Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

DC-ERG tekniği, yaşa bağlı değişiklikleri veya hastalığın ilerlemesini izlemek ve farmakolojik müdahale etkilerini değerlendirmek için retinapigment epitel fonksiyonunun kaçamak olmayan değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu teknik, kapiller elektrot hazırlamabasitleştirerek DC-ERG yeniden yeteneği ve kullanımı kolay geliştirir. Ayrıca analizi kolaylaştırmak için standart bir ohm yazılım uygulaması ile desteklenebilir.

25 kalibrelik şırınga iğnesini silikon kauçuk contadan elektrot tutucunun arka duvarına dikkatlice kaydırarak başlayın. İğneyi yavaşça geri çekerken, kabarcıkları sokmamaya dikkat ederken elektrot tutucunun tabanını gazsız HBSS ile doldurun ve sıkmadan dişli kapağı değiştirin. Şırınga iğnesini hbss ile boşluktaki boşluğu doldurmak için yeniden yerleştirin ve diğer uçtan kaçan çözeltiyi önlemek için kapilleri yatay olarak tutun.

Bükülmüş ucundaki dolgulu kılcal damarı kavrayarak, diğer ucunu yavaş yavaş gevşetilmiş kapaktan geçirin ve vida kapağını yerine sıkın. Herhangi bir kabarcıkların dışarı akmasına ve kılcal damarları bir vakum odasında 5 ila 10 dakika degas sağlamasına izin vermek için elektrot tutucuları yukarı bakacak şekilde elektrot tutucuları yatırın. Sonra, yavaş yavaş vakum bırakın ve elektrot tutucuları ve cam kılcal dolgu, gösterildiği gibi.

Mikroelektrot tutucu için özel bir stand yapmak için, sekiz numaralı T-klipsin bir tarafından siyah poliasetal klipleri çıkarın ve yüksekliği ayarlamak için yarıya kadar işlenmiş manyetik top eklemli bir silindir tabanı kullanın. Modifiye Edilmiş T klipsleri M3 boyutlu somunlarla manyetik top montaj vidalarına ve pamuk uçlu temizleme çubuğundan modifiye edilmiş yaklaşık 1 inç konik ahşap saplı bir kaydırağa sabitleyin ve mikroelektrot tutucuyu özel yapım T-clip manyetik top eklem standına sabitlemek için bir açıyla standa sabitleyin. Daha sonra, özelleştirilmiş elektrot tutucu standını sahnenin metal plakasına güvenli bir şekilde konumlandırmak için nadir toprak mıknatıslar silindir tabanını kullanarak 180 derecelik bir eksenüzerinde 360 derecelik bir dönüş sağlar.

Bir elektrot testi gerçekleştirmek için, ilk olarak, hafifçe HBSS küçük bir kap içine tam monte HBSS dolu kılcal mikroelektrotlar indirin. İğne toprak elektrodu ve gümüş, gümüş klorür merkezli pelet referans elektrodu aynı HBSS devreyi yerleştirin ve test edilecek fareyi tanımlamak için uygun bir tanımlayıcı seçin veya oluşturun. Gerçekleştirilecek doğrudan birleştirilmiş elektroretinogram protokolünü seçmek için protokolleri tıklatın ve DC-ERG'yi seçin.

Çalıştır'ı tıklatın. Hasta bilgileriyle birlikte bir iletişim kutusu açılır. Bilgiler doğruysa, evet'i tıklatın ve altı adımdan birine ilerleyin.

Faraday kafesinin kapılarını kapatın ve empedans modunu görüntülemek için empedans'a tıklayın. Ağız referans, kuyruk zemini ve kayıt elektrotları için değerlerin kabul edilebilir olduğunu doğrulayın ve temel kararlılığını test etmek için altı adımın dördüne geçmek için adıma tıklayın. İzlemeleri görüntülemeye başlamak için önizlemeyi tıklatın.

İzler, 200 mikrovolttan daha az bir pik-to-peak genlik ile düşük gürültü olmalıdır. Bir deney için fare ve elektrotları konumlandırmak için, %2,5 fenylefrin HCL ve %5 tropikamid damlası ile korneayı genişletmeden önce %5 proparacaine hidroklorik asit damlasıyla uyuşturulmuş bir farenin korneasını anestezi edin. ERG sistem yazılımında, doğru hastanın seçildiğini doğrulayın.

Protokolleri tıklatın. Protokol açıklamasıaltında DC-ERG'yi seçin ve çalıştır'ı tıklatın. Doğru testin gerçekleştirildiğini doğrulamak için evet'i tıklatın.

Kubbenin içindeki loş kırmızı ışığı açmak ve fareyi ısıtmalı bir kayıt masasına yerleştirmek için altı adımdan birini kullanın. Arka bacağın derisini dikkatlice çadırlamak için forceps kullanın. İğne elektrodu sıkıca tutmak için bir elinizi kullanarak, elektrodu yerine sabitlemek için elektrodu arka baceğe deri altı olarak yerleştirmek için diğer elinizi kullanın.

Referans gümüş, gümüş klorür elektrot hayvanın ağzına yerleştirin, böylece merkezli pelet arka yanak boyunca dinlenir ve dişlerin arkasında yerinde tutulur. Kapiller elektrotları göze yerleştirmeden önce elektrot tutucuyu dikey olarak yönlendirilmiş cam kılcal damarlarla yerleştirin ve elektrot tutucusunu bir işaret parmağıyla hareket ettirerek tanıtılan kabarcıkları çıkarın. Kılcal damarları HBSS ile doldurmak için 25 kalibrelik bir iğne kullanın ve uçlarda sıkışmış hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için kılcal damarları inceleyin.

Elektrot tutucu duruşunu, HBSS dolgulu kılcal damarların açık uçlarıkorne ile hassas bir şekilde temas edindiye yerleştirin. Ve kabarcıklar tanıtmak önlemek için özen, ilk damla atmak için yağlayıcı göz jeli dağıtıcı ters. Daha sonra, iletkenliği korumak ve kayıt sırasında kurutmayı önlemek için her göze bir damla yağlayıcı göz jeli yerleştirin.

DC-ERG'leri kaydetmek için altı adımın beşincisini seçmek için adıma tıklayın ve sol ve sağ gözlerin dirençlerini incelemek için empedans kontrol ekranını kullanmak için empedans'a tıklayın. Her gözdeki kayıt elektrotlarının empedans değerleri benzer olmalıdır. Hem zemin hem de referans elektrotlar için empedans değerleri 10 kilohm'dan az olmalıdır.

Sol ve sağ gözlerin izlerini görüntülemek için önizlemeyi tıklatın ve kararlı bir taban çizgisinin elde edilmesi için 10 dakika kadar bekleyin. Ardından, izleme önizlemesini çıkmak için dur'u tıklatın ve kaydı başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Burada, koşullu nakavt ve yabani farelerden örnek bir veri kümesi gösterilir.

Bu analizde, iz elektrotdakika kabarcıkları muzdarip. İzdeki tepeden tepeye gürültüyü arttırdı. Ayrı bir analizde, kabarcıklar elektrot tutucu standları içinde mikroelektrotlar montaj önce vakum odası kullanılarak ortadan kaldırıldı.

İlk 25 saniyeye en uygun çizgiler hesaplanabilir, böylece sürüklenme düzeltilmiş yanıtların yeniden çizilmesi ve DC-ERG bileşenlerinin genliklerinin tanımlanması na olanak sağlar. Beklendiği gibi, RPE tedavi 7.1 potasyum kanallarının azaltılmış ifade büyük ölçüde c-dalgası ve hızlı salınım zayıflatır, retinal pigment epitel elektrik özellikleri önemli bir bozulma gösteren. Burada, DC-ERG bileşenlerinin göreli genlikleri, yabani tip normalleştirilmiş ve göreceli iki büyük ışık uyarılmış a-dalga genlikleri karşı çizilmiş, gösterilir.

Bu analiz şekli RPE'nin azaltılmış elektriksel yanıtlarının sadece fotoreseptör aktivitesinin azaltılmasıyla hesaplanıp hesaba katılmayacağını belirleyebilir. Veya RPE kaynaklanan altta yatan bir kusur varsa. Fare kaydına geçmeden önce kararlı bir taban çizgisi elde etmeyi ve elektrotları tanıtılan kabarcıklar için periyodik olarak yeniden denetlemeyi unutmayın.

Koyu adapte OLG'ler, koni güdümlü retina fonksiyonunu ölçmek için DC-ERG'den önce kaydedilebilir. Koni güdümlü retina tepkilerini değerlendirmek için DC-ERG'den sonra ışıkla uyarlanmış ERG'ler de yapılabilir.