Primer Fare Orta Beyin Nöronlarında Spontan Ca²⁺ Akılarının ve Downstream Etkilerinin Ölçülmesi

Bu protokol, Parkinson hastalığında kaybolan dopaminerjik nöronlarda kalsiyum akılarını ölçer. Bu anormal kalsiyum Parkinson hastalığında dopaminerjik nöron kaybına neden olduğunu anlamak için yararlıdır. İlk defa, kültürlü birincil orta beyin nöronlarında spontan kalsiyum akıları gösteriyoruz.

Bu yöntem kalsiyum aracılı apoptozda yer alan spesifik reseptör katkılarını incelemek için kullanılabilir. Yöntemimiz Parkinson hastalığı için özel ve etkili nöroprotektif bileşikler keşfetmek için yüksek içerikli ilaç ekranları için bir cadde sağlar. Bu nöroprotektif bileşikler dopaminerjik nöronda kalsiyum aracılı apoptoz önleyeceği.

Bir mililitre serumsuz DMEM ortamını, her yemek başına bir mikrolitre hSyn-GCaMP6f AAV ile hazırlayarak başlayın. Her yemekten hücre kültürü ortamını aspire edin ve hazırladığım DMEM'in bir mililitresini hSyn-GCaMP6f ile değiştirin. Bulaşıkları bir saat liğine 37 santigrat derecelik kuvöze geri yerleştirin.

Kuluçkadan sonra, aTV ile orta aspire ve hücre kültürü orta üç mililitre ile değiştirin. Bulaşıkları 37 derecede 5-7 gün kuluçkaya yatırın. Viral enfeksiyon bu dönemde her iki veya üç günde bir orta değiştirme.

HEPES kayıt tamponunun bir litresini, 20 mikromolar glutamat kayıt tamponunun 200 mililitresini ve el yazması yönlere göre 200 mililitre 10 mikromolar NBQX kayıt tamponu hazırlayın. Steril 35 milimetrelik Petri kabını üç mililitre kayıt tamponuyla doldurun. Kuvözden enfekte kültürlerile Petri çanak alın, sonra dikkatle ince uç forceps ile bir kapak kayma kenarına kapmak ve kayıt tampon ile çanak içine aktarın.

Kalan kapak fişini orta geri 37 derece lik inkübatöre yerleştirin ve kabı nodakmikroskobun kayıt tamponuyla birlikte taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın. Bu baş harfe dönüşürken, peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt tamponuna yerleştirin.

Daha sonra akışı dakikada iki mililitreye kalibre edin. Enfekte kapak fişini Petri kabından ince çifenerlerle kayıt banyosuna aktarın. 10X su daldırma hedefi ve brightfield ışığı kullanarak, odak düzlemi bulmak ve nöron hücre organlarının yüksek yoğunluklu bir bölge aramak, sonra 40X objektif geçiş ve örnek yeniden odaklama.

Boyalar listesi penceresinde AlexaFluor 488'i seçin ve uygulayın. Floroforların aşırı pozlamasını ve fotoğraf beyazlatmalarını önlemek için düşük HV ve lazer güç ayarlarıile başlayın. AlexaFluor 488 kanalı için HV'yi 500'e, kazancı 1x'e ve mahsupı sıfıra ayarlayın.

488 lazer hattı için gücü %5'e ayarlayın. İğne deliği boyutunu 300 mikrometreye yükseltin ve emisyon sinyallerini subsatürasyon seviyelerine en iyi şekilde ayarlamak için odak x2 tarama seçeneğini kullanın. Ayarlar daha sonra her kanalın en iyi görünürlüğü için ayarlanabilir.

Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, sahneyi GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücreye sahip bir bölgeyi bulmak için hareket ettirin ve görüntüleme için istenilen düzleme odaklanın. Görüntüleme çerçevesini bir saniyenin altında bir kare aralığına ulaşabilecek bir boyuta çekmek için Küçükler düzeltme aracını kullanın. Aralık penceresini 1,0 değerine, Num penceresini 600'e ayarlayın.

Bir t serisi filmi yakalamak için Saat seçeneğini seçin ve ardından görüntülemeye başlamak için Xyt tarama seçeneğini kullanın. Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 mikromolar glutamat kayıt tamponuna taşıyın. Görüntüleme tamamlandığında, dizi bitti düğmesini seçin ve bitmiş t-serisi film kaydedin.

Nöron kültürü toplam 10 dakika glutamata maruz kalmış böylece ek bir beş dakika için glutamat perfuse devam edin. Görüntülenecek her kapak fişi için bu işlemi tekrarlayın. Deneyden hemen sonra kalsiyum izlerini ve nöronal hücre gövdelerini görmek mümkündür.

Nöronal soma etrafında ROI istenilen sayıda çizmek için Elips aracını kullanın. İzleri görselleştirmek için Seri Analizi düğmesini kullanın. Glutamata beş dakikalık ek maruzkaldıktan sonra, ince prömiyer lerle banyodan kapak fişini çıkarın ve tüm görüntüleme tamamlanana kadar kayıt tamponuyla petri kabına geri yerleştirin.

Görüntüleme gününde VM kültürleri glutamat veya glutamat ve NBQX kombinasyonu ile tedavi edildi. Her iki durumda da GCaMP6f floresansında spontan kalsiyum akılarını gösteren heterojen ve spontan değişiklikler gözlendi. Glutamat uygulaması hem spontan aktif hem de quiescent nöronlarda sağlam ve sürekli bir kalsiyum yanıtı üretti.

NBQX uygulaması spontan aktiviteyi azalttı ve glutamat yanıtını kısmen engelledi. Glutamat uygulamasının her koşulda kalsiyum yanıtını uyardığı ölçüde eğrinin altındaki alan kullanılarak ölçüldü, pik genlik, ve yanıt gecikmesi. Yanıt gecikmesi NBQX ve glutamat durumu altında artmıştır.

Glutamat aracılı apoptoz ölçmek için, hücreler sabit ve bir anti-Caspase-3 antikor ile lekeli edildi. Ortalama kaspas-3 şiddeti her iki tedavi koşulunda da tedavi edilmeyen kontrollere göre anlamlı olarak yüksekti. Heyecanlı toksik hücre ölümü daha ayrıntılı bir analiz kontrol ve glutamat tedavi durumda immünostain tirozin hidroksilaz pozitif dopaminerjik nöronların sayısı sayılarak yapılabilir.

Bu teknik, dopaminerjik nöronda kalsiyum aracılı apoptozda yer alan farklı reseptörlerin ve demir kanallarının göreceli katkılarını anlamanın yolunu açmıştır.