Farelerde Kuru Toz Formülasyonunun Intratrakial Yönetimi

Kuru tozun intratrakeal uygulaması, klinik öncesi hayvan modellerinde pulmoner emilim, biyoyararlanım ve terapötik etkiler gibi solunan bir toz formülasyonunun performansını ve biyolojik aktivitelerini değerlendirmek için gereklidir. Entübasyon işlemi non-invazivdir ve farelere güvenli ve doğru bir şekilde toz formülasyonu sağlayabilir. Özel yapım kuru toz insülatör, tek kullanımlık, ucuz ve toz formülasyonlarının dağıtılmasında etkilidir.

İnsüflatörler, aynı deneylerde birden fazla fare üzerinde farklı formülasyonların değerlendirilmesinde, artık tozdan çapraz kontaminasyon riski olmadan kullanılabilir. Entübasyon süreci deneyimsiz araştırmacılar için zorlayıcıdır. Trakea açıklığında kanülün en ince ucunu görselleştirme ve hedefleme yeteneği, kılavuz kanülün doğru yerleştirilmesi için çok önemlidir.

Bu teknik, yanlış yerleştirmeyi en aza indirmek için pratik gerektirir. Doktora sonrası öğrencim Carol ve doktora öğrencim Rachel hazırlık ve entübasyon prosedürünü gösterecekler. Başlamak için, kuru tozun ve 200 mikrolitrelik filtresiz yuvarlak jel yüklemeli pipet ucunun statik yüklerini antistatik bir tabanca veya deiyonize işlevli bir terazi ile nötralize edin.

Yaklaşık dört x dört santimetre boyutunda bir tartı kağıdı hazırlayın. Kağıdı çapraz olarak ikiye katlayın ve ardından açın. Sonra bir ila iki miligram kuru tozu tartmak için kullanın.

Jel yüklemeli bir pipet ucunu daha geniş açıklıktan tozla doldurun ve ucun dar ucunun yakınında gevşek topaklar oluşturana kadar tozu paketlemek için hafifçe vurun. Dağılmayı engelleyebileceği için tozu çok sıkı paketlemekten kaçının. Toz yüklü ucu, tozun dökülmesini önlemek için bağlantı sırasında ucu ve şırıngayı dikey olarak tutan üç bir musluktan bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın.

Şırınganın boyutu, tozu dağıtmak için kullanılan hava hacmine göre değiştirilebilir. Uygulama hemen yapılmazsa, ucun açıklıklarını kapatmak için parafilm kullanın ve uygulamaya kadar uygun koşullarda geçici olarak saklayın. Yedi ila dokuz haftalık BALB / c faresini ketamin ve ksilazin ile uyuşturduktan sonra, bir standa monte edilmiş pleksiglas bir platforma yerleştirin.

Kesici dişlerini naylon bir diş ipine asarak fareyi askıya alın ve konumunu bir parça bant veya lastik bantla sabitleyin. Platformun yüksekliğini ve açısını ayarlayın. Optik fiberi, kanülün açıklığı ile fiber seviyesinin ucu ile kılavuz kanüle yerleştirin.

Ardından aydınlatmak için LED el fenerini açın. Trakeasını ortaya çıkarmak için farenin dilini bir çift forseps ile hafifçe çıkıntı yapın. Kılavuz kanülü fiber optik ile tutmak için diğer elinizi kullanın ve ağız boşluğundan geçirin.

Optik fiberden gelen aydınlatma ile soluk borusunun açılması, ses telleri arasında bir delik olarak görselleştirilebilir. Kılavuz kanülün eğimini açıklığın orta hattına doğru hizalayın ve kanülün en ince ucunu trakeal açıklığa hedefleyerek optik fiber ile trakeaya nazikçe entübe edin. Entübasyondan sonra, optik fiberi hızla çıkarın ve kılavuz kanülü trakeanın içinde bırakın.

Normal restorasyon gözlenmelidir. İnce uçlu pipeti kılavuz kanülün ağzında tutun ve farenin akciğerine küçük bir hava üfleyin. Göğüste hafif bir şişkinlik uygun entübasyonu gösterir.

Toz uygulamasından önce ince uçlu pipeti çıkarın. Şırıngaya bağlı güç yüklü ucu tutun ve şırınga ile uç arasındaki hava akışının kesildiğinden emin olun. 0,6 mililitre hava çekmek için şırınga pistonunu geriye doğru çekin.

Şırınga ile güç yüklü uç arasındaki hava akışını bağlamak için üç vananın valfini çevirin. Ardından, güç yüklü ucu, farenin trakeasına önceden yerleştirilmiş olan kılavuz kanüle yerleştirin. Yönlendirici kanülü tutun ve tozu aerosoller olarak akciğere dağıtmak için şırınga pistonunu tek bir sürekli hareketle kuvvetlice itin ve hayvanın yaralanmasını önlemek için herhangi bir ileri hareketi en aza indirin.

Ucu çıkarın ve tozun boşaltılıp boşaltılmadığını kontrol edin. Uygulama tamamlandıktan sonra, kılavuz kanülü trakeadan çıkarın. Hava yollarının tıkanmasını önlemek için fareyi, dili yarı çıkıntılı olacak şekilde sırtüstü pozisyonda yatay olarak konumlandırarak iyileşmesine izin verin.

Yöntemi optimize etmek için, püskürtülerek kurutulmuş mannitolün bir miligramını dağıtmak için farklı hacimlerde hava kullanıldı ve farelerin ağırlığı izlendi. 0.3 ve 0.6 mililitre hava kullanımı, uygulamadan 48 saat sonrasına kadar farelerde kilo kaybına neden olmamıştır. Tozun bir mililitre hava ile dağıtılması, 24 saat içinde% 5'in üzerinde kilo kaybına neden oldu ve bu 48 saat sonra tamamen geri kazanılmadı.

Farelere intratrakeal olarak beş mikrogram mRNA içeren bir miligram SFD tozu uygulandı ve akciğerlerdeki lusiferaz ekspresyonu, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak uygulamadan 24 saat sonra değerlendirildi. SFD tozu derin akciğerde dağıldı ve lusiferaz ekspresyonu gözlendi. Bir karşılaştırma olarak, toz suda sulandırıldı ve aynı entübasyon prosedürü kullanılarak bir mikro püskürtücü ile uygulandı.

Sulandırılmış formülasyonun lusiferaz ekspresyonu, kuru toz formülasyonundan önemli ölçüde daha yüksekti, bu da toz hayal kırıklığı sorununa veya toz ile sıvı form arasındaki farklı farmakokinetik profile bağlı olabilir. mRNA kuru toz aerosol ile tedavi edilen akciğerlerin histolojik özellikleri, tedavi edilmemiş kontrol ve LPS ile tedavi edilen gruplarla karşılaştırıldı. Herhangi bir tedavi uygulanmayan akciğer sağlıklı bir tablo sergilerken, LPS ile tedavi edilen akciğer, hava sahasının düzensiz dağılımı ve interstisyel ve alveolar boşluklara inflamatuar hücre infiltrasyonu gösterdi.

SFD tozu ile tedavi edilen akciğerler herhangi bir iltihap belirtisi göstermedi. Başarılı bir toz dağılımı için, yükleme ucundaki toza hafifçe vurulmalı ve uçta çok sıkı bir şekilde paketlenmemelidir. Bu entübasyon ayarı, sıvı formülasyonları bir pipet veya mikro püskürtücü ile uygulamak için de uyarlanabilir.