Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli

Geliştirilmesinden sonra, oksijen kaynaklı retinopati modeli, neovasküler retina hastalıklarının klinik öncesi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Hipoksiye yanıt olarak patolojik anjiyogenezi incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu modelin temel avantajı, tekrarlanabilir ve kolayca ölçülebilir olan sağlam bir nörovasküler yanıtı indüklemesidir.

Bu model, olası terapötik adayların etkilerini incelemek için klinik öncesi bir model olarak kullanılabilir. Prematüre retinopatisi, diyabetik retinopati ve yaş yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi çeşitli insan hastalıkları için uygun bir model olarak kabul edilir. Hipoksi indüksiyonundan önce ve sonra ve kurban sırasında hayvanların ağırlığını kaydedin.

Kafesin dibinde yeterince yiyecek olduğundan emin olun ve bir filtrasyon sistemi kullanılmadığında fazla karbondioksiti emmek için haznenin altına renk göstergeli soda kireç ekleyin. Hazne içindeki nemi ve sıcaklığı izleyin, nemi %40 ile %65 arasında tutunGerekirse, tabana su içeren tabaklar koyarak haznenin nemini artırın. Oksijen sensörünü normal oda havası ve %100 oksijen ile kalibre edin.

Daha sonra P7 farelerini bir hazneye yerleştirin ve oksijen seviyesini %75'e ayarlayın Fareleri P12'ye kadar beş gün boyunca haznede tutun ve indüksiyon sırasında hayvanları izleyin. Bitirdiğinizde, fareleri hazneden çıkarın. Hayvanları tartın ve kuyruk veya kulak üzerinde tanımlama işaretleri yapın.

Hayvan uyuşturulduktan sonra, bir ayak parmağı çimdikleme yapın. Küçük bir refleks kabul edilebilir. Tedavi sırasında hayvanı bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.

IVT enjeksiyonu için 33 ila 34 gauge iğneli bir cam şırınga kullanın. Bir damla iyot uygulayın, ardından göz kapağını aşağı bastırın ve göz küresini forseps ile tutun. Enjeksiyonu limbusun arkasına, optik sinire doğru yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yapın.

Enjekte edilen solüsyonun geri akışını önlemek için ilacı enjekte ettikten sonra iğneyi 30 saniye yerinde tutun. İğneyi çıkardıktan sonra gözü kanama veya retina hasarı gibi herhangi bir komplikasyon açısından inceleyin. Enjeksiyondan sonra gözün üstüne antibiyotik merhem sürün.

İstenirse, anjiyojenik yanıtlar sırasında retinada gelişen değişiklikleri kaydetmek için takip süresi boyunca canlı hayvanlar üzerinde in vivo görüntüleme yapın. Retina katmanlarını in vivo olarak görselleştirmek için spektral alan optik koherens tomografi kullanın. Göz çevresindeki dokuyu keserek, kavisli forseps ile göz küresinin arkasından tutarak ve gözü yörüngeden kaldırarak hayvanların gözlerini toplayın.

Göz kürelerini taze yapılmış, filtrelenmiş% 4 paraformaldehit içinde bir ila dört saat boyunca inkübe edin. Sabitleyiciyi çıkarın ve gözbebeklerini yıkama başına 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Retinaları hemen inceleyin veya dört santigrat derecede PBS'de saklayın.

Neovaskülarizasyon miktarını ve avasküler alanların veya AVA'ların boyutunu ölçmek için retinal düz montajlar hazırlayın. Mikro makas ve forseps kullanarak retinayı stereo mikroskop altında inceleyin. Göz küresini nemli tutmak için PBS'ye yerleştirin ve 23 gauge iğne ile limbusta delin, ardından irisi ve korneayı çıkarmak için limbusun etrafını kavisli mikro makasla kesin.

Makasın ucunu dikkatlice RPE ve nöral retina arasına yerleştirin ve RPE koroid sklera kompleksini optik sinire doğru kesin. Aynısını göz küresinin diğer tarafına da yapın. Ardından, retina kabı açığa çıkana kadar dokuyu nazikçe kesin veya yırtın.

Lensi retina kabından dışarı çekin ve bardağa PBS ekleyin. Retinaya zarar vermeden tüm hyaloid damarları, vitreusu ve kalıntıları çıkarın. Çiçek benzeri bir yapı oluşturmak için düz mikro makasla retinaya dört kesi yapın.

Boyama için iyi bir plakaya aktarmak için yumuşak bir boya fırçası veya transfer pipeti kullanın. Retina damar sistemini, endotel hücrelerinin yüzeyini boyayan izolektin B4 ile etiketleyin. Retinaları bir saat boyunca bloke edici tamponda inkübe edin ve 10 dakika boyunca TBS'de% 1 NGS ve% 0.1 Triton ile yıkayın.

Retinaları, ışıktan korunurken gece boyunca dört santigrat derecede mililitre floresan boya konjuge izolektin B4 başına 5 ila 10 mikrogram inkübe edin. Ertesi gün, retinaları yıkama başına 10 dakika boyunca TBS'de% 1 NGS ve% 0.1 Triton ile üç kez yıkayın. Retinaları bir mikroskop üzerine yerleştirin, iç retina yukarı bakacak şekilde kaydırın.

Ardından yumuşak bir boya fırçası kullanarak retinayı dikkatlice yayın ve kalan hyaloid damarları veya kalıntıları temizleyin. Numunenin üzerine montaj ortamı ekleyin ve sürgünün üzerine bir lamel yerleştirin. Retinaları ışıktan koruyarak dört santigrat derecede saklayın.

10X objektifli bir floresan mikroskobu kullanarak retina düz montajlarını görüntüleyin. Yüzeyel vasküler pleksus ve pre-retinal neovaskülarizasyona odaklanın. Tüm retinayı yakalamak ve döşeme taramalarını birleştirmek için bir döşeme taraması görüntüsü oluşturun.

Bir görüntü işleme programı kullanarak AVA'ları, neovaskülarizasyon alanını ve toplam retina alanını ölçerek görüntüleri ölçün. Serbest bir çizim aracı kullanarak AVA'ları ve toplam retina alanını çizin ve bir seçim aracı kullanarak neovasküler alanları seçin. Fare oksijenine bağlı retinopati modelinde, vazo-obliterasyon merkezi retinada meydana gelir.

Sıçan modelinde iken, insan ROP'una benzer şekilde çevrede gelişir. Pre-retinal neovaskülarizasyon, avasküler alanların, özellikle farede merkezi retinanın ve sıçanlarda periferin yakınında gelişir. OIR retinalarındaki morfolojik değişiklikleri veya örneğin enflamatuar hücreler gibi ilgilenilen hücre tiplerinin varlığını değerlendirmek için enine kesitler veya düz bağlar kullanılarak yapılan histolojik analiz yapılabilir.

İsteğe bağlı olarak, OIR takip süresi boyunca non-invaziv in vivo görüntüleme yapılabilir. Floresein anjiyografi ile retina ve hyaloid damar sistemi görüntülenebilmekte ve retinadaki yapısal değişiklikleri değerlendirmek için spektral domain optik koherens tomografi kullanılabilmektedir. Fonksiyonel değişiklikler elektroretinografi ile ölçülebilir.

Çözünür bir VEGF-Trap olan Aflibercept, OIR'de hem neovasküler hem de fizyolojik revaskülarizasyonu inhibe eder. P14'e yüksek dozda aflibercept enjekte edilen OIR gözleri, tedavi edilmemiş gözlerden daha büyük retinal AVA'lara sahipti, bu da afliberseptin hipoksi tarafından yönlendirilen fizyolojik retinal revaskülarizasyonu da engellediğini düşündürdü. Bu protokolü denerken, deneyiniz için uygun çöp boyutunu önceden düşünmeyi ve barajların ve oksijen odasındaki yavruların sağlığını izlemeyi unutmayın.

Doğum sonrası kilo alımının modeldeki sonucu etkilediğini göz önünde bulundurun. Bu modelden elde edilen retina örnekleri, immünohistokimya, gen veya protein ekspresyon analizi gibi analitik yöntemler için ve potansiyel terapötik adayların retina üzerindeki etkilerini moleküler düzeyde ölçmek için kullanılabilir.