MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi
24 Haziran 2020
Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.
Bu protokol, iki boyutlu görüntüsünden hücre içi yapının alanının, çevresinin ve şeklinin nicelemesini sağlar. Bu teknik hızlı ve kolaydır, sadece standart laboratuvar ayarları ve konfokal mikroskop gerektirir ve açık kaynak yazılım kullanır. Prosedürü gösteren Anna Balcerak, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
37 derece santigrat derece ve beş derece karbondioksit inkübatör 24 saatlik bir kültür için dört iyi kollajen bir kaplamalı oda slayt iyi başına kültür orta 0,5 mililitre beşinci hücrelere dört kez 10 tohumlama ile başlayın. Ertesi sabah, en az %90 eşzamanlı monokatmanın varlığını doğrulamak için optik ters mikroskop kullanın ve tek z dilimi görüntüleri elde etmek için konfokal mikroskop kullanın. Odak yapışma analizi için ImageJ'deki görüntüleri açın ve görüntü ölçeğini pikselolarak ayarlamak için analiz, ölçek ayarlama, ölçek kaldırma ve genel i
Dosya adını ve ilgi alanının ölçüm seçeneklerini eklemek için, analiz et ve ölçümleri ayarla ve alanı kontrol et ve etiket seçeneklerini görüntüle. Arka planı çıkarmak için işlemi seçin ve arka planı çıkarın. Yuvarlanan top yarıçapını 50 piksele ayarlayın ve kayan paraboliyi kontrol edin.
En küçük ilgi alanının alanını belirlemek için, en küçük tek odak yapışmasını ana hatlarını belirleyin ve alanı ölçmek için analiz et ve ölç'ü tıklatın. En az 20 ilgi alanı seçildiğinde ve ölçüldüğünde, elde edilen sonuçların ortalamasını hesaplayın ve kaydedin. Üst sınırı tipik bir hücre alanının %25'ine ayarlayın.
Görüntüyü ikili olarak vermek için görüntüyü tıklatın, ayarlayın ve eşiği tıklatın ve varsayılan, siyah beyaz ve koyu arka planı denetleyin. İlgi çekici bölgelerin sayısını ve alanlarını ölçmek için, parçacığı analiz etme ve analiz etme ve piksel birimlerini kontrol etme, sonuçları görüntüleme, sonuçları netle ve özetle. Dilim, sayım ve toplam alan ortalama boyutu verilerini özet penceresinden tercih edilen veri yönetim programına aktarın.
Odak yapışma ölçümü için, odak yapışması ImageJ makrosunu açın ve en küçük ilgi alanı nın alanını en küçük ilgi alanı olarak girin. Eşik türü değerini manuel veya otomatik olarak ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin. Ardından ImageJ'den makroyu arayın ve işlenecek görüntüyü seçin.
Manuel hücre şekli analizi için, uygun bir görüntü işleme yazılımı programında bir görüntü açın ve ölçülecek parametreleri seçin. Hücre kenarlıklarını, tercih edilen bağlantı proteinleri tarafından işaretlenen el ile ifade etmek için serbest el seçim aracını kullanın. Seçilen parametreler her hücre için otomatik olarak hesaplanır.
Tüm hücreler ana hatlarıyla ana hatlarıyla belirtildiğinde, edit, seçim ve yöneticiye ekleyin'i seçin. Yalnızca kesintisiz kenarlıkları olan tamamen görünür hücrelerin tamamı seçilmelidir. Ölçümü yapmak için, ilgi alanı yöneticisinin bulunduğu bölgenin sol kutusunda görünen tüm sayıları işaretleyin ve ölçüyü tıklatın.
Sonuçlar sonuç kutusunda görünür ve tercih edilen elektronik tabloya aktarılabilir. Otomatik hücre analizi, çok sayıda hücrenin sayısallaştırılmasını kolaylaştırır. Her yeni hücre türü için, parametreleri belirlemek için önce makroyu çalıştırın.
Makro tamamlandığında, hücre boyutu sınırlarını ayarla'yı seçin. En küçük ve en büyük hücrelerin etiketini tıklatın ve ölçü'ye tıklayın. En küçük hücrenin ve en büyük hücre değişkenlerinin değerini ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin.
Makro pencerelerinin tümünü kapatın ve gri tonlamada işlenecek görüntüyü seçin. Sonra makroyu yeniden çalıştırın. Makro, hücre şekli dizini, en boy oranı ve ilgi alanları seçim listesi verilerini içeren sonuçların bir tablosunu sağlar.
Burada, son numaralı anahatlar ve odak yapışmasının bindirmeleri de dahil olmak üzere ImageJ ile sayılan odak yapışıklıklarının temsili görüntüleri, hem kontrol hem de nakavt hücre hatları için orijinal görüntüile odak yapışmaanahatlarını gözlemleyebilir. Bu analizde gösterildiği gibi, knockdown hücreleri hücre başına yapışıklıkların daha fazla sayıda yanı sıra hücre hattı hücreleri kontrol göre boyutu daha büyük yapışıklıklar gösterdi. Bu görüntülerde tedavi edilmeyen ve kemoterapötik olarak tedavi edilen hücre monolayers'ın temsili bölgeleri gösterilmiştir.
Anahat hücreleri hücre şekil indeks değerlerine göre karakterize edildi, örneğin bu analizde son depo kutusunda bir artış ve tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla ilaçla tedavi edilen hücreler için ana zirvelerin düzlemesi gösterildi. Daha sonra her hücre kültürü için bir frekans dağılımı ve kümülatif dağıtım oluşturulabilir. Gösterildiği gibi monolayers grayscale görüntüleme analiz ve görüntüleme 12 alanlardan 512 hücrelerin niceliksel hücre şekli indeksi göreli bir frekans dağılımı ortaya izin verdi.
Bu protokolün çalışması için, mümkün olan en iyi kalitede görüntüleri kullanmak önemlidir. Uygun hücre tohumlama, boyama ve görüntüleme yeterli deneysel kalitede görüntüleri sağlamalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, konfluan MCF7 hücre monokatmanlarında fokal yapışmaları ve hücre şekil indeksini konfokal görüntüleme kullanarak nicellemek için bir protokol detaylandırmaktadır. Çalışma, hem yapışma hem de hücre şekil değişimlerinin erişilebilir görüntüleme teknikleriyle nasıl analiz edilebileceğini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Fokal Yapışma Analizi
- Hücre Şekil Ölçümü
Arka Plan
- Fokal yapışmalar, hücre yapışması ve sinyal iletiminin kritik öneme sahiptir.
- Hücre şekli ve yapışmayı anlamak, kanser biyolojisi çalışmalarını etkileyebilir.
- MCF7 hücreleri, meme kanseri araştırmaları için bir model sistem olarak hizmet vermektedir.
Kullanılan Yöntemler
- Hücresel yapıların görüntülemesinde konfokal mikroskopi.
- Fokal yapışma alanlarını ve hücre şekil indeksini analiz etmek için ImageJ yazılımı.
- Verimli veri toplama için manuel ve otomatik analiz protokolleri.
Ana Sonuçlar
- Kontrol hücrelerine kıyasla, hücrelerde daha fazla sayıda ve daha büyük boyutlarda fokal yapışma gözlendi.
- İlaçla tedavi edilmeyen ve tedavi edilen hücreler arasında hücre şekil indeksinde farklılıklar belirlendi.
- Güçlü metodolojiler, büyük örneklem boyutlarının analizini sağlayarak istatistiksel alaka düzeyini artırdı.
Sonuçlar
- Bu çalışma, hücre morfolojisi ve yapışma özelliklerini analiz etmek için güvenilir bir protokol sağlamaktadır.
- Bulgular, kanser araştırma ve geliştirme açısından hücrelerin mekanik özelliklerini anlamak için katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
