlemesi ile karakterize edilen yaralanmadan 2 hafta sonra mesane duvarının derin tadilatını çağrıştırır. Kemirgenlerde SCI modelinin uygulanmasında kritik adımlar şunlardır: (i) yaralanmadan sonraki 10\u201214 gün boyunca ortaya çıkan omurga şoku döneminde manuel mesane ifadesine titizlikle dikkat etmek; (ii) kilo kaybını en aza indirmek için besin zenginleştirme; ve (iii) özellikle refleks geçersiz kılmanın geri dönüşünün ötesine geçen deneyler için idrar haşlama potansiyelinin azaltılması. Modelin sınırlamaları, geçici hematüri döneminde kan pıhtılarından farelerde üretral tıkanıklık potansiyelini ve ayrıca ameliyattan sonra retrograd boşalmayı takiben meni pıhtısından erkek farelerde bulunur.
Burada açıklanan doku ayrıştırma yaklaşımı, deneysel hakaretten kaynaklanan dokulardaki yapısal değişiklikleri göz önünde bulundurmanın önemini göstermektedir, bu durumda SCI'yı takiben aşağı akış analizlerini etkileyebilecek önemli doku tadilatı. Tek hücreli analizlerdeki artışla, gen ifadesinde gözlenen farklılıkların sadece ayrışmaya bağlı pertürbasyonların bir sonucu olmadığından, hastalık modeliyle ilgili temel biyolojik değişiklikleri gerçekten temsil ettiğinden emin olmak önemlidir. Herkese açık ifade verilerinin kullanımı, canlılığı en üst düzeye çıkarırken hücre dışı matrisin etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için sindirim tamponlarının formülasyonunu değiştirmemize izin sağladı. Gelecekteki uygulamalarda dikkate alınabilecek ek değişiklikler, ayrışma protokolüne duyarlı acil erken genlerin transkripsiyonunu durdurmak için aktinomycin D eklenmesini içerir15.
Pipetleme tekniği, dokuyu ayrıştırırken veya zaten süspansiyonda olan hücreleri aktarırken çok önemlidir. Kesme kuvvetlerinden hücrelere fiziksel hasarı azaltmak için, hücre resüspensiyonu sırasında yavaşça ve yavaşça pipet yapmak önemlidir. Genellikle geniş delikli pipet uçlarının kullanılması önerilir. Standart uçlar kullanıyorsanız, aksi takdirde hücrelere zarar verecek kesme kuvvetlerini önlemek için hücre süspansiyonlarını yavaşça pipetlamak özellikle önemlidir. Hücre süzgeçlerinin kullanılması bu protokolde kaçınılmazdır, ancak hücre konsantrasyonu 100 μL veya daha fazla hacim kaybı eşliğinde% 20 veya daha fazla azalabilir. Kesin bir hücre sayısı sağlamak için hücre konsantrasyonunun süzüldikten sonra belirlenmesini öneririz.
Akış sitometrisinde, FMO kontrolleri üst üste binen emisyon tepelerinden gelen sinyalin kanaması nedeniyle bir arka plan ölçüsü sağlar. Bunlar spesifik olmayan antikor bağlama veya bu kanala bir antikor dahil edildiğinde bulunabilecek arka plan boyama ölçüsü değildir. Spesifik olmayan antikor bağlamasını hesaba katmak için uygun izotip kontrollerini dahil etmek zorundadır; arka plan boyama için negatif kontroller dahil edilmesi gerekir. Birlikte ele alındığında, bu kontroller hücre popülasyonlarının doğru ölçümünü sağlar.

Normal idrar kesesi fonksiyonunun pertürbasyonları birçok birey için yaşam kalitesinin düşmesine neden olabilir. Yaralanmanın veya hastalığın normal mesane fonksiyonunu nasıl raydan çıkardığını daha iyi anlamak için, mesane içindeki hücrelerin normal biyolojik durumunu ve deneysel pertürbasyon altında nasıl değiştiklerini araştırmak önemlidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, idrar kesesi içinde bulunan spesifik hücre popülasyonları ve yaralanma ile nasıl değiştikleri eksik karakterize edilmiştir.
Akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi tek hücreli profil oluşturma yöntemleri mesane içindeki belirli hücre tiplerine ışık tutma potansiyeline sahiptir. Ancak bu yaklaşımların bilgilendirici doku olabilmesi için hasat edilen dokunun canlılığını, gen ekspresyonlarını ve temsili hücre popülasyon yüzdelerini etkilemeyecek şekilde sindirilmesi gerekmektedir. Enzimatik ayrışma kullanan protokoller, ayrımsız proteaz aktivitesi1aracılığıyla yüzey işaretleyici ekspresyonunu etkileyebilir, böylece akış sitometrisi ile hücre tanımlamasını etkileyebilir, ancak ayrışma sürecinin kendisi, van den Brink ve meslektaşları tarafından yakın zamanda açıklandığı gibi, hemen erken genlerin indüksiyona yol açabilir2. Yazarlar, ayrışma etkisindeki alt nüfus küçük olmasına rağmen, hemen erken genlerin yüksek ekspresyon seviyeleri nedeniyle toplu ifade çalışmalarında güçlü bir kontamine sinyali tetikleyebileceğini göstermiştir. Ek olarak, ayrışma protokolünün süresi, bazı alt nüfuslara özgü olduğu gösterilen genlerin algılanan toplu ekspresyon seviyelerini etkiledi. Bu nedenle, ayrışma protokolünün etkisi hesaba katmadan oluşturulan tek hücreli veri kümeleri, alttaki biyolojinin aksine, ayrışma yönteminden kaynaklanan gen ekspresyon değişiklikleri sağlayabilir. Bu gözlemler, yayınlanan tek hücreli transkriptomik verilerin dikkatle yorumlanıp sonuçların bağımsız yöntemlerle doğrulanmış olması gerektiğini göstermektedir.
Her ne kadar sert ve uzun ayrışma yöntemleri hücrelerde gen ekspresyonunu değiştirebilir2; hücrelerin etkili izolasyonu, mevcut hücre tiplerinin doğru temsilini elde etmek için gereklidir. Mesane birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık bir organ olduğundan, ürotelial veya stromal hücreler gibi bazı popülasyonlar nispeten az temsil edilebilirken, fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri hücre dışı matris içinde bulunur ve izole edilmesi zor olabilir. Mesane, omurilik yaralanması 3 ,4 veya mesane çıkış tıkanıklığı5,6'dagözlenen gibi önemli bir tadilat ve fibrozis geçirmişse, ayrışma daha da zorlaşır.
Burada, omurilik yaralı fare mesanesinde aşağı akış tek hücre analizi için optimize edilmiş bir doku ayrıştırma yöntemini açıklıyoruz. Akış sitometrisini kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu verme, hücre canlılığını destekleme ve hücre popülasyonlarının doğru oranını koruma yetenekleri için dört enzimatik sindirim protokolünü karşılaştırdık. Bu analize dayanarak, hücre ölümünü, hücresel agregaları, hücresel olmayan nükleik asitleri ve aşağı akış analizinin potansiyel inhibitörlerini en aza indirmenin yüksek kaliteli verilere ulaşmak için kritik öneme sahip olduğu sonucuna varıyoruz.

<table><tbody><tr><td>2.5 X Büyüteçli Büyüteçler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Vicryl sütür, 6.5mm iğne 3/8 daire</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 & mu; m Hücre Süzgeci</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BPBS'de Accutase, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Filtre Geniş Delikli Pipet Uçları (1000 ve mikro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Filtre Geniş Delikli Pipet Uçları (1000 & mikro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-fare CD326 (Ep-CAM), sıçan monoklonal, IgG2a, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Sıçan Anti-Fare CD45, sıçan monoklonal, IgG2b, &kappa;, Klon 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN Mikro Diseksiyon Forseps, Düz, 1x2 diş, 3.75" uzunluk, 0.3mm uç genişliği, 0.12mm dişler</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet ŞirketiInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Şirketi, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Mikro Dikiş İğnesi Tutucu, Kilitli, Düz, 5.75 "uzunluk</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Şirketi, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti, 30 çift odacıklı slayt, 60 sayım, tripan mavisi</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Boyama Tamponu</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum Sigma'dan Kollajenaz</td><td></td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip I</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Kollajenaz Tip III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip 6</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 & ile Ölü Hücre Apoptoz Kiti Propidyum İyodür (PI)</td> <td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksasin (Baytril)</td> <td>Bayer Health Care LLC,</td> <td>NADA # 140-913 FDA tarafından onaylanmıştır. Parti No.: AH01CGP</td><td>%2,27 Enjekte Edilebilir Çözelti</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) Antikor, sıçan monoklonal, IgG2a, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Koyun testislerinden Hyaluronidaz, Tip II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS Akıllı Tutucular (100 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Mikro Diseksiyon Yaylı Makası, Düz, 4 "uzunluk, 0.15mm uç genişliği</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Şirketi, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Şirketi, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloksikam</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy5 anti-fare CD19 Antikoru, sıçan monoklonal, IgG2a, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>PE / Cy5 anti-fare CD3 ve epsilon; Antikor, Ermeni hamsteri monoklonal, IgG, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-fare CD4 Antikor, sıçan monoklonal, IgG2b, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-fare CD8a Antikor, sıçan monoklonal, IgG2a, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-fare NK-1.1 Antikor, fare monoklonal, IgG2a, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-fare TER-119/Eritroid Hücreler Antikor, IgG2b, &kappa;, afinite saflaştırılmış</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Döküm Kanalı</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Fare BD Fc Bloğu), sıçan monoklonal, IgG2b, &kappa;, Klon 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lizis Tamponu (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı Kapaklı mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Üçlü antibiyotik merhem (neomisin / polimiksin B / basitrasin)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>cilt koruyucu</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), fenol kırmızısı</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin göz merhemi</td><td>Dechra Veteriner Ürünleri</td><td>NADA # 065-016. FDA tarafından onaylanmıştır.</td><td>Anestezi sırasında gözleri koruyun</td></tr></tbody></table>

omurilik yaralanmasını takiben faredeki İdrar kesesinin moleküler analizi için tek hücreli ayrışma yaklaşımı

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Detrusor-sfinkter disserjisi, fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı ve daha sonra mesane duvarı tadilatı yapmak için farelerde omurilik hasarının uygulanmasını tarif ediyoruz. Yaralanmamış kontrol ve omurilik yaralı farelerde mesane duvarının hücresel bileşiminin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için, yüksek hücre canlılığını destekleyen ve akış sitometrisi ile ayrık alt nüfusların tespitini sağlayan optimize edilmiş bir ayrışma protokolü geliştirdik.
Omurilik yaralanması torasik omuriliğin tamamen transeksiyonu ile oluşturulur. Doku hasadı sırasında, hayvan derin anestezi altında fosfat tamponlu salin ile perfüzyona edilir ve mesaneler Tyrode'un tamponuna toplanır. Dokular, halka açık gen ekspresyon veritabanlarının sorgulanmasıyla belirlenen fare mesanesinin kollajen içeriğine göre optimize edilmiş sindirim tamponunda inkübasyondan önce kıyılır. Tek hücreli süspansiyonun üretilmesinden sonra, malzeme hücre canlılığının, hücre sayısının ve spesifik alt nüfusların değerlendirilmesi için akış sitometrisi ile analiz edilir. Yöntemin% 90'dan fazla canlılığa sahip hücre popülasyonları ve mezenkimal ve epitel kökenli hücrelerin sağlam bir şekilde temsilini sağladığını gösteriyoruz. Bu yöntem, fare mesanesinde ve potansiyel olarak diğer organlarda ayrı hücre tiplerinin doğru aşağı akış analizini sağlayacaktır.

Cerrahi prosedür Torasik omurilik transeksiyonunun başarısı, en belirgin olanı hindlimb felci olan bir dizi parametrenin değerlendirilmesi ile belirlenir. Hayvan sadece ön ayaklarını kullanarak hareket eder, arka ayaklarını sürükler. Aksi takdirde, beslenme, tımar ve uyanıklık da dahil olmak üzere aktivite seviyeleri genellikle normaldir. Ek olarak, hayvanlar iradesel mesane kontrolünü kaybeder ve bu da yaralanmadan 10 ila 14 gün sonra refleks geçersiz kılma geri dönene kadar her 12 saat içinde araştırmacı tarafından manuel mesane ifadesine ihtiyaç duyar. Ötenazi sonrasında, yaralanmanın başarısının ek belirtileri öncelikle doku tadilatının göstergesi olan mesane-vücut ağırlık oranındaki artışla ilgilidir. Histolojik analiz, hem ürotelial hem de düz kas bölmeleri içinde hiperplaziyi ortaya koymaktadır3.
Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması Halka açık ekspresyon verileri kullanılarak, hücre dışı matris proteinleri için mesane dokusunun zenginleştirilmesi belirlendi (Şekil 2) ve sindirim karışımının formülasyonunu bilgilendirmek için kullanıldı. Kollajenler mesane duvarının anahtar bileşenleri olduğundan11,12, ilk önce Fare ENCODE projesi13tarafından oluşturulan RNA profil oluşturma veri kümelerini kullanarak fare mesanesinde en bol kolajenleri belirlemeye çalıştık. Analizimiz Kollajen 1A1, kollajen 3A1, kollajen 1A2 ve kollajen 6A1'in fare mesanesi içindeki en bol kollajen türleri olduğunu göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca 1,3, 6 ve hyaluronan kollajenlerinin mRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için Tabula Muris (fareden (Mus musculus)) 8'den tek hücreli transkriptom verilerinin bir toplamı) kullandık. Veriler, dokular arasında paylaşılan hücre tiplerinde gen ekspresyonunun doğrudan ve kontrollü bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Bu analiz, bu hücre dışı matris bileşenlerinin ekspresyonunun ürotelyum yerine mezenkimal hücre tiplerinde daha yaygın olduğunu ortaya koydu (Şekil 2B).
Ayrışmanın izole hücrelerin mesaneden yaşayabilirliği üzerindeki etkisi Akış sitometrisi analizi, 4 farklı protokol kullanılarak enzimatik sindirimin sırasıyla% 83, % 86, % 93 veya% 90 canlılık sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, protokol bölüm 3 hücre canlılığının korunması için en değerli görülmüştür. Ayrıca hücrelerin yaklaşık % 4'ünün nekrotik olduğunu gözlemledik (PI+/ Annexin V-) (Şekil 4A). Bu gözlemler sindirim protokolünün verimliliğini ve hücre canlılığı üzerindeki faydayı vurgular.
Omurilik hasarının mesanedeki farklı hücre popülasyonları üzerindeki etkisi SCI farelerinin mesanelerindeki toplam hücre sayısında kontrollere göre önemli bir artış gözlemledik. SCI mesanelerinden elde edilen nokta çizgilerinin deseni de omurilik yaralanması nedeniyle devam eden organ tadilatı ile biraz farklıydı(Şekil 4B: ilk sütun). Kontrollerle karşılaştırıldığında, SCI hayvanlarından elde edilen mesaneler CD45 pozitif hücrelerde önemli bir artış gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Şekil 1: Karaciğerin hafifletilmiş rengi ile temsili perfüzyon tamamlama. (A) Perfüzyonun başlangıcındaki karaciğer rengini gösterir. (B) Perfüzyon sonunda hafifletilmiş karaciğer rengini gösterir. (A)'daki fare, perfüzyondan iki hafta önce omurilik transeksiyonu geçirdi ve mesane hipertrofisine ve omurilik yaralanması olmayan farenin (B) aksine pelvisten çıkıntısına neden oldu; Bu durumda mesane küçüktür ve pelviste gizlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Şekil 2: Fare mesanesinde hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin transkriptomik ekspresyonu. (A) 43 farklı kollajen tipinin çubuk grafiği. İfade, transkriptin Kilobase Başına Okuma, milyon eşlenen okuma başına (RPKM) ile belirtilir (veriler BioProject' ten toplanır: PRJNA66167)14. (B) Erkek ve dişi ayrışmış idrar kesesi örnekleri havuzunda (erkek ve dişi) mikroakışkan damlacık bazlı 3'uç sayımından elde edilen hücre tiplerinde gen ekspresyonunun keman çizimleri. Sayımlar, milyon ln (CPM+1)8başına 1+ sayının doğal logaritmini kullanarak her hücre için günlük normalleştirildi. Logaritma almadan önce 1 CPM'lik bir sözde sayı eklendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Şekil 3: Floresan yayılımlarını belirlemek için gating stratejisi ve FDO kontrolleri. (A) Hücre popülasyonu seçimi. (B) Singlet'lar için gating stratejisi. (C) PI ve Annexin V antikoru kullanılarak nekrotik ve erken ve geç apoptotik hücreler için gating. (D\u2012F) Çok renkli akış sitometrisinin şematik nokta grafiği (örneğin, A, B, C, D florokromları + (Ek V ve PI) ile eşleştirilmiş antikorlar). Bu, floresanların FDO kontrolü tarafından gösterilen florokrom A kanalı ile antikora yayıldığını gösterir. Turuncu noktalı çizgi, kırmızı renkteki lekesiz sınıra kıyasla FMO geçiş sınırını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Şekil 4: Mesanede farklı hücre tiplerinin akış sitometrisi. (A) Annexin V/PI çift boyama akış şemaları. Her protokol için kullanılan farklı enzim ve kimyasal kombinasyonları, ilgili canlılık grafiğinin önünde temsil edilir. Bu veriler protokol bölüm 3 ile en yüksek canlılığı göstermektedir. (B) Tek kanallarda tespit edilen Ly-6A/E (Sca-1) ve CD326 (Ep-CAM) yoğunluğunu gösteren temsili histogramlar. (C) SCI'nın fare mesanesinin hücre popülasyonu üzerindeki etkisi. Üst panel, kontrol ameliyatsız farelerden elde edilen üç ayrışmış mesanede lekeleme sonuçlarını gösterir ve alt panel SCI'lı üç hayvanda lekelemenin sonuçlarını gösterir. İlk sütun toplam hücre popülasyonudur. İkinci sütunda singlet gating seçimi gösterilir. Üçüncü sütun, B hücreleri, T hücreleri ve NK hücreleri için negatif olan canlı hücrelerin alt nüfusunu gösterir. Dördüncü sütun, CD45 için pozitif canlı hücreler için boyama gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Tutar (500 mL için)</td>
			<td>Azı dişi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glikoz</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tyrode'un çözeltisinin hazırlanması için bileşenler. Belirtilen bileşenler 500 mL Tyrode çözeltisinin hazırlanması içindir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Tutar</td>
			<td>Protokol bölüm 1</td>
			<td>Protokol bölüm 2</td>
			<td>Protokol bölüm 3</td>
			<td>Protokol bölüm 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip I</td>
			<td>132,5 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip III</td>
			<td>96,4 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip VI</td>
			<td>50 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase</td>
			<td>10 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
			<td>115 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Kollajenaz</td>
			<td>50 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidaz</td>
			<td>10,5 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1.25 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hücre ayrıştırma çözümü</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekombinant enzim</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Sindirim tamponunun hazırlanması için bileşenler. Belirtilen bileşenler 2,5 mL sindirim karışımının hazırlanması içindir (1 U, dakikada 37 °C'de bir substrat olan 1 μmol'ün hidrolizini kataliz eder. Her enzimin biriminin tanımı için ürün veri sayfasına bakın).

Bu protokolün amacı, omurilik hasarının fare modeline optimize edilmiş bir doku ayrıştırma protokolü uygulamak ve akış sitometrisi ile tek hücre analizi yaklaşımını doğrulamaktır.

Omurilik Yaralanmasını Takiben Faredeki İdrar Kesesinin Moleküler Analizi için Tek Hücreli Ayrışma Yaklaşımı

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Bu protokol önemlidir, çünkü yüksek hücre canlılığına sahip tek hücreli bir süspansiyonun oluşturulmasını kolaylaştırmak için biyolojik bilgileri kullanır. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek hücre canlılığını ve izole hücre tiplerinin uygun bir temsilini koruyan tek hücreli süspansiyonlar üretme yeteneğidir. Cerrahi prosedürü göstermek, laboratuvarımdaki bir arkadaş olan Hüseyin Atta olacak.Doku ayrışma prosedürünü gösteren Ali Hashemi ve FACS analizi Yaser Heshmati olacak. Anestezi uygulanmış yetişkin bir farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, torasik omurgadaki en belirgin spinöz süreci palpe edin. Ameliyattan önce analjezi ve antibiyotik uygulanır.Farenin arkasında, boynun alt kısmından en belirgin dikenli sürecin hemen altına kadar ve orta hattın her iki yanında bir santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir dikdörtgen tıraş edin. Maruz kalan cildi, kesi bölgesinden başlayarak dışa doğru dairesel bir şekilde sıralı% 10 povidon iyot ve% 70 etanol mendillerle üç kez dezenfekte edin. Son silme işleminden sonra, fareyi cerrahi alanın üzerinde bir pencere bulunan steril dört x dört inçlik bir gazlı bez süngeri ile örtün.Omurilik yaralanmasını indüklemek için önce sırtın ortasında 1,5 santimetrelik bir kesi yapın ve kasları dikenli süreçlerden ve T9, T10 ve T11 omurlarının laminalarından ayırmak için keskin künt diseksiyon kullanın. T10 spinöz işleminin bilateral laminektomisini gerçekleştirmeden önce interspinöz bağları T9 ve T10 ve T10 ve T11 arasında keskin bir şekilde bölmek için ince makas kullanın. Laminalar tamamen eksize edildiğinde, omuriliği kesmek için makası kullanın.Yan sütunları tamamen kesmek için, ince makasın ucunu her iki taraftan nazikçe süpürün. Herhangi bir kanamayı sıkıştırmak için steril bir pamuk ucu uygulaması kullanın. Homeostazı sağladıktan sonra, cildi 7-0 poliglactin910 sürekli sütürlerle kapatın ve ameliyat sonrası dehidrasyonu önlemek için deri altına bir mililitre salin solüsyonu verin, ardından hayvanı tam yaslanana kadar izleme ile taze bir kafese geri koyun.Her 12 saatte bir, hayvanı bir elinizle tutarak ve diğer elinizle alt karın bölgesine masaj yaparak, hayvan kendi başına idrar yapabilene kadar manuel mesane ifadesini uyarmak için şişmiş idrar kesesini bulmak ve hafifçe sıkıştırmak için işaret parmağını ve başparmağınızı kullanın. İlgilenilen mesane hücre tiplerinin aşağı akış analizi için, uygun deneysel zaman noktasında ve hayvan yeterince anestezi uygulandıktan sonra, pelvisten diyaframa bir orta hat laparotomisi yapın ve diyaframı kaburgalardan kesin. Sternuma paralel kemik kıkırdak sınırını takiben, diyaframdan başlayarak ilk kaburgaya doğru ilerleyerek hayvanın her iki yanındaki kaburgalar boyunca toraksı açın.Ön torasik duvarı hayvanın kafasının üzerine sabitledikten sonra, perikardımı kesmek için ince makas kullanın ve perfüzyon aparatına 23 gauge bir iğne bağlayın. İğneyi sol ventriküle yerleştirin ve dokuyu delmeden iğneyi yavaşça aort içine ilerletin. İğne yerine oturduğunda, dokuyu dakikada 15 mililitre akış hızında PBS ile infüze etmeye başlayın ve sağ atriyumda hızlı bir şekilde küçük bir kesi yapmak için bir çift ince makasın uçlarını kullanın.Drenaj berraklaştığında ve açık bir karaciğer rengi gözlendiğinde, perfüzyonu durdurun ve mesaneyi vasküler pediküllerden ve üretradan kurtarın, ardından mesaneyi buz gibi Tyrode solüsyonu içeren mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, tüm mesaneler toplandığında, 100 mikrolitre Tyrode çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü yırtın. Tartıldıktan sonra, mesaneleri 100 mikrolitre Tyrode çözeltisi içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında kıyın ve doku parçalarını mesane başına 2,5 mililitre sindirim tamponuna aktarmak için geniş delikli bir pipet ucu kullanın.Dokuyu bir Nutator karıştırıcı üzerinde 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin ve ayrışmış hücreleri ve dokuları santrifüjleme ile toplamadan önce numuneyi bir dakika boyunca ezmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Peleti bir mililitre hücre ayırma solüsyonunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 dakika daha Nutator karıştırıcıya yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti bir mililitre kırmızı hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.Bir dakika sonra, dokuz mililitre PBS ilavesiyle lizisi durdurun ve hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe süzün, ardından hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti FC bloğu ile desteklenmiş 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, ışıktan korunan buz üzerinde 20 dakika boyunca uygun hacimde florofor konjuge antikor ana karışımında yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre hücre boyama tamponu ile yıkayın ve peleti, beş mikrolitre FITC Annexin V ve bir mikrolitre propidyum iyodür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre taze hücre boyama tamponu içinde yeniden süspanse edin.Oda sıcaklığında 15 dakika bekletildikten sonra, hücrelere 400 mikrolitre Annexin bağlayıcı tampon ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, önce hücrelerin yan ve ileri saçılma parametrelerini ayarlamak için boyanmamış bir hücre örneği kullanın, ardından ölü hücreleri dışlamak için floresan emisyonunu 530 nanometrede ve 575 nanometreden daha büyük ölçün. İlk bozunmadaki negatif popülasyonu tanımlamak için her nokta lekesindeki ızgaraları kullanın ve negatif ve pozitif popülasyon ortamları hizalanana kadar spektral örtüşmeyi düzeltmek için floresan eksi bir kontrollerini kullanın.Daha sonra, hücrelerin 100.000 olayını, ilgilenilen belirli belirteçlerle ölçün ve gerektiğinde ilgilenilen hücre popülasyonları için kapılar oluşturun. Tüm numuneler çalıştırıldığında, uygun akış sitometrik analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Kollajen 1A1, kollajen 3A1, kollajen 1A2 ve kollajen 6A1, fare mesanesinde en bol bulunan kollajen türleridir.Kollajen bir, üç, altı ve hyaluronanın mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek için yapılan analiz, bu hücre dışı matris bileşenlerinin ekspresyonunun mezenkimal hücre popülasyonlarında ürotelyumdan daha yaygın olduğunu ortaya koymaktadır. Akış sitometrik analizi, birden fazla farklı enzimatik sindirim protokolünün oldukça canlı hücre popülasyonları verdiğini ve bu analizde kullanılan üçüncü sindirim protokolünün hücre korumasında en etkili olduğu belirlendiğini göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak, omurilik yaralanması olan farelerin mesanelerinden izole edilen toplam hücre sayısında, kontrol mesaneleriyle karşılaştırmak için önemli bir artış elde edilebilir.Kontrollerle karşılaştırıldığında, omurilik yaralanması olan hayvanlardan alınan mesaneler de CD45 pozitif hücrelerde önemli bir artış göstermektedir. Adım 7.1, kardiyak popülasyonda tanımlama için önemlidir. Geçit stratejisi, ilgili hücreler tarafından bilgilendirilmelidir.SCI hayvanlardan elde edilen mesaneler farklı hücre popülasyonuna sahiptir. Bu protokol, hücre sıralaması, birincil hücre kültürü, tek hücre dizilimi ve canlı tek hücreler gerektiren diğer molekül ve hücresel aşağı akış prosedürleri için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi gibi tek hücreli analiz teknikleri için kilit bir nokta olan yüksek canlılık ve dolayısıyla düşük hücre popülasyonu kaybı sağlar.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Balona hücre bağlılık hızına göre kas-iskelet yumuşak dokulardan Yalıtımlı yetişkin kök hücreleri.

Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Fetal fare dokulardan nöral krest kaynaklı nöronal ataları arındırmak için optimize edilmiş bir prosedür anlatılmıştır. Bu yöntem, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) tarafından ayrı nüfus yalıtmak için floresan muhabiri allellerinin ifade yararlanır. Tekniğin geliştirilmesi boyunca veya yetişkin dokulardan nöronal subpopülasyonunun izole etmek için uygulanabilir.

Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

Kaynak: Yang, E. ve diğerleri. İdrar yolu enfeksiyonunun fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteri topluluklarının izolasyonu, sonraki tek hücreli analiz için. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, enfekte fare mesanesinden hücre içi bakteri toplulukları içeren tek epitel hücrelerinin ağız mikropipetleme kullanılarak manuel izolasyonu göstermekte, idrar yolu enfeksiyon modellerinde canlı konakçı ilişkili E. coli popülasyonlarının tek hücreli analizini mümkün kılmaktadır.

Hücre içi bakteri toplulukları içeren fare mesane epitel hücrelerinin izolyasyonu

Farelerin transüretral Kateterizasyon kurulan modeli mesane patolojiler, idrar yolu enfeksiyonu, dahil olmak üzere çalışma sağlar ancak yalnızca dişi içinde gerçekleştirilebilir. Burada anlatılan erkek transüretral korumak yeni bir model araştırma cinsiyetler arasında güçlü klinik ve epidemiyolojik farklarına iaretlenmi bir alanı sağlayacaktır.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Bu iletişim kuralı tek, enfekte-mesane idrar yolu enfeksiyonu fare modeli gelen epitel hücreleri izole basit bir yöntem açıklanır.

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

Bu protokol, birincil nöronlar için tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaya ve daha fazla hücresel deney için sıçan mesanesinden glia izolasyonu oluşturmaya çalışır.

Yetişkin Sıçan İdrar Kesesinden Primer Nöronların ve Gliaların İzolasyonu ve Kültürü

Bu nöral hücre ayrışma protokolü, düşük miktarda başlangıç malzemesine sahip numuneler için tasarlanmıştır ve isteğe bağlı sabitleme ve boyama adımlarıyla aşağı akış analizi için oldukça uygun bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Fare Beyni Hipokampal Dokusunun Kombine Mekanik ve Enzimatik Ayrışması

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Bu çalışma iki önemli deneysel teknik sunmaktadır: yara kapanmasını değerlendirmek için bir murin yara modelinin oluşturulması ve hücresel canlılığı korumak için murin derisinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması.

Fare Yara Modelleri ve Tek Hücre Süspansiyonlarının Hazırlanması

Keşfedin, omurilik yaralanması sonrası fare idrar kesesinde tek hücreli ayırma yöntemiyle yüksek canlılıkta hücre süspansiyonu oluşturma tekniğini. Bu protokol, akış sitometrisi ile hücre popülasyonlarının moleküler analizini kolaylaştırır.

Omurilik Yaralanmasını Takiben Faredeki İdrar Kesesinin Moleküler Analizi için Tek Hücreli Ayrışma Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet