Name: Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Keşfedin, Thermonectus marmoratus embriyolarında RNA girişimi ile gen fonksiyonlarını çalışmak için mikroenjeksiyon tekniğini. Bu yöntem gelişim biyolojisi ve davranış araştırmalarında güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz editör yardım için Sunburst Dalış Beetles ve Tamara Pace yetiştirme onun yardım için biyoinformatik Hailey Tobler ile yaptığı yardım için Dr Josh Benoit teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı tarafından EKB'ye IOS-1456757 ve IOS-1856341 ve YT'ye IOS-1856341 hibeleri kapsamında desteklenmiştir.

<ol><li>Muller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms+-+A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Model organisms - A historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Westerman, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aristaless+Controls+Butterfly+Wing+Color+Variation+Used+in+Mimicry+and+Mate+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice.</a> Current Biology. 28, 3469(2018).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+behind+the+three-way+stochastic+choices+that+expand+butterfly+colour+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision.</a> Nature. 535, 280(2016).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).</li>
<li>Meister, G., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+gene+silencing+by+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.</a> Nature. 431, 343-349 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Agrawal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+Biology%2C+mechanism%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA interference: Biology, mechanism, and applications.</a> Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657(2003).</li>
<li>Gu, L. Q., Knipple, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+RNA+interference+research+in+insects%3A+Implications+for+future+insect+pest+management+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies.</a> Crop Protection. 45, 36-40 (2013).</li>
<li>Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+developmental+analysis+of+Drosophila+and+Tribolium+reveals+conserved+and+diverged+roles+of+abrupt+in+insect+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution.</a> Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Co-options+of+Exoskeleton+Formation+during+Wing-to-Elytron+Evolution+in+Beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles.</a> Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29%3A+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>ZarinKamar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pax+gene+eyegone+facilitates+repression+of+eye+development+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium.</a> Evodevo. 2, 15(2011).</li>
<li>Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle%2C+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52059(2014).</li>
<li>Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+lens+for+a+complex+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">A complex lens for a complex eye.</a> Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).</li>
<li>Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeku%2C+O+%22RNA%2C+Methods+In+Molecular+Biology%22">RNA, Methods In Molecular Biology</a>. , Springer. 107-122 (2011).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Systemic+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+Affecting+the+Efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi.</a> Plos One. 7, (2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhilip%2C+BN+%22Molecular+Methods+for+Evolutionary+Genetics%22">Molecular Methods for Evolutionary Genetics</a>. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).</li>
<li>Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localisation+of+the+White%2FScarlet+ABC+transporter+to+pigment+granule+membranes+within+the+compound+eye+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster.</a> Genetica. 108, 239-252 (2000).</li>
<li>Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase+2+is+the+phenoloxidase+gene+required+for+beetle+cuticle+tanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).</li>
<li>Werner, S., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+step-wise+eye+growth+in+molting+diving+beetle+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).</li>
<li>Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+via+Embryonic+RNAi+in+Spider+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos.</a> Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).</li>
<li>Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+in+Crustaceans%3A+From+Basic+Research+to+Biotechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies.</a> Genes. 4, 620-645 (2013).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+KY+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).</li>
<li>Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+network+controlling+glial+development+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system.</a> Development. 142, 2184(2015).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+doublesex1+expression+in+Daphnia+pulex+Leydig%2C+1860+%28Cladocera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crustaceana%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera).</a> Crustaceana. 92, 137-154 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+shrimp+and+potential+applications+in+aquaculture%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture.</a> Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+KDB+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).</li>
<li>Crumiere, A. J. J., Khila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+genes+mediate+the+escalation+of+sexually+antagonistic+traits+in+water+striders%5BTitle%5D)+AND+%22Biology.+Letters%22%5BJournal%5D)">Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders.</a> Biology. Letters. 15, 5(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Amacımız, bu yöntem derlemesi RNAi'yi yaygın olarak kullanılabilir hale getirecektir, özellikle de bu araç CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemesi için güçlü bir sinerjik teknik olmaya devam ettiği için, incelenen organizmaların istenilen gelişim evrelerine uygulanabileceği avantajıyla. Bu gücü örneklemek için dsRNA'yı embriyolara ve farklı larva aşamalarına enjekte ettik. Yumurtalara yapılan enjeksiyonlar embriyoların gelişimini etkilemiştir(Şekil 2),ikinci larva evresine yapılan enjeksiyonların üçüncü larva evresinde belirgin etkileri vardı (Şekil 4 ve Şekil 6), üçüncü larva evresine yapılan enjeksiyonlar erişkinlerde etkili oldu(Şekil 5). Tam zamanlama deneysel olarak belirlenmek zorunda olsa da, genellikle, enjeksiyonlar birkaç gün içinde yürürlüğe girer. Bu işlemin başarısı dsRNA dizisinin uzunluğundan etkilenebilir. Burada, 800 bp'den biraz fazla 200 bp kullanarak örnekler sunduk. Genel bir kural olarak, 100 ve 600 bp arasındaki diziler hedef dışı efektleri sınırlamak için tercih edilir, ancak 1000 bp'ye kadar olan diziler iyi sonuçlar verir22. RNAi ile ilgili bir soru bu teknik ile elde edilebilir nakavt süresidir. Fenotipler her aşamada terminal olduğundan, sunulan sonuçlara dayanarak bu konuda yorum yapamayız. Ancak, daha önce RNAi etkileri genellikle nispeten uzun ömürlü olduğunu ve yüksek konsantrasyonlarda daha uzun süreli knockdowns yol dikkat edilmiştir20.
Bu tekniğin bir sınırlama diğerlerine göre bazı organizmalar için daha iyi çalışıyor olmasıdır, ve ne kadar iyi bir priori çalışacağını tahmin doğrudan bir yolu var gibi görünüyor. Bununla birlikte, farklı organizmaların geniş bir yelpazede iyi çalışması bulunmuştur. Eklembacaklılar içinde, bu araknids içerir26, kabuklular27, ve böceklerin çeşitli, böceklerde özellikle yüksek başarı oranları ile28. Bir diğer komplikasyon da, aynı miktarda dsRNA uygulanmasına rağmen bireyler arasında fenotip şiddetinde farklılıklar ın meydana gelmesidir. Şekil 2B'degösterildiği gibi, varyasyon bir birey içinde bile oluşabilir. T. marmoratus larva göz gelişiminde yer alan farklı genleri hedef alan RNAi çalışmalarımızda, bazı gözlerin diğerlerinden daha ciddi şekilde etkilendiğini sık sık gördük. Bu fenomen göz kümesinin nispeten yoğun doku ile ilgili olabilir, dsRNA daha iyi bazı birimleri ulaşmak mümkün.
RNAi deneylerinin başarılı bir şekilde yürütülmesi için, hedef gen için çeşitli parametrelerin optimize edilmiş olması önemlidir. Örneğin, dsRNA konsantrasyonu ve hedeflenen genin uzunluğu kuvvetle sonucu etkileyebilir20. Bu işlem hayatta kalma oranını büyük ölçüde etkileyebildiği için, bir diğer kritik parametre de enjeksiyonların nasıl yürütüldedildiğidir. Embriyolar için, embriyonun merkezini hedefleyerek en iyi sonuçları elde ettik. İyi hazırlanmış bir tabak, tek bir seansta 100 veya daha fazla embriyo enjeksiyonuna olanak tanır. Larvalar için enjeksiyon iğnesinin segmentler arasına yerleştirilmesi çok önemlidir. Bu enjeksiyonlar daha fazla dsRNA gerektirir ve larva larına uygunluğunu temel alan enjeksiyon setlerimiz genellikle bir seferde sadece birkaç hayvandan oluşuyordu. Tüm enjeksiyonlar için havanın organizmaya girmesini önlemek çok önemlidir.
Bazı durumlarda, bir gen düzenleyici ağ ve genetik fazlalık geribildirim döngüleri Tutarlı knockdowns rağmen, RNAi fenotiplerin penetrasyon etkileyebilir. Bu önemli bir lens proteini, Lens318son derece başarılı knockdowns ile larva bizim davranışsal gözlemler için durum gibi görünüyor . Bu nakavtların yüksek verimliliğini qPCR ile doğrulasak da, ilişkili fenotiplerde önemli farklılıklar gözlenmiştir. Bu sonuç, RNAi knockdowns düzgün niceleme gerekliliğini vurgulamaktadır (seçenekler hakkında ayrıntılı bilgi içinbkz. 22). Ortaya çıkan fenotipler ile ilgili net bir priori beklentisi yoksa, RNAi'nin hedef dışı etkilerini kontrol etmenin iyi bir yolu aynı geni iki örtüşmeyen dsRNA dizisiyle hedeflemek ve ortak fenotiplerin sonuçlarını değerlendirmektir.
Gen düzenleme tekniklerinin aksine, RNAi aynı zamanda ölümcül genleri incelemek için güçlü bir araçtır ve bunu yapmanın iki yolu vardır. Örneğin, gelişmenin erken dönemlerinde fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen bir genin işlevsel katkısı yla ilgileniyorsanız, böyle bir genin fonksiyonel bir incelemesi sadece hayvanın normal gelişimine izin vererek ve daha sonra geliştirmede (yani yetişkinde) RNAi ile geni devirerek elde edilebilir. Alternatif olarak, tam fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen bir gen kısmi bir nakavt yoluyla araştırılabilir, bu da bir dizi dsRNA konsantrasyonu enjekte edilerek elde edilebilir. Bazı sonuçlarımız, böceklerdeki miğverin aşırı yumuşak olması durumunda öldürücü olduğu bilinen lac2'ninyıkılışlarını göstermektedir24. Şekil 5'te betimlenen lac2 RNAi böceğinin bile laboratuvar koşulları dışında hayatta kalması pek olası değildir. Başka bir ölümcül gen kesilir, eklembacaklılar çeşitli organ sistemlerinde hücre kaderi özellikleri için temel bir transkripsiyon faktörü için kodları ve Drosophila görme sisteminde glia gelişimi ile bağlantılı olmuştur29. T. marmoratus embriyolarındaki kesik RNAi ile ilgili deneyimimize dayanarak, embriyonik göz gelişimini (yayınlanmamış gözlemler) tamamlayabilen embriyolarda bilgilendirici göz fenotiplerini çağrıştırabiliriz. Burada, daha yüksek dozlarda yüksek öldürücüoranları yol görünür, düşük dozlarda gözlemlenebilir ve bilgilendirici fenotipler neden iken.
Protokolümüz sadece bir araştırmacı nın T. marmoratusüzerinde RNAi deneylerini sürdürmesi için gerekli adımları listelemekle kalmıyor, aynı zamanda genellikle diğer organizmalar, özellikle de sucul organizmalar için de geçerlidir. Sucul organizmalar arasında, su pireleri Daphnia30 ve karides gibi kabuklular içinde zaten birkaç örnek vardır (yeni bir inceleme için, referans31bakınız). Sucul böcekler arasında bol miktarda fırsat vardır, çünkü tüm böcek çeşitliliğinin yaklaşık %6'sını oluşturduğu tahmin edilmektedir, muhtemelen 200.000'den fazla tür32. Ayrıca, RNAi zaten su ortamlarının yüzeyinde yaşama eğilimindedir su striders üzerinde yapılmıştır33. Genom yoksa, bir transkripsiyon de novo monte edilebilir. Bu süreç birkaç yüz nükleotitin bitişiklerini ortaya çıkardığı sürece, belirli genlere karşı dsRNA tasarlanabilir. Agarose'daki böcekleri hareketsiz hale getirme protokolümüz, özellikle yumuşak, yumuşak ve sucul organizmalar için diğer işlemler için de yararlı olacaktır. Birlikte ele alındığında, RNAi organizmaların farklı bir grup gen ekspresyonu manipüle etmek için güçlü bir teknik olmaya devam etmektedir, başka moleküler ve genetik araçlar mevcut olsa bile.

Belirli genlerin farklı özelliklerin evrimine nasıl katkıda olduğu sorusu biyolojide heyecan verici bir konudur. Son birkaç on yıl içinde, çok ilerleme nematode Caenorhabditis elegansgibi birkaç model organizmalar, gelişimsel süreçlerin genetik temelleri diseksiyon ile ilgili olarak yapılmıştır , meyve sinek Drosophila melanogaster, ve ev fare Mususculus1. Daha yakın zamanda, kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas92 gibi güçlü gen düzenleme tekniklerinin icadı, model olmayan organizmaların genetik kodunu değiştirme olanağı sağlamıştır (örneğinbkz. 3,4). Sonuç olarak, daha önce moleküler tekniklerle yaklaşılmayan çeşitli organizmalar üzerinde yapılan genetik çalışmalarda bir artış olmuştur. Sadece belirli türlerde temsil edilen birçok ilginç özellik veya özellik varyansları ile hayvan krallığımızın muazzam çeşitliliği göz önüne alındığında, bu ilerleme evrimsel gelişimsel biyoloji ("evo-devo") ile ilgili çalışmalar için heyecan verici bir zaman almıştır. Ancak, model olmayan organizmalar için mevcut olan genom düzenleme teknikleri, uygulanabilecekleri gelişimsel zaman noktaları açısından nispeten kısıtlanmıştır, bu da belirli genlerin herhangi bir özellikte oynadığı role ilişkin zamansal özellikleri ayırt etmeyi zorlar. Buna ek olarak, transgenik teknikler genellikle hayatta kalmak için gerekli olmayan genler ile sınırlıdır (yani, nakavt öldürücülük ile sonuçlanmaz). Bu nedenle, gen düzenleme teknikleri popüler olmaya başlamış olsa da, belirli gelişimsel zaman noktalarında farklı organizmaların çeşitli uygulanabilir etkili teknikler için bir ihtiyaç kalır ve kısmi knockdowns kolaylaştırmak (yerine tam fonksiyon kaybı). Burada, gen düzenlemeye sinerjik bir yaklaşım olarak özellikle değerli olan, biraz tarihli ama güçlü bir gen yıkma tekniği5 olan RNA girişimine (RNAi) dikkat çekiyoruz. Özellikle, gerekli moleküler dizilerin elde edilmesinden çift iplikli RNA'nın (dsRNA) yumurta ve larvalara başarılı bir şekilde enjeksiyonuna kadar bu tekniğin uygulanmasını gösteren bir örnek olarak rnai'nin sudalış böceklerine uygulanmasına olanak tanıyan prosedürler geliştirdik.
RNAi tabanlı gen nakavt, dsRNA moleküllerinin virüsler ve transpozonlar 6 gibi istilacı nükleik asit dizilerinin susturulması kolaylaştırdığı doğuştan gelen bir savunma mekanizmasındanyararlanır. Kısaca, dsRNA hücreiçine alınır ve Dicer enzimi tarafından 20-25 nükleotit parçasına bölünerek kesilir. Bu parçalar daha sonra kılavuz iplikçik kullanarak belirli sitelerde bağlanarak hedeflenen mRNA inhibe RNA kaynaklı susturma kompleksi (RISC) oluşumunu etkinleştirin. Bu süreç sonuçta mRNA bozulmasına yol açar ve bu nedenle ilgili proteiniçinemRNA çeviri ile müdahale 6 . Burada sunulan RNAi tabanlı gen nakavt tekniği bu nedenle dsRNA enjeksiyonuna dayanır. Hayvan modelleri için, bu teknik aslında C. elegans7 ve D. melanogaster8 geliştirilmiştir ama o zamandan beri olmayan model organizmalarda güçlü bir fonksiyonel genetik araç olarak ortaya çıkmıştır9,10. Bazı böceklerde son derece etkili doğası nedeniyle, RNAi bile haşere yönetimi11uygulanabilir.
Bir araştırma aracı olarak RNAi, geleneksel olmayan böcek modellerinde temel moleküler gelişimsel yolların nasıl çalıştığını incelemek için kullanılmıştır. Örneğin, un böceği Tribolyum kasten içinde RNAi nasıl derinden korunmuş genler bu böcek belirli özelliklere katkıda belirleyici olarak özellikle şekillikanatlarıngelişimi için örnekolmuştur 12,13,14 ve gözler 15,16.16 T. castaneum'daki manipülasyonların altında yatan teknikler17 yaşında iyi tanımlanmıştır ve yapışkan bir yüzeyde nispeten kuru yumurta ve larvaları hareketsiz hale getirme yeteneğine dayanır. Böyle bir immobilizasyon ancak Sunburst Dalış Böceği Thermonectus marmoratusgibi sucul organizmaların ıslak gelişim formları için mümkün değildir. Birçok geleneksel olmayan model organizmada olduğu gibi, açıklamalı bir genomdan yoksundur. Genomu olmayan herhangi bir organizmada gen ekspresyonunu manipüle etmek için, makul ve uygun maliyetli bir ilk adım transkripsiyon lar üretmek ve ilgili ama daha köklü model organizmalarla dizi benzerliğine dayalı olarak ifade edilen ilgi genlerinin putatif nükleotit dizilerini tanımlamaktır, bu durumda, öncelikle Tribolyum (Coleoptera) ve Drosophila genleri.
Burada, RNAi'nin bir su organizması üzerinde nasıl kullanılabileceğini göstermek için, ilk olarak rna ekstraksiyonu ve transkripsiyon üretimi ve montajı için belirli hedefli gen dizilerinin tanımlanmasına olanak tanıyan protokolleri ve yazılımları tartışıyoruz. Daha sonra gen lere özgü dsRNA sentezlemek için gerekli adımları özetleyebiliriz. Daha sonra, yumurtaların suortamında nasıl enjekte edilebildiğini gösteriyoruz ve gelişmekte olan embriyoların kültürlenmeleri için kuluçka protokollerini gösteriyoruz. Buna ek olarak, biz agarose jel enjeksiyon işlemi sırasında larvaları tamamen hareketsiz hale getirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, genellikle çeşitli prosedürler sırasında yararlı bir teknik ve eklembacaklı çeşitli uygulanabilir. RNAi'nin farklı gelişim evrelerine nasıl uygulanabileceğini göstermek için, embriyolarda göz pigmentasyon genini beyaz olarak susturduğumuz bir örnek ekleyiz. Buna ek olarak, bronzlaşma geni laccase2(lac2) hem ikinci larva instar (üçüncü larva instar larvaları etkilemek için) ve üçüncü larva instar (yetişkinleri etkilemek için) sırasında susturuldu bir örnek açıklayın. Son olarak, dsRNA'nın daha düşük konsantrasyonunun enjeksiyonunun kısmi nakavta yol açtığını gösteriyoruz, bu da bu tekniğin fonksiyon kaybının ölümcül olduğu bilinen genlere de uygulanabileceğini gösteriyor.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. RNA izolasyonu ve de novo transkriptom montajı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sıvı nitrojen</td><td>Üniversite Deposu</td><td></td><td>Tipik olarak araştırma kurumlarında yerel olarak bulunur</td></tr><tr><td>pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>boyuta bağlıdır</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>RNeasy lipid dokusu mini kiti (RNA izolasyon kiti)</td><td>Qiagen</td><td>74804</td><td>Kit</td></tr><tr><td>spektrofotometresi (NnanoDrop)</td> ile ayrıntılı özel protokol sağlanır <td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>çalışacaktır<güçlü>1.2. De novo transkriptom assembly.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUSCO.v3</td><td>https://busco.ezlab.org/</td><td></td> <td>Trasnriptom eksiksizliğini değerlendirmek için ücretsiz olarak kullanılabilen herhangi bir yazılım kullanılabilir.</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td>832021</td><td>Diğer eşdeğer yazılım paketleri de mevcuttur</td></tr><tr><td>Galaxy Workbench</td><td>https://usegalaxy.org/</td><td></td> <td>Açık kaynaklı bir çevrimiçi transkriptom montajı ve açıklama boru hattı</td></tr><tr><td>NCBI BLASTx</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx</td><td></td><td>Açık kaynaklı bir çevrimiçi hizalama ve açıklama boru hattı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2. cDNA sentezi, Klonlama ve Miniprep izolasyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampisilin sodyum tuzu</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>Omniscript RT (ters transsnription) kiti</td><td>Qiagen</td><td>205111</td> Kit One Shot & trade <td>ile ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td>; TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Kit ile birlikte ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler de eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td>PureLink Hızlı Plazmid Miniprep Kiti</td><td>ThermoFischer</td><td>771471</td><td>Kit ile ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit</td></tr><tr><td>çalkalayıcı-inkübatör</td><td>Labnet</td><td>211DS</td> ile ayrıntılı özel protokol sağlanır <td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır:</td></tr><tr><td>spektrofotometre (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır,</td></tr><tr>PCR <td>BioRad</td><td>T100</td><td>için termal döngüleyici</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>TOPO TA Klonlama kiti</td><td>Invitrogen</td><td>1845069</td><td>Kit ile ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td>X-Gal Solution</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0941</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> çalışacaktır<tr><td><güçlü>2.2 PCR amplifikasyonu ve in vitro dsRNA sentezi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Fisher Scientific</td><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler de eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td>FastTaq DNA Polimeraz, dNTPack</td><td>Roche</td><td>13873432</td><td>Bu kit, bir PCR</td></tr><tr><td>MEGAclear Transcriiption temizleme kiti</td> için gerekli tüm reaktifleri içerir <td>ThermoFischer</td><td>AM1908</td><td>Kit</td></tr> <tr><td>ile birlikte ayrıntılı özel protokol sağlanırMEGAscript T7 Transkripsiyon kiti</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1334</td><td>Kit ile ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen su</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>QIAquick PCR arıtma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td> Sodyum asetat <td>kiti ile ayrıntılı özel protokol sağlanır</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>3M çalışma çözümü</td></tr><tr><td>Spektrofotometre (NnanoDrop)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td> yapın <td>Diğer modeller eşit derecede iyi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>çalışır<güçlü>3. dsRNA enjeksiyonları için erken evre T. marmoratus embriyolarının toplanması ve hazırlanması</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agaroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi</td></tr><tr><td>damıtılmış su</td> işe yarar <td>Fisher Scientific</td><td>9180</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>forseps (Dumon #4 Biyoloji)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11242-40</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır,</td></tr><tr><td>cam boşluklu tabak (3 kuyulu tabak)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-243-43</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır,</td></tr><tr><td>mikrodalga</td>, <td>Welbilt</td><td>döner tabla</td>, <td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır,</td></tr><tr><td>doğal saç boya fırçası</td>, <td>Amazon</td><td></td><td>Herhangi bir ince fırça</td></tr>, <tr><td>P1000 mikro pipetleyici</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>Herhangi bir iyi stereomikroskop işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>transfer pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-200-109</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler de eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>4. Erken evrede dsRNA mikro enjeksiyonları T. marmoratus embriyoları< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dijital kamera</td><td>Edmund optik (Qimaging)</td><td>Retiga 2000R</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışacaktır</td></tr><tr><td>gıda boyası</td><td>Kroger</td><td></td><td>Mevcut herhangi bir gıda boyası olmalıdır ince nem</td></tr><tr><td>odası</td><td></td><td></td> çalışın <td>kapaklı herhangi bir plastik kutuyu alın,% 70 etanol ile sterilize edin ve kurumaya bırakın</td></tr><tr><td>inkübatör</td><td>Labline</td><td>203</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>enjeksiyon tamponu</td><td></td><td></td><td>Referans #22'ye göre 1 mL için hazırlanmıştır: 10 ve mikroyu karıştırın; L 0.1 M sodyum fosfat tamponu, 100 & L 0.5 M potasyum klorür çözeltisi, 100 & L gıda boyası ve 790 &mikro; L çift damıtılmış su. 4 >C'de saklayın.</td></tr><tr><td>hücre içi Mikroenjeksiyon Sistemleri (Picospritzer)</td><td>Parker</td><td>052-0500-900</td><td>Şu anda model III mevcuttur, ancak eski modeller de çalışır</td></tr><tr><td>mikro iğne tutucu</td><td>A-M Sistemleri</td><td>672441</td><td>Diğer ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon iğneleri (1,2 mm x 0,68 mm, 4 inç)</td><td>A-M Sistemleri</td><td>603000</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>mikromanipülatör</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-024-R</td><td>Herhangi bir kaliteli mikromanipülatör monosodyum fosfat işe yarayacaktır</td></tr><tr><td></td><td>Fischer scientific</td><td>7558-80-7</td><td>10 mL 1 M çalışma çözeltisi yapmak için: 10 mL Çift damıtılmış suya 1,2 g monosodyum fosfat tozu ekleyin ve berrak çözelti elde edilene kadar karıştırın</td></tr><tr><td>P-1000 Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-1000</td><td>Çektirme ayarları: Isı 575, Çekme 60, Hız 75 Gecikme 110, Basınç 700.</td></tr><tr><td>P10 mikro pipetleyici</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>P1000 mikro pipetleyici</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Fischer scientific</td><td>7447-40-7</td><td>100 mL 0.5 M potasyum klorür çözeltisi yapmak için: 100 mL çift damıtılmış suya 3.73 g potasyum klorür kristali ekleyin ve berrak çözelti elde edilene kadar karıştırın.</td></tr><tr><td>sodyum fosfat tamponu (0.1M)</td><td></td><td></td><td>Bu tampondan 0.1 M'den 10 mL yapmak için: 8.5 mL 1 M sodyum fosfat dibazik çözeltisini 1.5 mL 1 M monosodyum fosfat çözeltisi ile karıştırın. PH'ı bir pH metre ile kontrol edin ve oda sıcaklığında pH 7.6'ya uygun şekilde ayarlayın.</td></tr><tr><td>sodyum fosfat dibazik</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-79-4</td><td>10 mL 1 M çalışma çözeltisi yapmak için: 10 mL Çift damıtılmış suya 1.42 g sodyum fosfat dibazik toz ekleyin ve berrak çözelti elde edilene kadar karıştırın</td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>Herhangi bir iyi stereomikroskop işe yarayacaktır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><Güçlü>5. T. marmoratus larvalarının dsRNA enjeksiyonları için hazırlanması</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agaroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>forseps (Dumon #4 Biyoloji)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11242-40</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Diğer satıcılardan gelen ürünler eşit derecede iyi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> çalışacaktır<tr><td><güçlü>6. T. marmoratus larvalarında dsRNA mikro enjeksiyonları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>enjeksiyon tamponu (10x)Bölüm</td><td></td><td></td> <td>4'e bakın</td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon iğneleri (1,2 mm x 0,68 mm, 4 inç)</td><td>A-M Sistemleri</td><td>603000</td><td>Diğer modeller de eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon şırınga</td><td>A-M Sistemleri</td><td>603000</td><td>Diğer modeller eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>mikro iğne tutucu</td><td>A-M Sistemleri</td><td>672441</td><td>Diğer ürünler eşit derecede iyi çalışır</td></tr><tr><td>P-1000 Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-1000</td><td>Çektirme ayarları: Isı 575, Çekme 60, Hız 75 Gecikme 110, Basınç 700.</td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>Herhangi bir iyi stereomikroskop işe yarayacaktır</td></tr></tbody></table>

belirli gelişimsel zaman noktalarında gen İfadesi manipüle etmek için güçlü bir araç olarak su böcekleri rna girişim

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA girişim (RNAi) mRNA bozunması yoluyla gen ekspresyonunun hedeflenen azaltılmasına olanak sağlayan güçlü bir teknik olmaya devam etmektedir. Bu teknik organizmaların geniş bir yelpazede için geçerlidir ve tür açısından zengin sıracoleoptera (böcekler) son derece etkilidir. Burada, bu tekniği yeni bir organizmada geliştirmek için gerekli adımları özetler ve su dalış böceği Thermonectus marmoratus'un farklı gelişim aşamalarına uygulanmasını gösteririz. Hedef gen dizileri bilinen genomik veya de novo ile yakın bir akrabası karşı transkripsiyon montajı ile maliyet-etkin elde edilebilir. Aday gen klonlama belirli bir klonlama vektörü kullanır (pCR4-TOPO plazmid), hangi çift iplikli RNA sentezi sağlar (dsRNA) tek bir ortak astar kullanımı ile herhangi bir gen için. Sentezlenen dsRNA erken gelişimsel süreçler için embriyolara veya daha sonraki gelişimsel süreçler için larvalara enjekte edilebilir. Daha sonra RNAi'nin agarose'da immobilizasyon kullanılarak sudaki larvalara nasıl enjekte edilebildiğini gösteriyoruz. Tekniği göstermek için, tahmin edilen fenotiplerle belirli nakavtlar oluşturarak RNAi deneylerinden birkaç örnek salıyoruz. Özellikle, bronzlaşma geni laccase2 için RNAi larvalar ve yetişkinlerde ve RNAi göz pigmentasyon gen beyaz için mite yumuşatma yol açar göz tüpleri pigmentasyon bir aydınlatma / eksikliği üretir. Buna ek olarak, önemli bir lens proteini nakavt optik eksiklikleri ve av avlamak için azaltılmış yeteneği ile larvayol açar. Bu sonuçlar, rnai'nin sadece transkripsiyonel veritabanlarına sahip organizmalardaki morfolojik desenleme ve davranışsal özellikleri araştırmak için bir araç olarak gücünü örneklemektedir.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, sunburst Dalış Beetle T. marmoratusfarklı gelişim aşamalarında, yani, beyaz, laccase2 (laccase2( lac2 ), ve Lens3 (Tablo 1),üç farklı genler devirdi . T. marmoratus'ta embriyogenez sırasında çok erken bir aşamada dsRNA enjekte ederek RNAi uyguladık (Şekil 1A). Bazı embriyolar süreci hayatta ve nekrotik açmak gibi(Şekil 1B),onlar kalan embriyolar sağlıklı tutmak için kaldırılması gerekir. Burada örnek olarak beyaz genkarşı dsRNA enjeksiyonları vardır. Bu gen iyi gözpigmenti 23öncüleri alımı ve depolanmasında yer üç ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları biri olarak Drosophila bilinmektedir. Buna göre, fonksiyon kaybı pigmentsiz, beyaz göz fenotip ile sonuçlanır. Sonuçlarımız, T. marmoratus embriyolarında ortolog beyaz geni hedef alan dsRNA enjeksiyonlarının yeni ortaya çıkan larvalarda göz pigmentasyonu kaybına yol açtığını göstermektedir. Bu durumda, yabani tip larvalar ağır pigmentli gözler ile karakterizedir, ve beyaz RNAi nakavt azalma ve göz pigmenti bile tam ortadan kaldırılması çeşitli düzeylerde yol açar. Genel olarak, hayatta kalan embriyoların 4'ünde göz renginde en az bir azalma gözlendi (n = 35). Şekil 2A, kontrol bireyini ve biraz daha açık göz rengi olan bir bireyi karşılaştırır. Şekil 2B bir bireyde daha şiddetli bir nakavt göstermektedir, hangi kümenin daha ventral gözleri (Gözler 2-5) tamamen pigmentsiz, sırt gözleri hala bazı pigmentasyon gösterir. Bu farklılıklar, nakavtın etkinliğinin bölgesel olarak nasıl değişebileceğini vurgulamaktadır, ki bu da yoğun dokudaki dsRNA penetrasyonunun etkinliğindeki farklılıklarla ilişkilidir. Başka bir birey aslında tüm gözlerde tam pigment kaybı gösterir(Şekil 2C).
RNAi'nin T. marmoratus'unlarva evresinde ne kadar iyi çalıştığını araştırmak için, üçüncü yıldız aletine erimeden birkaç gün önce tannik gen lac2'yi hedefleyen dsRNA enjekte ettik (Şekil 3) ve üçüncü yıldız larvalarının cuticular renklendirmesi üzerindeki etkisini değerlendirdik. Lac2 oksidatif onları çözünmez yapmak için proteinleri biraraya getiren fenoloksidaz türüdür, sert, ve koyu. Un böceği T. castaneum Knockdown düşük dozlarda hafif renkli bireylere yol gösterilmiştir ama yüksek dozlarda ölümcül olarak kabul edilir24. Şekil 4 bu tedavi de açık renkli Sunburst Dalış Beetle larvayol göstermektedir. Özellikle, bu deneyde, hayatta kalan enjekte edilen larvaların u'i (n = 12) pigmentasyonu azaltmıştır (kontrol grubunda %0'a kıyasla). Şekil 4A göreceli olarak hafif depigmentasyona sahip bir bireyi gösterirken, Şekil 4C, manikülün koyu renklenmesinin neredeyse yok olduğu bir T. marmoratus larvasının başını göstermektedir. Depigmentasyon özellikle bu larvalar için tipik olan merkezi koyu desenleme de belirgindi, bu desen kontrol enjekte edilen bir bireyde açıkça görülebiliyordu(Şekil 4B). Buna ek olarak, Şekil 4D'degörüldüğü gibi kuyruk trakeasının hafifletilmesi gözlenmiştir. Lac2 dsRNA'nın üçüncü instar larvalarına enjekte edildiği durumlarda daha hafif erişkin bireyler elde edilmiştir(Şekil 5). Knockdown böceğinin kanatlarının, muhtemelen alışılmadık yumuşaklığı nedeniyle biraz deforme olduğunu unutmayın.
Morfolojik özellikleri değiştirmenin yanı sıra, davranışı etkileyen genleri hedeflemek için RNAi kullanmak mümkündür. Bunu göstermek için, biz önemli bir lens protein kodlama geni karşı RNAi yapıldı, Lens318, ve üçüncü instar larva gözlerinin optik özelliklerini etkilemek için ikinci instar larva içine enjekte. T. marmoratus larvagözleri de objektif25büyük optik değişiklikler içerir bu geçiş, büyük göz büyümesi geçmesi nedeniyle burada gözlenen lens üzerinde herhangi bir etki muhtemeldir . Bu deneyde RNAi nakavt son derece verimli oldu. QPCR ile doğrulama% 100 başarı oranı gösterdi; test edilen 13 bireyden 12'si kontrol bireylerinin ifade düzeyinin 'undan azına düşürülerken, geri kalan birey kontrol seviyesinin 'si (yayınlanmamış gözlem) ifade düzeyine sahip oldu. Henotypik düzeyde, sadece bazı bireyler ağır özürlü veya av yakalama aciz, Şekil 6'da tekrar tekrar çok yakın bir mesafeden avı yaklaştı ama sürekli overshot bir birey için gösterildiği gibi.
Tablo 1: Beyaz, lak2 ve Lens3 proteinleri için astar dizileri ve amperler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> Şekil 1: Embriyo enjeksiyonlarının illüstrasyonu. (A) Dechorionated embriyolar bir agarose plaka üzerinde dizilmiş ve dsRNA ve gıda boyası içeren enjeksiyon tampon udoldurulmuş bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak kendi merkezine yakın enjekte. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. (B) Daha şiddetli bir nakavt ile bir birey. Enjekte edilen embriyolar nem odasında tutulur ve fenotipleri puanlamak ve ölü bireyleri çıkarmak için her gün izlenir (kahverengiye dönüşür). Ölçek çubuğu 5 mm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> Şekil 2: Beyaza karşı dsRNA enjekte edilen tam gelişmiş embriyo örneği. (A)Göz pigmentasyonunda azalma olan bir bireyin karşılaştırılması (solda) ve kontrole enjekte edilen bir bireyin (sağda). E1-E6, Eyes 1-6'ya bakınız. (B) Daha şiddetli bir nakavt fenotip ile bir birey, hangi göstermektedir, zaman zaman, küme içinde bazı gözler daha ciddi diğerlerinden daha nakavt etkilenir. (C) Göz pigmentasyonu neredeyse tam kaybı ile bireysel. Ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder; B ve C panelleri aynı ölçekte temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> Şekil 3: Larva enjeksiyonlarının çizimi. (A) Kuyruk kuleleri herhangi bir agarose açık bırakılan% 2 agarose gömme tarafından hareketsiz birkaç larvalar. (B) Ucu iki segment arasındaki ince membrana nüfuz edebilmesi için yerleştirilen enjeksiyon çözeltisini içeren mikroelektrot. (C) Enjeksiyon dan sonra enjeksiyon yerinde görülebilen mavi enjeksiyon boyası. Ölçek çubukları 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> Şekil 4: Laccase2 için RNAi ikinci instar larvalarına uygulanır ve üçüncü instar larvalarında azalmış milet rengi elde edin. (A) Bir lac2 RNAi bireysel renklendirme nispeten hafif kaybı (alt) bir kontrol enjekte birey (üst) ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubuğu 5 mm. (B) Başın ortasında karakteristik koyu renkli deseni gösteren bir kontrol bireyinin başını temsil eder. (C) Lak2 nispeten şiddetli nakavt merkezi baş renklendirme neredeyse tam kaybına yol açan. (D) Bir lac2 RNAi bireyin büyük kuyruk cuticle renkkaybı (alt) bir kontrol enjekte birey (üst) ile karşılaştırıldığında. B\u2012D'deki ölçek çubukları 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> Şekil 5: Laccase2 için RNAi üçüncü bir instar larvasına uygulanır ve bu da bir yetişkinde daha az mite renklendirmeile sonuçlanır. Knockdown bireysel (sol) da kontrol (sağ) ile karşılaştırıldığında çok yumuşak elytra ile karakterizedir. Ölçek çubuğu 5 mm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> Şekil 6: Av yakalama eksikliklerine yol açan büyük bir lens proteininin nakavtı. (A–C). Optik açıkların RNAi aracılığıyla indüklendiği Sunburst Diving Beetle larvası avını (sivrisinek larvaları) yakalayamadıkları üç örnek. Temsili hareketsiz görüntüler karakteristik av yakalar bir video kaydı seçildi. (D) Avını yakalayan larvayı kontrol edin. Tüm ölçek çubukları 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">cm.'yi</a> temsil eder.

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Gen düzenleme modeli olmayan organizmaların moleküler genetiğini incelemek için popüler hale gelmiş olsa da, RNAi güçlü bir sinerjik araç olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı farklı gelişim evrelerine uygulanabilmektir. Buna ek olarak, kısmi nakavt bu tüm genleri incelemek için kullanılabilir.Prosedürün başarısı DSR enjeksiyonu ve en az zarar sahip dayanır. Bu uygulama alır, bu yüzden doğru almak için birkaç deneme sürer eğer cesareti olmayın. Mikro enjeksiyon için erken evre embriyolar hazırlamak için, ilk küçük bir Petri kabına% 20 agarose kaynatma dökün ve katılaşmadan önce sıvı agarose yüzeyine üç bir ila iki milimetre genişliğinde plastik tüpler yerleştirin.Agarose katılaşmış sonra tüpleri kaldırmak ve otoklav distile su 500 mikrolitre ile ortaya çıkan girintileri kapsayacak künt forceps bir çift kullanın. Toplama konteyner hazır olduğunda bir stereo mikroskop altında otoklav distile su ile dolu bir cam kavite çanak içine böcek yuvalama sitelerinden beş sekiz saatlik T.marmoratus embriyo aktarmak için ince bir doğal saç boya sıtkı kullanın. Mikroskop ve ince diseksiyon forsepsi kullanarak her iki taraftan her embriyo chorion kavramak ve embriyo doku yavaşça dışarı slayt sağlayan chorion açık rip.Toplanan tüm embriyolar her iki chorion katmanları çıkardıktan sonra dikkatle hazırlanan agarose plaka oluklar içine cam kavite çanak embriyolar aktarmak için paintbrush kullanın. Gen özel çift telli RNA ile erken evre embriyolar enjekte etmek için ilk bir iğne puler mikroenjeksiyon iğneleri hazırlamak ve stereo mikroskop kullanın ve keskin bir kenarher ucu kırmak için çiller bulmak. Saflaştırılmış stok çift iplikli RNA buz attıktan sonra, elde edilen çözeltiye 10X enjeksiyon tampon bir mikrolitre ekleyin ve 10 mikrolitre çözeltivinil hacmi getirmek için çift distile su kullanın.Hazırlanan mikroenjeksiyon iğnelerinden birini çift iplikli RNA çözeltisi ile doldurmak için P10 pipetini kullanın ve iğneyi basınç ejeksiyon teknolojisini kullanan bir mikroenjeksiyon sistemine bağlı bir mikroiğne tutucuya yükleyin. Mikroenjeksiyon sistemini ve basınçlı hava beslemesini açın ve enjeksiyon basıncını inç kare başına 15 pound'a ayarlamak için mikroenjeksiyon sistemindeki mikro valf kullanın ve enjeksiyon süresini saniyelere ayarlamak için zaman ayar ını kullanın. Enjeksiyon iğnesi kalibre etmek için T.marmoratus embriyo su yüzüne enjekte ederken iğne ucunda oluşan sıvı kabarcık hacmini değerlendirmek için 100 ila 200 mikron optimal kabarcık boyutu kullanın.Optimum kabarcıklar yaklaşık üç saniye lik bir enjeksiyon süresi ile inç kare başına basınç 15 kilo elde edilebilir eğer enjeksiyon iğneiyi iyi kalitede. İğne kurulur hazır olduğunda, iğne embriyoların agarose plakasına, iğnenin embriyolara 45-60 derecelik bir açıyla yaklaşması için hizalayın. Mikro iğneyi yavaşça hareket ettirecek şekilde kullanın, parmak ucu bir embriyonun orta yüzeyine değinceye kadar sonra iğneyi embriyonun yüzeyini delip geçinceye kadar dikkatlice ileri doğru hareket ettirin.İğne embriyonun içine girdikten sonra mikro enjektör enjeksiyon düğmesine dikkatlice basarak embriyoya çift iplikli RNA'nın bir ila iki nanolitresini teslim edin. RNA'nın tamamı teslim edildiğinde, embriyonun yırtılmasına neden olmadan iğneyi embriyodan yavaşça geri çekin. Başarıyla enjekte embriyolar enjeksiyon yerinde renkli bir nokta varlığı ile tespit edilebilir.Tüm embriyolar dikkatlice enjekte edildiğinde, 4-5 gün boyunca 14 saat ışık 10 saat karanlık döngüsüne ayarlanmış 25 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde bir nem odasına çanak yerleştirin. Morfolojik olarak görünür nakavt fenotipleri tanımlamak için stereo mikroskop altında embriyo gelişiminin ilerlemesini her gün izleyin. Geliştirme işlemini belgelemek için yüksek çözünürlüklü dijital kamera kullanma.Herhangi bir ölü embriyo ları çıkarın ve kuluçka döneminde diğer embriyolara mikrobiyal kontaminasyonun yayılmasını ve kurumasını ve yayılmasını önlemek için her gün agarose plaka üzerindeki suyu yenileyin. Larva toplamadan önce ilk küçük bir Petri kabına 60 ila 70 santigrat derece% 2 sıvı agarose ekleyin. Agarose katılaşmış zaman larva başına bir sığ grup yapmak için künt çiller kullanmak agarose içine enjekte edilecek ve yavaşça larva kültür bardak su drenaj.Anesteziden sonra larvayı, oluklarda boyun ve gövdelerle immobilizasyon plakasına dikkatlice yerleştirmek için yumuşak uçlu büşreler kullanılır, ancak kuyruk agarose yüzeyinin üzerinde yer alır. Tüm larva larva yerleştirildiğinde, her lavı hala sıvı ama tehlikeli derecede sıcak olmayan kalın bir agarose tabakası ile kaplayın ve kazara gerektiği gibi kaplanmış masalları serbest yapın. çift iplikli RNA mikroenjeksiyon yükü için gen özel çift telli RNA çalışma çözümü ile bir mikroiğne gösterildiği gibi.Elle kontrol edilen bir mikroenjeksiyon şırıngasının pistini yeniden sürükleyin ve iğneyi mikroenjeksiyon sistemine yükleyin. Immobilize larvayı stereo mikroskobun altına yerleştirin, enjeksiyon bölgesi mikroenjeksiyon iğnesinin yörüngesiyle nispeten düz bir açıyla hizalanır. İğne ucunu larvaya dikkatlice taşımak için mikro manipülatörü kullanın ve gerektiğinde iğnedeki renkli enjeksiyon sıvısının hareketine göre enjeksiyon basıncını ayarlayarak şırıngaya yavaşça ve dikkatlice basınç uygulayın.RNA'nın tamamı enjekte edildiğinde larvayı agarose'dan kurtarmak için yumuşak çiller kullanın ve larvayı 25 ila 28 santigrat derece ve 14 saat açık 10 saatlik karanlık bir döngüde oda sıcaklığında yeni bir su kabına yerleştirin. Bu temsili analizde üç farklı gen, güneş patlaması dalış böceği T.marmoratus'un farklı gelişim evrelerinde yıkıldı. RNA paraziti, embriyogenezin çok erken bir evresinde çift iplikli RNA enjekte edilerek gösterildiği gibi gerçekleştirilir.Bazı embriyolar bu süreçten sağ çıkamaz ve nekrotik bir hal alamayın. Bu görüntülerde kontrol bireysel ve biraz daha açık göz rengi ile bir birey görülebilir. Bu bireyde, kümenin daha ventral yalanları tamamen pigmentsiz ama hala bazı pigmentasyon görülebilir yapmak daha şiddetli bir nakavt.Burada tüm gözlerde aslında tam pigment kaybı olan başka bir bireyin bir örnek gösterilir. Lak2 larva sonuçları daha az pigmentli mite sonuçları devirdi, doku alışılmadık yumuşaklık nedeniyle muhtemelen biraz deforme kanatları ile hafif yetişkin bireyler de elde edildi. Yakından günlük olarak enjekte edilen hayvanları gözlemlemek ve hemen herhangi bir ölü bireyleri kaldırmak için hevesle bakmak için emin olun.Bu tekniğin gücü birçok farklı organizmanın genlerine uygulanabilir olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda evrimsel gelişim biyolojisine de yaygın ve başarılı bir şekilde uygulanmıştır.

rna-interference-aquatic-beetles-as-powerful-tool-for-manipulating

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

RNA girişim gen fonksiyonu analiz etmek için çok etkili olduğu...

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

RNA enterferans (RNAi) tabanlı gen demonte teknikleri Tribolium araştırma özünde vardır. Burada, biz Tribolium castaneum'ların bizim larva RNAi tekniğinin bir bakış sağlar. Larva RNAi araştırmacılar farklı bağlamlarda gen fonksiyonlarını incelemek için izin, kayıp fonksiyon-fenotiplerine hızlı erişim sağlayan basit, ama güçlü bir tekniktir.

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim, Tribolium castaneum

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Burada, Nasonia vitripennis'te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

Biz sipariş Odonata (yusufçuk ve damselflies) mavi kuyruklu damselfly kullanarak(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ve pied skimmer yusufçuk(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera) kullanarak sipariş Odonata böceklerde elektroporasyon aracılı RNA girişim için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Keşfedin, Thermonectus marmoratus embriyolarında RNA girişimi ile gen fonksiyonlarını çalışmak için mikroenjeksiyon tekniğini. Bu yöntem gelişim biyolojisi ve davranış araştırmalarında güçlü bir araç sunar.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Daha fazla video keşfet