Name: Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Öğrenin deterjan ve enzim içermeyen yöntemle zebrafish beyin dokusundan çekirdek izolasyonunu. Bu hızlı protokol, tek hücreli epigenom ve transkriptom analizleri için sağlam nükleus hazırlama imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Sabine Costagliola ve Singh laboratuarı üyelerine el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS tarafından 34772792 – MISU'dan S.P.S.'ye hibe numarası altında desteklenmiştir.

Aşağıda sunulan tüm prosedürler, Université Libre de Bruxelles (protokoller 578N-579N) tarafından hayvan refahı etik komitesi (CEBEA) tarafından onaylanan kurumsal (Université Libre de Bruxelles (ULB)) ve ulusal etik ve hayvan refahı yönergeleri ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Doku diseksiyonu öncesi hazırlık
<ol><li>Zebra balığı ötenazi için PBS'de %0.2 Tricaine çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi buzüzerinde soğutun.</li>
	<li>Dokuyu kıymak için 30 mm petri kabı hazırlayın.</li>
	<li>Buz soğuğu 1x PBS (doku numunesi başına 10 mL) hazırlayın.</li>
	<li>Santrifüj4 °C'ye kadar soğutun.</li>
	<li>Çekirdek lerin izolasyonu için deterjansız çekirdek izolasyon kiti(Tablo Malzemeler)kullanın.</li>
	<li>Protokolü başlatmadan önce, çekirdek izolasyonundan önce en az 30 dakika buzüzerinde yerleştirerek kitte ön soğutma tamponU A ve B sağlanır.</li>
	<li>İzole çekirdekleri işlemek için, %5 BSA çözeltisi ile tüpler ve pipet uçları gibi plastik reaktifleri kaplayın. Bunun için çözeltiyi 40 mL PBS'de 2 g BSA'yı eriterek hazırlayın. Plastik parçaların %5 BSA ile kaplanması, plastiğe yapışan çekirdekleri azaltır. Bu adım izole çekirdeklerin kurtarma artırır.</li>
	<li>Pipet uçlarını %5 BSA çözeltisini 2-3 kez pipetleyerek katlayın. Uçları 2 saat boyunca havayla kurutun. Numune başına 10 plastik ipucu hazırlayın.</li>
	<li>Çekirdeklerin toplanması için tüpleri %5 BSA ile doldurarak katlayın. Verimli bir kaplama sağlamak için tüpleri 3 kez ters çevirin. Çözeltiyi çıkarın ve tüpleri 2 saat boyunca temiz bir kağıt üzerinde baş aşağı kurulayın. Örnek başına, kitte sağlanan bir toplama tüpü katlayın. Ayrıca, FACS'dan sonra çekirdek lerin toplanması için kaplanmış 1,5 mL tüpler hazırlayın. NOT: Cam uçları yapışmayı en aza indirmek için plastik pipet uçlarına son derece tavsiye edilir.</li>
</ol>2. Zebra balığı beyninin diseksiyonu
<ol><li>Zebra balığının ötenaziiçin, 25 mL buz gibi Tricaine çözeltisi içeren 90 mm Petri kabı hazırlayın.</li>
	<li>Dikkatlice, bir balık ağı kullanarak tanktan zebra balığı almak ve Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>5 dakika tricaine bırakarak balık ötenazi.</li>
	<li>Keskin bir jiletle hayvanın kafasını kopar.</li>
	<li>Forceps kullanarak, yavaşça kafatası kırmak ve yumuşak dokular kaldırmak, deri ve kemikler ventral ve kafatası nın dorsal tarafında.</li>
	<li>Yavaşça, buz gibi pbs içeren taze bir 30 mm çanak içine beyin aktarın.</li>
	<li>Spin sütunundaki numunenin yüklenmesikolay bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde beyin kıyma.</li>
</ol>3. Tek çekirdek izolasyonu
<ol><li>Kıymalı dokuyu çekirdek izolasyon kitinde bulunan filtre kartuşuna aktarın ve dokuyu hassaslaştırmak için 200 μL soğuk tampon A ekleyin. 2 dakika kiti tarafından sağlanan plastik çubuk kullanarak doku grind.</li>
	<li>300 μL soğuk tampon A ekleyin ve 10 dakika açık kapağı ile buz üzerinde filtre kartuşuna inkübün.</li>
	<li>Kartuş kapağı ve tüp ters 5 kez doku resuspend.</li>
	<li>30 s için 16.000 x g santrifüj. Bu adımda filtreden geçerken hücreler yırtılır ve yüksek hızlı santrifüj kuvvetuygulanır. Akış, tüpün dibinde ki sağlam çekirdekleri içerir.</li>
	<li>Filtreyi atın ve 10 s'lik bir süre şiddetle girdap layarak peleti yeniden askıya alın.</li>
	<li>3 dk. Çözeltiyi 500 x g'da santrifüj ederek çekirdekleri peletleyin.</li>
	<li>Peleti 0,8 mL soğuk tampon B ve santrifüj de 600 x g 10 dk için yeniden askıya alın. Bu adımda çekirdekler membran enkazından ayrılır. Elde edilen renksiz pelet izole çekirdekleri içerir.</li>
	<li>500 μL PBS'de izole edilmiş çekirdekleri %5 BSA ile yeniden askıya alın. Kireçlenmeden sonra FACS gerçekleştirmek için çekirdek süspansiyonu buzüzerinde tutun.</li>
</ol>4. Nükleus morfolojisinin görselleştirilmesi
<ol><li>Hoechst boyama ile nükleer morfolojiyi doğrulayın. Bunun için, BSA kaplamalı uçları kullanarak yeni bir tüpte 100 μL tek çekirdekli süspansiyonu çıkarın. Çekirdekleri boyamak için 0.1 μL Hoechst (1 mg/mL) ekleyin. Tüpü yavaşça girdaplayın.</li>
	<li>Görüntüleme için çekirdek süspansiyonu cam alt çanağa aktarın.</li>
	<li>~405 nm (Violet) dalga boyu lazer uyarma ayarları ile floresan mikroskobu kullanarak çekirdekleri görüntüleyin.</li>
</ol>5. Çekirdeklerin FACS tabanlı zenginleştirme
<ol><li>FACS yapmadan önce, 40 μm hücreli süzgeç kullanarak çekirdekleri BSA kaplı tüpe süzün.</li>
	<li>Filtrelenmiş süspansiyonu % 5 BSA ile 1.000 μL'lik son hacmine PBS ekleyerek seyreltin.</li>
	<li>İki yuvarlak alt FACS tüpünü 'kontrol' ve 'lekeli' olarak etiketlendirin. 'Kontrol' tüpü lekesiz çekirdekler içerirken, 'lekeli' tüp Hoechst lekeli çekirdeklere sahip olacaktır.</li>
	<li>BSA kaplamalı pipet ucu kullanarak çekirdek süspansiyonunun 250 μL'sini 'kontrol' tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kalan 750 μL çözeltiyi 'lekeli' olarak etiketlenmiş FACS tüpüne aktarın ve çekirdekleri lekelemek için 1 μL Hoechst boya ekleyin. Yavaş girdap ile karıştırın.</li>
	<li>Lekesiz kontrol örneğini hücre ayırıcısına yükleyin. 5000 etkinlik kaydedin.</li>
	<li>Lekeli örnekleri yükleyin ve 5000 olay kaydedin.</li>
	<li>Tek çekirdeklerin tanımlanmasına olanak tanıyan FACS kapıları çizin. Çekirdekler, Hoechst floresan sinyalini kontrol ve lekeli numune arasında karşılaştırarak seçilebilir.</li>
	<li>Hoechst-pozitif çekirdekleri lekeli tüpten 50 μL PBS içeren yeni 1,5 mL tüpe ve %5 BSA'ya sıralayın. NOT: İzole çekirdekler, aşağı akım uygulamasının gereklerine göre istenilen ortama toplanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+characterization+of+ovine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells.</a> Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).</li>
<li>Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+collagenase+loses+islet-isolating+efficacy+regardless+of+storage+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions.</a> Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).</li>
<li>Massoni-Badosa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+artifacts+in+single-cell+genomics+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Van Den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumour+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarxiv%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Bioarxiv. 683227, (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> Plos One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Rajbhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+reveals+immune+cell-adipocyte+crosstalk+regulating+the+transcription+of+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Thrupp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleus+sequencing+fails+to+detect+microglial+activation+in+human+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Selewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Comparison+of+High-throughput+Single-Cell+and+Single-Nucleus+Transcriptomes+during+Cardiomyocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li>
<li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate%2C+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li>
<li>Hymer, W. C., Kuff, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+From+Mammalian+Tissues+Through+the+Use+of+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100.</a> The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents%3A+Triton+X-100%2C+Tween-20%2C+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li>
<li>Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31(2013).</li>
<li>Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraham%2C+J+%22Subcellular+fractionation%3A+a+practical+approach%22">Subcellular fractionation: a practical approach</a>. , IRL Press. (1997).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok. Makaleye açık erişim yapmak için ödeme Invent Biotechnologies Inc, ABD tarafından yapılmıştır.

Transkriptom ve epigenomun tek hücreli çözünürlükte profilini çıkarmak biyolojik sistemlerin incelenmesinde devrim yarattı. Katı bir doku için tek bir hücrenin çözünürlüğünde yapılan çalışmalar, organın tek tek hücrelere veya çekirdeklere ayrıştırılmasına bağlıdır. Dissosyon, sistemin 55, 6'nın6doğru bir temsilinin geliştirilmesini engelleyebilen teknik eserler idamı veren yıkıcı bir prosedürdür. Örneğin, enzimatik dissociation karmaşık morfolojileri ile hücrelere zarar verebilir, nöronlar veya podositler gibi, ve stres ve ısı şoku yanıt genlerinin ifade neden olabilir7,12. Ayrıca, dissosilasyon sırasında deterjan kullanımı nükleer membran yırtılması ve toplama yol açabilir23,25. Bu nedenle, tek bir hücre veya en yüksek kalitede çekirdek süspansiyon elde etmek için ayrışma optimize yüksek iş çıkışlı profilleme deneylerin başarısı için çok önemlidir.
Burada, zebra balığı beyninden bozulmamış çekirdeklerin 20 dakikadan daha kısa bir sürede çıkarılmasını sağlayan bir deterjan ve enzimsiz çekirdek izolasyon yöntemi gösteriyoruz. Protokol tipik morfolojisi ve sağlam bütünlüğü ile çekirdekleri verir(Şekil 2). 6 mg ağırlığındaki tek bir zebra balığı beyninden, protokol hemositometre sayısı ile belirlenen toplam 60.000 çekirdek verir. İzole çekirdekleri snRNA-seq, ATAC-seq ve immünboyama dahil olmak üzere birden fazla downstream uygulamaları için kullanılabilir. İzole çekirdekleri sitoplazmik fraksiyonlardan çapraz kontaminasyon içerebilir, özellikle endoplazmik retikulum ve mitokondri bileşenleri. Yüksek iş bölümü profilleme deneyleri için, hücresel enkazın, özellikle mitokondrilerin temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Akış sitometrisi (Şekil 3) çekirdeklerin saflaştırılması için uygun bir seçenek sağlar. Alternatif olarak, sakaroz gradyanı da enkaz kaldırılması için kullanılabilir.
Protokol fare tiroid bezi üzerinde test edilmiştir (veriler gösterilmez) ve zebra balığı beyin dokusuna benzer sonuçlar sağlar. Genel olarak, protokol tek çekirdek süspansiyonu hazırlanması için sağlam, tekrarlanabilir ve evrensel bir yöntem sağlayarak yüksek iş çıkarma lı profil oluşturma deneyleri için lojistiği basitleştirmeye yardımcı olur.

Tek hücreli RNA-seq (scRNA-Seq) ve ATAC-seq, karmaşık biyolojik sistemleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için çok yönlü araçlardır. Hücre alt tiplerini ve durumlarını, gen ağlarını tanımlamak ve hücresel heterojenliği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadırlar. ScRNA-seq yapmak için bir ön koşul doku dissosiyatasyonu ile tek hücreli süspansiyon hazırlanmasıdır. Hücre dışı matris bileşimi ve mekanik özelliklerindeki değişim nedeniyle, tek tek dokular tek hücreli süspansiyonun hazırlanması için ayrışma protokolünün optimizasyonunu gerektirir.
Tek hücrelere dokuların ayrışması genellikle 37 °C1,2,3,4de, kollajenaz, dispase veya tripsin gibi sindirim enzimleri ile tedavi içerir. Transkripsiyonel makineler 37 °C'de aktif kaldığından, enzimatik dissosilasyon mRNA ekspresyonu eserlerini ve gürültüyü5,6olarak tanıtabilir. Özellikle, uzun süreli kuluçka strese duyarlı genler ve tekdüze olmayan bir şekilde ısı şoku yanıtı neden olabilir - deneyde teknik değişkenlik yol7.
Tek bir hücre süspansiyon uyaratmanın bir diğer dezavantajı da karmaşık morfolojilere sahip canlı ve sağlam hücre tiplerini elde etmedeki zorlukdur. Özellikle, nöronlar, adipositler ve podositler,8,9,10,11izole etmek için zor . Örneğin, Wu ve meslektaşları bir yetişkin fare böbrek12scRNA profilleriglomerüler podositlerin eksikliği gösterdi. Benzer optimal olmayan gözlemler beyin dokusundan birbirine bağlı nöronların kurtarma ile ilgili yapılmıştır8,13,14. Özetle, ayrışma protokolleri hücre tiplerini daha kolay ayrıştırmaya yönelik algılama önyargısı getirebilmekte ve bu da organın hücresel mimarisinin yanlış yorumlanmasına yol açabilmektedir.
ScRNA-Seq.'de numune hazırlama sırasında ortaya çıkan teknik gürültü ve önyargının üstesinden gelmek için, çekirdeğin izolasyonu ve profilinin saptanması cazip bir alternatif sunar. Nükleer morfoloji farklı hücre tipleri arasında benzer olduğundan, çekirdeklerin izolasyonkarmaşık morfolojileri ile bozulmamış ve canlı hücreleri izole sorunu atlatır. Örneğin, Wu ve meslektaşları tek çekirdekli RNA-Seq ile glomerüler podositler başarılı profilleme gösterdi (snRNA-Seq.) bir yetişkin fare böbrek, hangi scRNA-Seq12eksikti . İlginçtir, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA-seq arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar snRNA-Seq12ile stres ve ısı şoku yanıt genlerinin indüksiyon bir azalma önerdi. Çalışmalar ayrıca iki yöntem tarafından saptanır genler arasında yüksek bir korelasyon göstermektedir. Ancak, insan mikroglia üzerinde yapılan yeni bir çalışmada Alzheimer hastalığında genetik aktivasyonu tespit etmek için başarısız oldu15. Böylece belirli bağlamlarda, snRNA-Seq scRNA-Seq16,17için uygun bir alternatiftir. Ayrıca, nükleer izolasyon tek hücreli ATAC-Seq için kullanılabilir., tek tek hücreler içinde açık kromatin bölgeleri hakkında bilgi sağlayan.
Çekirdek izolasyonu protokolü üç ana adımı içerir: i) hücre zarının çekirdeği serbest bırakmak için deterjan bazlı lysis; ii) bir Dounce homogenizer kullanarak doku homojenizasyonu; ve iii) çekirdeklerin zenginleşmesi ve degrade santrifüj,19,20,veya akış sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri kullanarak hücre enkaz kaldırma , 21,1822.22 Bu, ilk iki adım doku tipine bağlıdır ve ampirik optimize edilmesi gerekir. Hafif deterjan hücre zarının kısmi rüptürüne ve nükleusların dokudan verimsiz alınmasına yol açar23. Öte yandan, deterjan ve sert homojenizasyon yüksek düzeyde nükleer membran rüptürü ve kaybı yol açar24,25. Yırtılmış çekirdekler daha da bir araya kümelenme eğilimindedir ve kaldırılmazsa aşağı profilleme deneyinde eserlere yol açabilir agregalar oluşturur.
Çekirdek izolasyonu için deterjan optimizasyonu ile ilgili sorunları atlatmak için, bozulmamış çekirdekleri deterjansız ve spin-kolon tabanlı bir yöntem kullanarak taze numunelerden izole etmek için bir protokol uyguluyoruz. Protokol, tüm organdan çekirdekleri 20 dakika içinde verir ve bu da transkripsiyonun indüksiyonunu sınırlar. İzole çekirdekler, tek çekirdekli RNA-Seq. ve ATAC-seq için FACS ile zenginleştirilebilir ve sağlam ve çoğaltılabilir yüksek iş lenme profili oluşturmayı sağlayan basit ve evrensel bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>90604-29-8</td><td>Albümin fraksiyonu V</td></tr><tr><td>Hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSAria III</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sartorius</td><td>A-14C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>Polipropilen santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Falcon (5 mL)</td> <td>Corning</td><td>352052</td><td>Polistiren yuvarlak tabanlı test tüpleri</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi hücre süzgeci (40 & mu; m)</td> <td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe (250 mL)</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı çanak</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD3510-100</td><td>Florodish 35 mm</td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipetleri</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet soketi</td><td>Carl Roth</td><td>388.1</td><td>Pipetleme yardımcısı pi-pump 2500</td></tr><tr><td>Hoechst boyama boya çözeltisi</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Dakika Deterjansız Çekirdek İzolasyon</td><td>Kiti Invent Biotechnologies</td><td>NI-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (30 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>11333704</td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>Petri kabı (90 mm)</td><td>Corning</td><td>758-10178-CS</td><td>Gosselin</td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89079</td><td>10 & L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>Pipetman</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Swann-Morton</td><td>7981809</td><td></td></tr><tr><td>Trikain metan sülfonat</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks makinesi</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-0236</td><td>Vorteks-Cin 2</td></tr></tbody></table>

deterjan ve enzimsiz yöntemle tüm dokudan Çekirdek İzolasyon

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Yüksek iş itimattransom ve epigenom profilleme tek bir hücre veya tek çekirdek süspansiyon hazırlanması nı gerektirir. Bozulmamış hücre veya çekirdekile süspansiyon hazırlanması ayrışma ve permeabilizasyon, istenmeyen gürültü ve istenmeyen hasara neden olabilir adımlar içerir. Özellikle, nöronlar gibi bazı hücre tipleri bireysel hücrelere ayrıştırmak için zor. Ayrıca, hücre zarının çekirdekleri serbest bırakmak için permeabilizasyonu deneme yanılma ile optimizasyon gerektirir, hangi zaman alıcı olabilir, emek yoğun ve mali açıdan cansız. Yüksek iş letim atabilen numune hazırlamanın sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için hızlı bir enzim ve deterjansız kolon bazlı çekirdek izolasyon yöntemini tanımlıyoruz. Protokol, 20 dakika içinde tüm zebra balığı beyninden çekirdeklerin etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. İzole çekirdekleri bozulmamış nükleer morfoloji ve agrega düşük eğilimi görüntüler. Ayrıca, akış sitometri çekirdekleri zenginleştirme ve downstream uygulama için hücresel enkaz temizliği sağlar. Yumuşak dokular ve kültürlü hücreler üzerinde çalışması gereken protokol, başarılı tek çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq deneyleri için gerekli adımları basitleştirerek, yüksek iş yapma lı profilleme için kullanılabilen numune hazırlama için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlar.

--Yukarıda açıklanan protokol, doğrudan zebra balığı beyin dokusundan tek çekirdek süspansiyonu oluşturmak için kullanılmıştır. İzolasyon genellikle 20 dakika gerektirir ve deterjan veya sindirim enzimi kullanmaktan kaçının. Protokolün tek tek adımlarını özetleyen bir şema Şekil 1'deve kılavuz olarak kullanılmak üzere yazdırılabilen bir şema sağlanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg"> Şekil 1: Çekirdek izolasyonu için deterjansız spin-kolon bazlı yöntem şeması. Taze zebra balığı beyin dokusundan çekirdeklerin çıkarılması sırasında yapılan bireysel adımların grafiksel gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Nükleer morfolojinin görselleştirilmesi
Nükleer morfolojinin nitel teyidi için izole edilmiş çekirdekler Hoechst ile boyandı ve floresan mikroskopisi kullanılarak görselleştirildi. Çekirdekler sağlam, yuvarlak ve iyi ayrılmış olarak ortaya çıktı (Şekil 2). Daha da önemlisi, nükleer membran yırtığının bir işareti olan nükleer toplama yoktu.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg"> Şekil 2: Zebra balığı beyninden tek çekirdek izolasyonu. Hoechst lekeli çekirdeklerin bozulmamış morfolojilerini gösteren floresan mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bozulmamış çekirdeklerin FACS tabanlı zenginleşmesi
İzole çekirdeklerin zenginleştirilmesi ve hücresel enkazın çıkarılması, hoechst floresan sinyalinin varlığı üzerine gating edilerek akış sitometrisi ile gerçekleştirilmiştir. Hoechst sinyali menekşe, 405 nm, lazer (Brilliant Violet 421 – BV421) ile uyarma üzerine tespit edildi. Lekesiz çekirdekler arka plan floresan görüntülenen (Şekil 3A, Ek Şekil 1A), lekeli çekirdekleri güçlü floresan sinyal sergilerken (Şekil 3B, Ek Şekil 1B). Şekil 3C'degösterildiği gibi, lekesiz ve Hoechst lekeli çekirdekler menekşe kanalında iyi ayrılmıştır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg"> Şekil 3: İzole çekirdekler akış sitometrisinde güçlü ve spesifik Hoechst floresan sinyali gösterir. Hoechst boyama dağılımını gösteren tek çekirdeksüspansiyoniçin histogram çizimleri. Hoechst menekşe, 405 nm, lazer (Brilliant Violet 421 – BV421) tarafından heyecanlı. Lekesiz örnek(A)100-103aralığında sinyal görüntülerken, Hoechst lekeli çekirdekleri (B) 103-105 aralığında sinyal yontabilir. Lekesiz (gri) ve lekeli (mavi) örnekler(C)tarafından yayılan floresan yoğunluğunun bir bindirme iki popülasyon arasında net bir ayrım göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg"> Ek Şekil 1: İzole çekirdekler için akış sitometri gating stratejisi. İzole çekirdek süspansiyonu için temsili akış çizimleri. İzole çekirdekler ileri dağılım ve 405 nm hoechst heyecanlandıran Violet lazer BV421 kullanılarak analiz edildi. Lekesiz örnek(A),100-103 aralığında BV421 sinyalini görüntüledi. 13130 olaydan 141'i FSC-A'ya (toplamın %1,07'si) dayalı tek çekirdek, BV421 sinyaline (toplamın %0'ı) dayalı lekesiz çekirdekler için 0 olay olarak saptandı. Hoechst lekeli çekirdekleri(B)103-105 aralığında BV421 sinyali görüntüledi. 50000 olaydan 2418'i FSC-A'ya (toplamın %4,84'ü) dayalı tek çekirdek, BV421 sinyaline (toplamın %4,83'ü) dayalı Hoechst-pozitif çekirdekler için 2414 olay olarak saptandı. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Tek bir hücre veya tek çekirdek süspansiyonhazırlanması yüksek iş transkripsiyon ve epigenom profilleme için kritik bir adımdır. Protokolümüz tek çekirdek izolasyonu için basit, tekrarlanabilir ve evrensel bir yöntem sağlar. Çekirdek izolasyonu için deterjan gerektiren diğer yöntemlerin aksine, protokolümüz kolon bazlıdır, bu deterjan ve enzim içermez.30 dakikadan daha kısa sürede çekirdek izolasyonu sağlar. Protokolümüz çekirdek izolasyonuna basitleştirir. Bu zor-dissociate dokulardan tek çekirdek süspansiyon hazırlamak için sağlam bir yöntem sağlar.Başlamak için, deterjansız çekirdek izolasyon kitinden önceden soğutan tampon A ve B, en az 30 dakika buzüzerinde yerleştirin. Kap tüpleri ve pipet uçları ile 5% BSA çözeltisi, hangi çekirdeklerin kurtarma artıracaktır. Pipet uçlarını kaplamak için pipet %5 BSA çözeltisi 2-3 kez ve hava yla iki saat kurutun.Tüpleri kaplamak için, BSA ile doldurun ve üç kez ters çevirin. Çözeltiyi çıkarın ve tüpleri iki saat boyunca temiz bir kağıt üzerinde baş aşağı kurulayın. Coat bir toplama tüpü ve örnek başına bir 1,5 mililitrelik tüp.Kafatasını nazikçe açmak ve yumuşak dokuları, deriyi ve kemikleri kafatasının ventral ve dorsal kenarlarından çıkarmak için forceps kullanın. Sonra yavaşça buz gibi PBS içeren 30 milimetrelik bir çanak içine beyin aktarın ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde beyin kıyma. Tek çekirdekleri izole etmek için, çekirdek izolasyon kitinde sağlanan filtre kartuşuna kıyma dokusunu aktarın ve fazla çözeltiyi çıkarın ve 200 mikrolitre soğuk tampon ekleyin A.Grind iki dakika boyunca plastik çubukla dokuyu öğütün.Filtre kartuşu için 300 mikrolitre soğuk tampon A ekleyin ve kapağı 10 dakika açık buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra kartuşun kapağını kapatın ve tüpü beş kez ters çevirerek dokuyu yeniden askıya alın. Hücreleri yırtmak için örnek tüpü 16,000 kez 30 saniye boyunca santrifüj edin.Akış-through tüp altında renksiz bir pelet oluşturan bozulmamış çekirdekleri içerir. Filtreyi atın ve sonra 10 saniye boyunca şiddetle girdap yaparak peleti yeniden askıya alın. Çözeltiyi 500 kez g'de üç dakika santrifüj ederek çekirdekleri tekrar peletleyin.Sonra dikkatle supernatant atın. Peleti 0,8 mililitre soğuk tampon B'de 2-3 kez borulandırarak yeniden askıya alın ve çekirdekleri 600 kez g'de 10 dakika santrifüj edin, bu da onları membran enkazından ayıracaktır. Supernatant'ı dikkatlice atın.500 mikrolitre PBS'deki izole çekirdekleri %5 BSA ile yeniden askıya alın ve facs'a kadar süspansiyonu buzda tutun. HEX boyama ile nükleer morfolojiyi doğrulamak için, BSA kaplı uçlar kullanarak tek çekirdek süspansiyonunun 100 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. 0,1 mikrolitre HEX ekleyerek ve tüpü yavaşça girdaplayarak çekirdekleri lekelayın.405 nanometrelik lazer uyarma ayarı ile floresan mikroskobu kullanarak çekirdek süspansiyonu cam bir alt çanağa ve çekirdeğin görüntüsüne aktarın. FACS yapmadan önce, 40 mikrometrelik hücresüzü bsa kaplı bir tüpe süzün. Filtrelenmiş süspansiyonu % 5 BSA ile 1.000 mikrolitrelik son hacmine PBS ekleyerek seyreltin.Kontrol ve lekeli olarak iki yuvarlak alt FACS tüpleretiket ve bir BSA kaplı pipet ucu kullanarak kontrol tüpü içine çekirdek süspansiyon 250 mikrolitre aktarın. Çözeltinin kalan 750 mikrolitresini lekeli etiketli FACS tüpüne aktarın ve çekirdekleri lekelemek için bir mikrolitre HEX boya ekleyin. Sonra yavaş girdap tarafından karıştırın.Lekesiz kontrol örneğini hücre ayırıcısına yükleyin ve 5.000 olay kaydedin. Sonra lekeli örnek yük ve 5,000 olaylar kaydedin. Tek çekirdeklerin tanımlanması için FACS kapılarını çizin.Çekirdekler, HEX floresan sinyalinin kontrol ve lekeli numuneler arasında karşılaştırılarak seçilebilir. Daha sonra, lekeli tüpten HEX pozitif çekirdekleri 50 mikrolitre PBS içeren ve %5 BSA içeren 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe sıralayın. Bu protokol doğrudan zebra balığı beyin dokusundan tek çekirdek süspansiyonu oluşturmak için kullanıldı.İzole çekirdekleri HEX ile boyandı ve floresan mikroskopisi ile görselleştirildi. Onlar bozulmamış, yuvarlak ve iyi ayrılmış görünüyordu. Daha da önemlisi, nükleer toplama yoktu.İzole çekirdeklerin zenginleştirilmesi, hex floresan sinyalinin varlığı üzerine gating edilerek akış sitometrisi ile gerçekleştirildi. Lekesiz çekirdekler arka plan floresan ını sergilerken, lekeli çekirdekler güçlü floresan sinyali sergiledi. Lekesiz ve lekeli çekirdekler menekşe kanalında iyi ayrılmıştı.Bu protokolü denerken, tek çekirdeklerin plastik bir malzemeye yapışma eğiliminde olduğunu hatırlamak önemlidir. Çekirdeklerin potansiyel kaybını önlemek ve verimliliği artırmak için, plastik malzemenin temel kaplaması şiddetle tavsiye edilir. İzole tek çekirdekli süspansiyon daha tek çekirdekli RNA için kullanılabilir Bu teknik karmaşık biyolojik sistemlerde hücresel heterojenite açıklığa kavuşturabilir ve hücre alt tipleri ve gen ağlarının tanımlanmasına yardımcı olur.Deterjan ve enzimsiz bir yöntem kullanmak, numune hazırlama sırasında ortaya çıkan teknik gürültü ve önyargıyı kaydeder. Bu yöntem basitleştirilmiş ve lojistik tek çekirdek izolasyonu geliştirmiştir.

nuclei-isolation-from-whole-tissue-using-detergent-enzyme-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Bu videoda, taze donmuş glioma dokusundan tek çekirdekleri izole etmek için kullanılan protokol açıklanmaktadır. İzole edilmiş tek çekirdekler, merkezi sinir dokularının gliomunda gözlenen tümörler arası ve tümör içi heterojenlik hakkında daha derin bilgiler elde etmek için tek çekirdekli RNA (snRNA) dizilemesi ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin (snATAC) dizilemesi için tek çekirdekli Test gibi dizileme teknikleri için örnekler olarak kullanılabilir.

Taze Donmuş Glioma Dokularından Çekirdek İzolasyonu: Glioma Tümör Örneklerinden Sağlam Çekirdek Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Bu video, çeşitli nörolojik uygulamalar için farklı hücre popülasyonlarının incelenmesini sağlayan floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS) kullanarak taze donmuş insan beyin dokusundan çekirdekleri izole etme ve ayırma prosedürünü göstermektedir.

Floresanla Aktive Edilen Çekirdek Sıralaması Kullanılarak Beyin Dokusundan Hücre Popülasyonlarının İzole Edilmesi

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

İntermüsküler yağ dokusunun (IMAT) biyolojisi, insan dokusunun sınırlı erişilebilirliği nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Burada, bu benzersiz yağ deposunun hücresel bileşimini tanımlamak için tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'ının çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi

Koroner endarterektomi doku örnekleri, optimize edilmiş bir dissosiyasyon protokolü kullanılarak tek çekirdekleri izole etmek için işlendi. İzole çekirdeklerin bütünlüğü üç tamamlayıcı yaklaşımla doğrulandı: zar bütünlüğünü değerlendirmek için tripan mavisi dışlama boyama, nükleer morfolojiyi doğrulamak için DAPI tabanlı konfokal mikroskopi ve nükleer verim ile saflığı nicelikten ölçemek için akış sitometrisi.

Koroner Endarter Baypas Grefti Hastalarının Koroner Endarterektomi Dokusundan Tek Çekirdek İzolasyonu

Öğrenin deterjan ve enzim içermeyen yöntemle zebrafish beyin dokusundan çekirdek izolasyonunu. Bu hızlı protokol, tek hücreli epigenom ve transkriptom analizleri için sağlam nükleus hazırlama imkanı sunar.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Daha fazla video keşfet