Thymidine Analog BrdU Kullanarak Sıçanlarda Hücresel Proliferasyon ve Nörogenezi Analiz Etmek için İmmünohistokimya Teknikleri

Bu, Yetişkin Nörojenez alanında önemli bir protokoldür. Burada başarılı bir boyama elde etmek için gereken adımların ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Bu teknik, doku bütünlüğünü korurken, bölünen hücrelerde birlikte eksprese edilen spesifik proteinleri aynı anda tanımlamayı mümkün kılar.

Doku antikorlarının ve koşullarının önceden test edilmesini öneririz. Önemli adımlar, membran geçirgenliği, dikkatli DNA denatürasyonu ve blokaj ve yıkama adımları için sürelerin test edilmesidir. Tekniğin standartlaştırılması yeni laboratuvarlar için zordur.

Kemirgenlerde timidin analogunun reaktif hazırlığı ve uygulanması başarılı sonuçlar için kritik öneme sahiptir Timidin analog BrdU uygulaması için, deneysel sıçanı kısıtlamak için alt karın boşluğunu hareketsiz hale getirin ve taze hazırlanmış bir kilogram BrdU çözeltisi başına intraperitoneal olarak enjekte etmek için 23 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Uygun deneysel son noktada, beyni toplayın ve bir kriyostat mikrotomu kullanarak 40 mikrometre kalınlığında koronal bölümlerin elde edilmesine izin vermek için beyni dondurun ve bölümleri, toplanma sırasına göre kriyo koruma çözeltisinde 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Tüm bölümler toplandıktan sonra, numuneleri eksi 20 santigrat derecede birkaç aya kadar saklayın.

Avidin-biotin-peroksidaz kompleksi ile bir peroksidaz reaksiyonu kullanarak BrdU boyamayı değerlendirmek için, numuneler oda sıcaklığına ulaşana kadar kriyo koruma solüsyonundan dilimleri 0.1 molar PBS'ye aktarın ve dokuları yıkama başına taze 0.1 molar PBS ile 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, bölümleri endojen peroksidaz bloke etme solüsyonunda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe eder, ardından 0.1 molar PBS'de 10 dakikalık üç yıkama yapılır. Son yıkamadan sonra, bölümleri iki molar hidroklorik asit içinde 37 derecede 20 dakika inkübe edin, ardından 0.1 molar borat tamponunda 10 dakikalık bir durulama yapın.

Buz gibi soğuk 0.1 molar PBS'de üç yıkamadan sonra, numuneleri oda sıcaklığında PBS + bloke etme çözeltisinde iki saat inkübe edin, ardından PBS + 'da fare Anti-BrdU birincil antikoru ile dört santigrat derecede bir gece inkübe edin. Üç adet 0.1 molar PBS yıkamasından sonra, numuneleri oda sıcaklığında PBS + 'da uygun fare biyotinile ikincil antikoru ile iki ila dört saat inkübe edin. Yıkadıktan sonra, bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca ABC Solüsyonu ile muamele edin, ardından üç adet 0.1 molar PBS yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, dilimler koyu gri olana kadar iki ila 10 dakikalık bir inkübasyon için dilimleri DAB-Peroksidaz Substrat Çözeltisine aktarın. Pozitif hücreler görselleştirilebilirse, numuneleri üç adet 15 dakikalık musluk suyu yıkaması ve ardından üç adet 0.1 molar PBS yıkaması ile durulayın. Son yıkamadan sonra Oda sıcaklığında gece boyunca havayla kurutmak için dilimleri jelatinleştirilmiş slaytlara dikkatlice monte etmek için yumuşak bir fırça kullanın.

Ertesi sabah, numunelerin üzerine kapak kızakları yerleştirmek için kalıcı montaj ortamı kullanın. BrdU pozitif hücreleri ölçmek için, önce dentat girusu tanımlamak için mikroskopta 4x büyütmeyi kullanın ve BrdU etiketli çekirdekler için Z ekseni boyunca granüler hücre katmanını dikkatlice arayın. Dentat girusun her yerinde hücre araması için bir aralık bölümü seçtikten sonra, tüm BrdU pozitif hücreleri sayın.

Etiketli çekirdeğin morfolojisi, hücrenin ne kadar BrdU içerdiğine bağlı olarak değişebilir. Hayvan başına en az 10 bölümden ve bir kümeyi entegre eden grup başına en az beş hayvandan tüm çekirdekleri ölçmek için Z ekseni üzerinde yavaşça hareket edin. Görüntü evrişimini gidermek için, kırınım noktası yayılma işlevi 3D eklentisini açın, gerekli tüm verileri doldurun, Tamam'a tıklayın ve dosyayı kaydedin.

Ardından, DeconvolutionLab2 eklentisini açın ve eşleşen Z-stack görüntüsünü ve PSF dosyasını ilgili pencere yuvasına sürükleyin. Evrişim çözme algoritmasını ve yineleme sayısını seçin ve çalıştır'a tıklayın. Derişimi kaldırılmış görüntüleri tek bir Z yığını görüntüsünde birleştirmek için, Görüntü ve Yığınlar'ı seçin ve Z projesi'ni tıklatın.

Projeksiyon türü menüsünden Maksimum Yoğunluk'u seçin. Tamam'ı tıklatın ve dosyayı kaydedin. Bir RGB görüntüsü oluşturmak için, Görüntü ve Renk'i seçin ve açılır menüden ilgili görüntüyü istediğiniz renk kanalına ayarlamak için Kanalları Birleştir'e tıklayın.

Ardından Bileşik oluştur kutusunun işaretini kaldırın. Tamam'ı tıklatın ve dosyayı kaydedin. Tüm kanal görüntüleri oluşturulduğunda, görüntü dosyalarından en az ikisini açın ve bir RBG görüntüsü oluşturmak için her görüntü dosyası için farklı renk kanalları seçin.

Bu görüntülerde BrdU işaretli hücrelere sahip temsili dentat girus kesitleri izlenebilmektedir. Kesitlerin bu büyütülmüş görüntülerinde görüldüğü gibi, etiketli hücreler yoğun bir koyu lekelenme gösterir. Not dışında, fiziksel aktiviteye maruz kalmayan kontrollü sıçanlar ile fiziksel aktiviteye maruz kalan deney grubu arasında, fiziksel aktivitenin yetişkin dentat girusta hücresel proliferasyonu arttırdığını gösteren diğer bildirilen sonuçlarla tutarlı olarak, BrdU pozitif hücre sayılarında önemli farklılıklar vardır.

Bu protokolü denerken, taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın ve dokuyu nazikçe tutun. Hipokampus, içinden tedavi edildiğinde slaytların geri kalanından ayrılmaya karşı hassastır ve gözden kaçabilir. Bu prosedür, DNA sentezinin DNA etiketi ve indeks değerlendirmesi ve boyama hücresi proliferasyon çalışmalarının iki katına çıkarılması için uyarlanabilir.

Bu çabanın bilim camiasına yardımcı olduğunu ve immünohistokimya tekniği olduğunda hücre proliferasyonu çalışmasında yeni soruları yanıtlamayı kolaylaştırdığını umuyoruz.