Name: Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Keşfedin peri-implantasyon aşamasında insan embriyolarında trofoblast hücrelerinin tek hücreli toplanması yöntemini. Bu protokol, erken gebelik kaybı ve implantasyon başarısızlığı mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Colorado Üreme Tıbbı Merkezi'ndeki (CCRM) embriyolarını nazikçe araştırma için bağışlayan birçok hastaya teşekkür etmek istiyoruz. Biz de Karen Maruniak ve CCRM klinik laboratuvar hCG örnekleri işleme yardımları için teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Sue McCormick ve CCRM onun klinik IVF embriyoloji ekibi embriyo toplama, depolama, izleme ve bağış ile yardım için. Finansman ccrm tarafından dahili olarak sağlanmıştır.

Tüm insan embriyoları araştırmada kullanılmak üzere rıza ile bağışlanmıştır. Genişletilmiş insan embriyosu kültürü için protokoller Batı Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma no. 1179872) tarafından onaylanmıştır ve uluslararası yönergeleri izleyin. İnsan embriyolarının herhangi bir şekilde kullanımı, bu protokolü kullanarak araştırma kurumuyla ilişkili uygun etik ve yönetim organları tarafından gözden geçirilmelidir.
1. Hazırlık
<ol><li>Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmasına bir gün önce ortam ve iyileşme plakaları hazırlayın.<ol>
<li>%10 v/v serum protein ikame (SPS) ile 2 mL blastosist kültür ortamı (BM) hazırlayın. NOT: Blastosist kültür ortamı ilave protein içerebilir veya içermeyebilir. Burada, belirtilen albumin proteininin %10'u ile takviye edilmesi gereken bir ortam kullandık. Bu ek varyasyon için üretici kılavuzunu kontrol edin. Tüm ortamlar, dengelemeden önce steril bir şırıngaya bağlı steril 0,22 μM filtre kullanılarak filtrelenmelidir.</li>
		<li>İki merkez-iyi organ kültürü yıkama bulaşıklarını 500 μL BM ile %10 v/v SPS ile doldurun ve 500 μL embriyo kültürü sınıfı yağ ile kaplayın.</li>
		<li>60 mm'lik doku kültürü çanak kısmında, 8 mL'lik embriyo kültür yağı katmanı ve ardından kültür plakasının altına %10 v/v SPS ile 20 μL BM damlası çapalayın. Isınan her embriyo için 1 damla olun. NOT: Gerektiğinde daha fazla ortam, damla ve yıkama yemeği yapılabilir. Damlalar da yağ katmanlı önce çanak eklenebilir. Yağın altına demirleme damlaları buharlaşmayı ve osmolalitedeki sonraki değişiklikleri azaltmaya yardımcı olur.</li>
		<li>BM'yi 37 °C, %6 CO2, %5 O2 ve en az 4 saat boyunca bir kuluçka makinesinde %10 v/v SPS yıkama tabaklarını ve geri kazanım plakasını dengeleyin.</li>
		<li>Genişletilmiş kültür medyasının (IVC1) ilk adımının bir şişesini 4 °C'de veya bankın üstünde eritin.</li>
		<li>500 μL IVC1'lik bir yıkama kabını yağ kaplaması olmadan hazırlayın. Aliquot yaklaşık 4 mL IVC1 5 mL snap kap tüp içine.</li>
		<li>IVC1 yıkama kabını ve IVC1'in küçük snap kap tüpünü 37 °C,%6 CO2 ve atmosferik O2'yi en az 4 saat eve yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmabir gün önce genişletilmiş kültür plakaları hazırlayın.<ol>
<li>Fosfat tamponlu salin (PBS) ile 30 μg/mL arasında insan serumundan gelen fibronektinseyreltin. Odaları kaplamak için embriyo başına 250 μL 30 g/mL fibronektin gerekli olacaktır.</li>
		<li>Kuyulara dokunmamaya özen verirken kaputun altındaki 8 kuyu odalı kapak paketini açın. Hafifçe pipet 250 μL 30 g/mL fibronectin her kuyuya.</li>
		<li>Kapağı odalı kapak kaymasına geri döndürün ve 4 °C'ye 20-24 saat süreyle yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyo ısınma sabah genişletilmiş kültür plakası hazırlayın.<ol>
<li>Fibronektin ile odacıklı coverslip alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. 1 mL pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atık kabına atın.</li>
		<li>Küçük 5 mL snap kap tüpten ısıtılmış, dengelenmiş IVC1 ortamını alın.</li>
		<li>Pipet 300 μL'lik ivc1 her kuyuya. Bu kontaminasyon riskini artıracak gibi herhangi bir sıvı kapağı dokunmasına izin vermemeye dikkat edin.</li>
		<li>IVC1 ile odacıklı kapak kaymasını 37 °C, %6 CO2 ve atmosferik O2'yi 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isınma vitrifiye D5 insan embriyoları
NOT: Diğer üreticilerin kendi vitrifikasyon teknolojisine göre biraz farklı protokolleri olabilir. Gerektiğinde üreticinin kullanım talimatlarına bakın.
<ol><li>35 mm çanak ila 37 °C arasında 3,0 mL erime çözeltisi (TS) sıcak. 300 μL seyreltme çözeltisi (DS) ve 300°L yıkama çözeltisi (WS) kuyusu 6 kuyulukta oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Forceps kullanarak, vitrifiye embriyo her zaman sıvı azot altında kalır sağlarken dikkatle kriyo cihaz kol çıkarın.</li>
	<li>Kriyo cihazını sıvı nitrojenden hızlıca hareket ettirin ve 37 °C'de TS'deki kriyo cihazının ucunu daldırın. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve embriyo TS içine ayrılır kadar cryo cihazı batık tutun. NOT: Sıcak embriyolar, alt akım analizinde hasta demografik bilgileriyle ilgili olabilecekleri için embriyo kimliklerini takip etmek için birer birer.</li>
	<li>TS 1 dk kuluçka sırasında, dikkatle kriyo cihazı kaldırmak ve yavaşça embriyo almak ve TS çanak karşı tarafına taşımak. NOT: Birden fazla embriyo kültüre, uygun kimlikleri nisbete tutulmasını sağlamak için embriyoları ayrı tutmak için gayretli olun.</li>
	<li>1 dakika sonra, yavaşça TS küçük bir miktar ile embriyo almak, yaklaşık 2 μL. Embriyoyu pipetten ince bir TS tabakası nda ts ile kaplarken embriyoyu 300 μL DS'nin altına taşıyın. 3 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve oda sıcaklığında tezgah üst 6 iyi plaka yerleştirin.</li>
	<li>3 dakika sonra, embriyoyu az miktarda DS, yaklaşık 2 μL ile toplayın ve embriyoyu 300 μL WS içeren bir sonraki kuyunun dibine taşıyın. Yine, yavaşça embriyo üzerinde pipet DS küçük bir miktar katman. 5 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üst dönün.</li>
	<li>5 dakika sonra, WS en az hacimli embriyo almak ve 300 μL WS son kuyunun üstüne taşımak. Embriyo yavaş yavaş düşecek ve bünyeden dibe doğru yıkayın. Tutulan herhangi bir WS'yi pipetten boş bir kuyuya at.</li>
	<li>Embriyoyu minimum hacimle toplayıp aynı 300 μL'lik WS kuyusuna geri dönün. Embriyo bir kez daha kuyunun dibine düşecek. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üstüne 6-iyi plaka dönmek.</li>
</ol>3. Isınmış embriyoların geri kazanımı
<ol><li>Birer birer, ısıtılmış embriyoları 500 μL'lik eşitlenmiş embriyo kültürü sınıfı yağın %10 v/v SPS'si ile 500 μL'lik dengelenmiş BM içeren merkezi bir organ dokusu kabına taşıyın.</li>
	<li>Her embriyo yutarak embriyoları yıkayın ve hareket arasında eski medya üfleme sırasında çanak çeşitli alanlara hareket ettirerek. Embriyoyu al ve %10 v/v SPS yağ altında dengelenmis BM'nin 20 μL kültür damlasına taşıyın.</li>
	<li>Isınan embriyolar 37 °C, %6 CO2, %5 O 2'de bir kuvözde 2 saat boyuncaiyileşin.
</li>
</ol>4. Zona kaldırma
<ol><li>2 saatlik bir iyileşmeden sonra, embriyoları yeniden genişleme için değerlendirin ve her embriyonun fotoğrafını çekin.</li>
	<li>Embriyoları tek tek 3-(N-morpholno)-propansülfonik asit (MOPS)-tamponlu işleme ortamı ile %5 (v/v) fetal baldır serumu (FCS) ile asidik Tyrode solüsyonu ile tedaviden önce hareket ettirin.</li>
	<li>Mikroskoptan aktif olarak izlerken bir embriyoyu 300 μL ısıtılmış asidik Tyrode çözeltisi boyunca hızlı bir şekilde hareket ettirin. Zona pellucida görsel olarak erimeye başlayacak. Bu yaklaşık 5 s sürer.</li>
	<li>Hemen 300 μL ısıtılmış MOPS tamponlu orta asit Tyrode çözeltisi söndürmek için zona eriterek embriyo hareket ettirin.</li>
	<li>MOPS tamponlu orta minimal hacmi ile embriyo taşımak bir merkezi iyi organ dokusu çanak içeren 500 μL dengelenmiş BM içeren 10% v / v SPS altında 500 μL dengelenmiş embriyo kültür sınıf yağ yıkamak için.</li>
	<li>Embriyoyu adım 3.2'den 20 μL'lik iyileşme düşüşüne geri döndürün. NOT: Zona çıkarılmasını takiben yapılan görsel incelemede, zona pellucidae'li embriyolar gerekirse asidik Tyrode çözeltisi ile 4.2-4.6 adımlarını tekrarlayarak daha fazla tedavi edilebilir. Tyrode'un çözeltisine en aza indirgin bir şekilde istenir.</li>
</ol>5. Blastosist genişletilmiş kültür
<ol><li>Embriyoları tek tek yıkama kabına, 1.1.6 adımdan eşitlendirilmiş IVC1 ortamıyla taşıyın. Bir embriyoyu, elenmiş IVC1 ile odalı kapaklı bir kuyuya dikkatlice taşıyın ve embriyo tanımlamasını koruyun. NOT: Orta buharlaşmayı en aza indirmek için bu adımın mümkün olan en kısa sürede tamamlanması gerekir.</li>
	<li>37 °C, %6 CO2, atmosferik O2 2 gün boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine döndürül. NOT: 37 °C, %6 CO2, atmosferik O2 ortam değişimi için 4 saat önceden ortamları eritmeye ve dengelemeye dikkat edin.</li>
	<li>D2 'de (D7 sonrası döllenme) embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya alışverişi gerçekleştirin.<ol>
<li>Ortam alışverişinden önce hangi embriyonun yemeğe bağlı olduğunu unutmayın. Plakaya hafifçe dokunun ve bir embriyonun mikroskop altında plakaya güvenli bir şekilde bağlanıp bağlanmadığını inceleyin.</li>
		<li>Kapağı çıkarın ve 150 μL'lik IVC1'i dikkatlice çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemek için atın. Eğer bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC1'deki serum embriyo ekinde yardımcı olacağı için ortam değiştirmeyin.</li>
		<li>Pipet 150 μL denli genişletilmiş kültür ortamı, IVC2, yavaş yavaş her kuyuya ve odacıklı kapak kapağı kapağı na geri dönün. NOT: Orta buharlaşmayı önlemek için kapağın odalı kapak tan çıkarılmasının en aza indirilmesini sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Odacıklı kapak kapağını, kapağın üzerine herhangi bir ortam sıçramadan kuvöze dikkatlice geri döndürün. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar genişletilmiş kültürün her gün medya değişimi ve eki kontrol tekrarlayın.</li>
</ol>6. Harcanan ortamın isteğe bağlı olarak toplanması
<ol><li>İsteğe bağlı olarak, D7'den sonra veya sonraki herhangi bir gün kültür ortamı alışverişi sırasında harcanan medyayı toplayın. Adım 5.3.2 sırasında, orta snap-freeze 150 μL çıkarılan IVC1 steril, düşük bağlayıcı 0,5 mL tüp içine atmak yerine ileride analiz için.</li>
</ol>7. İmmünfluoresans için isteğe bağlı fiksasyon
<ol><li>Herhangi bir hücre dışı enkaz kaldırmak için fiksasyon önce 3x için PBS 1/2 medya alışverişi ile embriyoyıkamak için 200 μL pipet kullanın. Aşırı enkaz ve proteinin yıkanması, netliği optimize etmeye ve immünoresans ile elde edilen görüntülerde arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Tüm ortamları çıkarın ve pbs'deki %4 paraformaldehitin (PFA) 200 μL'sini yavaşça kuyuya ekleyin. Embriyo sıvının yüzeyine yapışmak isteyecektir. Tüm sıvıyı çıkarmadan önce %4 PFA ile birden fazla 150 μL yıkayarak embriyodaki hasarı en aza indirmeye yardımcı olur.</li>
	<li>Fiksasyon için 20 dakika için% 4 PFA embriyolar inkübasyon.</li>
	<li>Embriyoları yıkama başına 10 dakika boyunca 3x yıkayın ve 200 μL %0,1 v/v polisorbat 20 taze PBS'de.</li>
	<li>Sabit embriyoları immünoresans protokolüne geçmeden önce 4 °C'de PBS'de %0,1 v/v polisorbat 20 olarak saklayın.</li>
</ol>8. Trypsin ile tek hücreli sindirim
NOT: Taze (sabit olmayan) embriyolar tek hücreli sindirim için kullanılır.
<ol><li>Embriyoyu 200 μL PBS ile bir kez yıkayın ve her kuyuya 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak lını 5 dakika boyunca kuvöze geri döndürün.</li>
	<li>Odacıklı kapak kapağını kuvözden çıkarın ve embriyoları stereoskop altında inceleyin. Embriyonun çevresinde bulunan hücreler geri çekilmeye başlar ve MTB yine de embriyodan uzakta bulunan tabağa iliştirilmelidir.</li>
	<li>Tüm embriyo parçalamadan önce tek tek MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın. MTB'yi kurtarmak için adım 9.1'e geçin ve adım 9.3'ten sonra adım 8.4'e dönün.</li>
	<li>Embriyoyu hafifçe aşağı yukarı keserek ayrıştırmak için el yapımı mikromanipülasyon pipetveya ağız pipeti kullanın.</li>
	<li>Hücreler tüm embriyodan ayrışmaya başlayacak. Embriyo tripsin toplam 10 dakika kuluçkaya yatırılanakadar daha küçük çaplı pipet ucu veya ağız pipetini kullanarak embriyoyu nazikçe ve tekrar tekrar aspire etmeye devam edin.</li>
</ol>9. Tek hücre seçimi ve örnek toplama
<ol><li>Minimal tripsin ile, herhangi bir hücre kaybetmemek için bakım ile bakım ile embriyo kültürü yağı altında 20 μL PBS + 0.1% polivinilpyrrolidone (PVP) üç yıkama damla ile ayrışmış hücreleri hareket ettirin.</li>
	<li>Hücreleri yıkadıktan sonra, bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın. Tek hücreyi pbs+%0,1 PVP hacmien az olan steril 0,2 mL düşük bağlamalı bir tüpe dikkatlice pipetlayın.</li>
	<li>Tek hücreleri sıvı nitrojende (LN2)tutturun ve ileride kullanım için -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+placentation--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).</li>
<li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+placentation+and+animal+models%3A+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li>
<li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li>
<li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li>
<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li>
<li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).</li>
<li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationals+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li>
<li>Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuettner%2C+KA+%22Embryo+Project+Encyclopedia%22">Embryo Project Encyclopedia</a>. , (2007).</li>
<li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Contributions+to+embryology%22">Contributions to embryology</a>. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li>
<li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Implantasyon yoluyla kültür insan embriyoları için protokolün geliştirilmesi bilim adamları geliştirme daha önce keşfedilmemiş bir zaman keşfetmek için izin verdi8,9. Burada, insan embriyolarını kültürlendirmek ve villous plasenta oluşumundan önce erken trofoblast farklılaşmasını incelemek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanıyoruz. Burada açıklanan yöntemler, tek hücreli alt akış analizinde kullanılmak üzere farklı TB alt tanımlarını toplamamıza olanak s...

İnsan implantasyonu ve erken plasentanın ortaya çıkması tarihsel olarak araştırmak zordur ve büyük ölçüde bilinmemektedir çünkü gebelik klinik olarak saptanamayan bu aşamada insan dokularına erişilemez. Hayvan modelleri yetersizdir, çünkü insan plasentasyonu diğer öther memelilere göre kendine özgü özelliklere sahiptir. Örneğin, insan plasenta diğer hücreler rahim spiral arterler remodel ise bazı trofenlast hücreleri rahim miyometrium en az iç üçte ulaşan ile yaprak içine derinden işgal. Hatta en yakın evrimsel atalarımız, insan olmayan primatlar, plasental morfoloji ve trofenlast etkileşimleri maternal desidualdokular1,2,3ile farklılıklar göstermektedir. 1980'li yıllarda klinik insan in vitro fertilizasyon (IVF) kısırlık tedavisinde rutin bir uygulama olarak başlayana kadar in vitro pre-implantasyon insan embriyolarının in vitro elde edilmesi mümkün değildi4. Şimdi, insan blastosistleri transfer için daha uygun embriyoların seçimi için izin vermek için in vitro yetiştirilebilir, hem de güvenli genetik test sağlamak. Embriyo kültürü tekniklerinde iyileşme, hem de IVF artan kullanımı hastanın tedavi döngüleri tamamlandıktan sonra kalır birçok artı blastosistler vermiştir. Hastanın onayı, IRB onayı ve bazı kısıtlamalar ile bu blastosistler araştırma çalışmaları için kullanılabilir. Onlar insan embriyonik kök hücrelerin türevi için kullanılan paha biçilmez bir kaynak haline gelmiştir5, embriyonik kök hücrelere iç hücre kütlesinin geçiş anlayışı6,7, ve daha yakın zamanda, başarıyla güne kadar kültürlü olmuştur (D) 13 insanimplantasyonuremodel 8,9. Son zamanlarda geliştirilen tek hücreli omik yaklaşımlar kullanarak, Bu implantasyon aşamasında insan embriyo dokularına erişim daha önce10keşfetmek imkansız olan bu son derece dinamik hücre farklılaşma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunmuştur 10,11,12,13.
Burada, insan implantasyonu sırasında trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini karakterize eden son yayınımızda kullanılan yöntemleri açıklıyoruz12. Bu protokol vitrifiye blastosistlerin ısınmasını, D12 sonrası IVF'ye kadar uzatılmış embriyo kültürünü, embriyonun tek hücrelere enzimatik sindirimini ve aşağı akım tahlilleri için hücre toplamayı içerir (Şekil 1). Bu genişletilmiş kültür sistemi anne girişi olmadan peri-implantasyon aşamasında insan embriyo gelişimini destekler ve yıllar önce histolojik örneklerden yapılan gözlemler ile tutarlı görünen trophoblast farklılaşması özetler14,15,16,17. İmplantasyon sırasında trofoblast popülasyonu en az iki hücre tipinden oluşur: mononükleli progenitor benzeri sitotrophoblast (CTB) ve ölümcül diferansiye, multinükleatlı sintiyotrophoblast (STB). Tripsin sindirimi üzerine, CTB morfolojik olarak diğer hücre soylarından ayırt edilemeyen küçük yuvarlak hücrelerdir(Şekil 2A, sol panel). CTB'nin epiblast ve ilkel endoderm gibi diğer hücre soylarından ayrılması, tek hücreli RNA dizilimi ile ortaya çıkan farklı transkripsiyon profilleri ile elde edilebilir. Syncytiotrophoblast hücreleri kolayca diğer hücre tiplerinden önemli ölçüde daha büyük ve esas olarak embriyo nun çevresinde bulunan düzensiz şekilli yapılar olarak tanımlanabilir (Şekil 2A, orta panel; Şekil 2B, sol panel). Göçmen trofoblast hücreleri (MTB) embriyo genişletilmiş kültür sırasında bulunan başka bir trofoblast alt çizgi ve görünüşte embriyoana gövdesinden hareket olarak kabul edilebilir(Şekil 2A, sağ panel, Şekil 2B, sağ panel). Göçmen trofoblast, ekstra villous trofoblast (EVT) ile aynı belirteçlerin çoğunu ifade etmesine rağmen, plasentadaki villous yapılar gelişmenin bu çok erken evresinde ortaya çıkmadığından, EVT olarak adlandırılmamalıdır.
Deneysel olarak, embriyolar D8, D10 ve D12'de tek hücrelere sindirildikten sonra kolayca ayırt edilebilen küçük CTB ve büyük STB'yi toplayabildik(Şekil 2A,B). Göçmen trofoblastlar genişletilmiş embriyo kültürünün ileri evrelerinde ortaya çıkar ve tüm embriyonun enzimatik sindiriminden önce D12'de toplanabilir(Şekil 2A,B). Bu üç trofoblast alt çizgisini tek hücre analizinden önce fenotipik olarak ayırarak, spesifik transkripsiyonel belirteçleri ve her hücre türünün biyolojik rolünü tanımlayabiliriz. Sitotrophoblast son derece proliferatif ve STB ve MTB farklılaştırılmış soy10,11,,12,13temininde progenitor hücreleri olarak hareket. Syncytiotrophoblast gebelik korumak için plasental hormonlar üretiminde yer alan ve aynı zamanda endometrium içine oyuk embriyolar sorumlu olabilir10,11,12,13. Göçmen trofoblast bir invaziv, göçmen fenotip daha güçlü özelliklere sahiptir ve muhtemelen rahim endometrium10,11,,12,13daha derin ve daha geniş kolonizasyon sorumludur. Her hücre tipinin transkripsiyon analizi, her hücre tipinin transkripsiyon izini tanımladıktan sonra, ctb'den morfolojik olarak ayırt edilemeyen ve sırasıyla12'de STB ve MTB özelliklerine sahip transkripsiyonlara sahip iki ek hücre alt kümesini ortaya çıkarmış bulunmaktadır. Bu ara evre hücreler, CTB'den MTB veya STB alt geçitlerine ayırt etme sürecinde dir ve embriyolar körü körüne sindirilseydi ve hücreler tek başına transkripsiyonla ayrılsaydı gözden kaçırılırlardı.
Burada açıklanan protokol iki boyutlu (2D) kültür sistemi kullanır ve yeni geliştirilen 3D kültür sistemi13açıklayan yeni bir yayın tarafından önerilen üç boyutlu (3D) yapısal gelişimi desteklemek için en uygun olmayabilir. Yine de, bu 2D sistemde erken trofoblast farklılaşması in vivo örnekleri14,15,,16,17yapılan gözlemler ile tutarlı gibi görünüyor. Bu protokol, en az değişiklikle en son tanımlanan 3B kültür sistemi13'teki kullanıma da kolayca uyarlanabilir. Tüm adımlar, ticari olarak kullanılabilen tek kullanımlık uçlar veya kauçuk boru, filtre ve ağızlık bağlı ince çekilmiş cam pipet bir ağız pipet ile bir el mikromanipülasyon pipet ile gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>NORM JECT Luer Lock steril şırınga</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>100'lük Paket</td></tr><tr><td>3130 veya 3110 Forma Seri II su ceketli CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Corning Primaria doku kültürü kabı</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>500 Kutu</td></tr><tr><td>5 mL geçmeli tüp</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>25'li Paket</td></tr><tr><td>60 mm Corning Primaria doku kültür kabı</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>200 kasa</td></tr><tr><td>6 kuyulu çanak</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>1, 10 veya 50'lik</td></tr><tr><td>Paket Asidik Tyrode çözeltisi</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 & mikro; L pipet uçları</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>960</td></tr><tr><td>Paket Blast, blastosist kültür ortamı</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Seyreltme Çözeltisi</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipetleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5.75 inç. (146 mm); 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo kültürü parafin yağı OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tüpleri 0.2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>1.000</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tüpü paketi 0.5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td> İnsan plazmasından <td>500</td></tr><tr><td>Fibronektin vakası. Sıvı% .1 çözelti</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 ve mikro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 & L</td></tr><tr><td>Gilson 200 ve mikro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 & mikro; L</td></tr><tr><td>G-MOPS taşıma ortamı</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Taşıma ortamı</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 iyi odacıklı lamel</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Kutu başına 15 slayt</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Hücre Yönlendirme Sistemleri</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5 mL alikotlar</td></tr><tr><td>K Sistemi T47 Isıtma Plakası</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Durapore PVFD Membranlı Steril Şırınga Filtreleri</td><td>Fisher Scientific SLGVR33RS</td><td></td><td>50'lik</td></tr><tr><td>Paket Ağızlıklar</td><td>Tüp Bebek</td><td>Mağazası MP-001-Y</td><td>100 adet</td></tr><tr><td>Oosafe merkez kuyu tabağı</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>500</td></tr><tr><td>Kasa Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Ağız parçaları için kauçuk lateks boru</td><td>Tüp Bebek Mağazası</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 ft.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Striptizci uçları</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 & mikro; m</td></tr><tr><td>Çözdürme Çözeltisi</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>Striptizci Mikropipetleyici</td><td>Cooper Cerrahi</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Ekspres Enzim (1X), fenol kırmızısı yok</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>12604013 1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL şişe</td></tr><tr><td>VWR 1-20 ve mikro; L pipet uçları</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>960 VWR</td></tr><tr><td>1-200 & L pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>960</td></tr><tr><td>Paket Yıkama Solüsyonu</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

peri-implantasyon aşamasında trophoblast hücrelerinin tek hücre li hücre koleksiyonu İnsan embriyoları

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

İnsan implantasyonu, rahim yüzeyi epitelinin afipozve yapışıklığı ve blastosistin maternal decidua invazyonu, teknik ve etik sınırlamalar nedeniyle tarihsel olarak incelenmesi zor olan kritik ama esrarengiz bir biyolojik olaydır. İmplantasyon trophektoderm gelişimi ile erken trofoblast ve daha sonraki farklılaşma farklı trofoblast alt alt larına doğru başlatılır. Anormal erken trofoblast farklılaşması implantasyon yetmezliğine, plasental patolojilere, fetal anormalliklere ve düşüklere yol açabilir. Son zamanlarda insan embriyolarının, insanlarda implantasyon dönemini kapsayan bir zaman dilimi olan anne dokularının yokluğunda 13. Bu, araştırmacılara, anne etkilerini şaşırtmadan ve erken embriyo farklılaşma olaylarını in vivo'da incelemek için doğal engellerden kaçınmadan, bu kritik dönemde insan implantasyonunu araştırma ve trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini özetleme fırsatı vermiştir. İmplantasyon sırasında farklı trofoblast alt çizgilerini karakterize etmek için, mevcut iki boyutlu (2D) genişletilmiş kültür yöntemlerini benimsedik ve alt akım tahlilleri için farklı tipte trofenlast hücrelerini enzimatik olarak sindirmek ve izole etmek için bir prosedür geliştirdik. 2B koşullarda kültürlenen embriyolar göreceli olarak düzleştirilmiş morfolojiye sahiptir ve in vivo üç boyutlu (3D) embriyonik mimarilerin modelilmesinde suboptimal olabilir. Ancak, trophoblast farklılaşması, genişletilmiş kültür boyunca beklenen morfoloji ve gen ekspresyonu değişikliklerinden de anlaşıldığı gibi daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. Sitotrophoblast, syncytiotrophoblast ve göçmen trofoblast ı da dahil olmak üzere farklı trofoblast alt ları boyut, yer ve zamansal doğuşile ayrılabilir ve daha fazla karakterizasyon veya deney için kullanılabilir. Bu erken trofenlast hücrelerinin araştırılması insan implantasyonunun anlaşılmasında, yaygın plasental patolojilerin tedavisinde ve gebelik kaybı nın görülme sıklığının azaltılmasında etkili olabilir.

Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilediler (Şekil 2B). Anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar (Şekil 2C<img alt="Figure 1" class="xfigi...

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Birçok gebelik yedi veya sekiz post-fertilizasyon etrafında insan embriyo gelişiminde erken başarısız. Bu protokol, araştırmacılara bu gizemli implantasyon sırasında insan kavramlarını in vitro olarak yetiştirme fırsatı sunuyor. Bu bize insan implantasyonu ve erken plasental oluşumunun başarısını destekleyen mekanizmaları anlamak için izin verir.Peri-implantasyon aşamasında insan embriyoları in vitro büyümek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanarak muhtemelen implantasyon ve erken trophoblast farklılaşma çalışma otantik malzemeler elde etmek için tek yoldur. Bu basit teknik bize insan erken gelişimi hakkında birçok temel sorulara cevap sağlayan güçlü bir araçtır. Bu protokolün kullanımı ile yapılan araştırmalar, erken gebelik kaybı, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve plasenta patolojilerinin anlaşılmasına büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.Prosedürü gösteren Deirdre Logsdon, bir laboratuvardan doktora öğrencisi olacaktır. Bir gün önce embriyo ısınma, steril bir laminar akış başlık medya ve kurtarma plakaları hazırlamak. İki merkezi iyi organ kültürü% 10 SPS ile BM 500 mikrolitre ile yıkama yemekleri doldurun, sonra embriyo kültürü sınıf yağ 500 mikrolitre ile BM kapağı.16 milimetrelik doku kültürü çanak, embriyo kültür yağı tabaka sekiz mililitre ve çapa 20 mikrolitre BM damla ile 10% SPS altına. Yıkama bulaşıklarını ve geri kazanım plakasını en az dört saat boyunca 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve %5 oksijen le bir kuvözde dengeleyin. Aliquot yaklaşık dört mililitre IVC 1 beş mililitrelik bir çırpıda kapak tüp içine ve hiçbir yağ bindirme ile IVC 1 500 mikrolitre ile bir yıkama çanak hazırlamak.En az dört saat boyunca kuvözde çanak ve tüp dengeleyin. PBS'deki insan serumundan mililitrebaşına 30 mikrograma kadar fibronektin seyreltin. Kuyulara dokunmamaya özen tayarak sekiz iyi odalı kapaklı paketi açın, ardından her kuyuya 250 mikrolitre fibronektin pipeti yavaşça alın.Kapak kapağını değiştirin ve 20 ila 24 saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Embriyo ısınma sabahı genişletilmiş kültür plakası hazırlayın. Fibronektin ile odacıklı kapak kayma alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin.Sonra bir mililitrelik pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atın. Pipet 300 mikrolitre her bir kuyuiçine dengelemiş IVC 1 ve zona pellucida kaldırılana kadar kuvöz içine coverslip yerleştirin. Isınma ve D5 insan embriyolarının kurtarma sonra, yeniden genişleme için bunları değerlendirmek ve her embriyo nun fotoğraflarını çekmek.Her embriyoya 500 mikrolitre mops tamponlu kullanım ortamı %5 FCS ile taşıyın. Sonra metin el yazması açıklandığı gibi asidik Tyrode çözeltisi ile tedavi. Hemen Tyrode çözeltisi bastırmak için ısıtılmış MOPS tamponlu orta 300 mikrolitre içine eriyen zona ile embriyo taşıyın.Sonra embriyo kültür sınıf yağı altında% 10 SPS ile dengede BM içeren merkezi bir iyi organ dokusu çanak içine embriyo taşıyın. Sonra 20 mikrolitre lik iyileşme düşüşüne embriyoyu geri getirin. Tek tek elenmiş IVC 1 medya ile yıkama çanağı için embriyolar hareket ettirin, sonra dikkatle odacıklı coverslip bir kuyuya her embriyo taşımak, embriyo kimlik takip emin olun.Odacıklı kapak kaymasını 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve atmosferik oksijenolarak belirlenen bir kuluçka makinesine iki gün boyunca geri verin. Büyüme nin ikinci gününde, embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya değişimi. Plakaya hafifçe dokunarak hangi embriyonun tabağa bağlı olduğunu bilin.Ortamı değiştirmek için kapağı çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemeye özen gösterip 150 mikrolitre IVC 1'i dikkatlice aspire edin. Bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC 1'deki serum bağlanmaya yardımcı olacağı için ortam değiştirin. Yavaş yavaş pipet 150 mikrolitre liblibed genişletilmiş kültür medya, IVC 2 her kuyuya ve kapak kapağı değiştirin.Dikkatlice odacıklı kapak kayma kuvöze döndü. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar her gün ortam değişimi ve eki kontrol tekrarlayın. Daha fazla analiz için harcanan ortamın toplanması gerekiyorsa, çıkarılan IVC 1'in 150 mikrolitresini steril bir düşük bağlama 0,5 mililitrelik tüpe tutturun.Her embriyo200 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın, sonra her kuyuya 200 mikrolitre tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak fişini beş dakika lığına kuvöze geri verin. Tek bir MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın sonra yavaşça yukarı ve aşağı uyararak embriyo ayrıştırmak için daha büyük bir pipet kullanın.Embriyo tripsin içinde toplam 10 dakika kuluçkaya yatana kadar daha küçük çaplı pipet ucunu kullanarak embriyoyu hafifçe ve tekrar tekrar kullanmaya devam edin. Tek hücre seçimi gerçekleştirmek için, herhangi bir hücre kaybetmemeye dikkat alarak, embriyo kültür yağı altında PBS ve% 0.1 PVP 320 mikrolitre yıkama damla ile ayrıştırılmış hücreleri hareket ettirin. Hücreler yıkandıktan sonra bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın.Tek hücreyi, pbs ve PVP hacmi en az olan steril 0,2 mililitrelik düşük bağlama tüpüne dikkatlice pipetlayın. Sıvı nitrojen serbest tek hücreleri snap ve daha fazla kullanım için negatif 80 santigrat derece saklayın. Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilerken, anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar.Sekizinci gün döllenme sonrası, embriyolarda çoğu hücre sitotrophoblast veya CTBs, bu trhoblast marker GATA-3 için pozitif idi. Embriyonun çevresinde, CTB'ler zaten çok çekirdekli senytiotrophoblastlar, görünüm gibi bir levha vardı ve insanlar Için pozitif vitral. 10. günde, CGB pozitif göçmen trofoblast hücrelerinin oluşumu maksimum, bu zamanda HCG üretiminin yükselişi ile doğrulandı.HLA-G pozitif boyanmış göçmen trofoblastlar da ortaya çıkmaya ve embriyo gövdesinden uzaklaşmaya başladılar. 12. gün itibariyle STB farklılaşması azaldı ve MTB üretimi daha belirgin hale geldi ve 10. Bu değişiklikler peri-implantasyon döneminin zaman atlamalı videosunda görülebilir.Video blastocele çöküşünü gösterir, STB oluşumu, ve nihai farklılaşma ve MTB göç. Bu işlemi tamamlarken akılda tutulması gereken en önemli şey, sıcaklık, osmolalite ve pH değişikliklerine duyarlı canlı embriyolar ile çalışıyor olmasıdır. Bulaşıkların kuvözdışında olduğu süreyi en aza indirmek embriyo sağlığını korumak için çok önemlidir.Bu prosedürü tamamladıktan sonra, araştırmacılar, insan implantasyonu ve erken plasenta oluşumu sırasında epigenetik ve transkripsiyonel değişiklikleri daha iyi anlamak için tek hücreli RNA dizilimi ve tüm genom bisülfit dizilimi gibi tek hücreli omik testler için izole edilmiş tek hücreleri kullanabilirler.

single-cell-collection-trophoblast-cells-peri-implantation-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trofoblast dev hücreleri (TGC'ler), sağlıklı bir hamilelik sağlamak için plasentada anahtar bir rol oynar. İmplantasyon sonrası embriyoların kriyostat kesitleri veya embriyonik 7. gün ektoplasental konilerin kısa süreli kültürleri üzerinde yeni ortaya çıkan floresan in situ hibridizasyon ile TGC'lerdeki genlerin transkripsiyonel durumunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Mevcut protokol, trofoblast hücreleri gibi hücrelerin, hücre dışı bazal membran matrisinin bir tabakası üzerinde kılcal benzeri yapılar halinde organize olduğu klasik in vitro anjiyogenez-tüp oluşum testinde oluşan tüp benzeri yapıların geri kazanılmasına izin verir. Geri kazanılan yapılar, çeşitli biyokimyasal analizler için RNA ve protein izolasyonu için kullanılır.

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Keşfedin peri-implantasyon aşamasında insan embriyolarında trofoblast hücrelerinin tek hücreli toplanması yöntemini. Bu protokol, erken gebelik kaybı ve implantasyon başarısızlığı mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Daha fazla video keşfet