Name: SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin, bitki metabolizması ve gelişiminde inositol polifosfatların biyosentezini açıklamak için SAX-HPLC kullanarak radyoaktif etiketli çözünür inositol polifosfatların ekstraksiyonunu ve niceliğini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında finanse edilmiştir - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob), Araştırma Eğitim Grubu GRK2064 ve bireysel araştırma hibe SCHA1274/4-1 ve SCHA1274/5-1 G.S.'e. Li Schlüter ve Brigitte Ueberbach'a da teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada bitki özlerinde PP-InsPs dahil InsPs ölçmek ve bu yöntemin nasıl kurulabilir pratik ipuçları sağlamak için çok yönlü ve hassas bir yöntem salıyoruz. Protokol genellikle sağlam olsa da, suboptimal çalışır ve analizler oluşabilir. Çoğu durumda, bu çalışır güçlü bir azalma ya da yüksek fosforiile InsPs, özellikle PP-InsP türleri InsP7 ve InsP8tam kaybı ile tespit edilebilir. Olası nedenler, bitki materyalinin mikrobiyal kontaminasyonları ve endojen bitki PP-InsP hidrolazlarının yetersiz öğütme ve ekme tamponu ile hemen temas etmeyecek bitki materyalinin erimesi nedeniyle ekstraksiyon sırasında yetersiz deaktivasyonu olabilir. Diğer nedenler arasında nötralizasyon arabelleği yetersiz veya aşırı ilave sayılarak yanlış pH ayarı veya sadece yetersiz numune materyali sayılabilir. Bu genellikle hücrelerde çok düşük miktarlarda mevcut olduğundan ikincisi, PP-InsPs tespit etmek zor yapabilirsiniz. Adım 3.5 sırasında numune materyalinin fazlalığı veya verimsiz kuruma perklorik asitin seyreltilmesine neden olabilir, bu nedenle yetersiz enzim deaktivasyonuna ve insP6 ve PP-InsP'lerin özel kaybına da yol açabilir. Bu protokolde kullanılan tesis malzemesi ve radyoetiketi nin miktarı maliyet ve performansa göre optimize edilebilmiş ve bu nedenle en iyi sonuçları sağlamak için hala yeterli olan en düşük tutara yakındır. Buna ek olarak, sütun reçine yavaş yavaş çözünürlük kapasitesini kaybeder. Bu sürecin ilk işareti (yazarlar için tamamen açık olmayan nedenlerle) HPLC spektrumundaki PP-InsPs gibi yüksek fosforlu InsP türlerinin belirli bir kaybıdır. Daha fazla yaşlanma ile, hatta InsP6 sütun(Şekil 1D)tarafından düzgün çözülmüş olmayacaktır. Bu nedenle, yeterli bir sütunun kullanımının yanı sıra numunenin titizlikle taşınması ve HPLC bileşenlerinin doğru bakımı doğru sonuçların sağlanması için çok önemlidir.
Numuneleri ve çalıştırmaları karşılaştırırken, özellikle farklı ekipmanlarla (örneğin, HPLC sistemleri ve sütunları) veya farklı günlerde oluşturulduğunda, numunelerin birbirleriyle normalleştirilmesi (adım 7.3'te açıklandığı gibi) ve bunları aynı şekilde analiz etmek çok önemlidir. Sadece normalleştirme yoluyla aynı grafikte birden fazla örnek göstermek mümkündür (Şekil 3). Toplam InsPs'e veya başka bir InsP türüne göre tek tek InsPs'lerin sayısallaştırılması için, yalnızca göreli değerler ve mutlak değerler gösterilmedikçe normale dönmek gerekmez. İdeal olarak, hem InsP profilleri hem de nicelikselleştirmeler gösterilir. Ancak, bazı durumlarda aynı grafikte iki veya daha fazla çalıştırmayı yeterli şekilde göstermek mümkün değildir. Farklı saklama süreleri veya farklı arka plan aktivitesi düzeyleri, tek başına ölçülmemiş SAX-HPLC profillerini karşılaştırmayı zorlaştırabilir. Birçok örnek karşılaştırılmak gerektiğinde aynı doğrudur. Bu gibi durumlarda, bireysel tepe ölçme için ek bir yazılım (örneğin, Origin) kullanılarak daha fazla değerlendirme gereklidir.
Yazarlar burada açıklanan protokolün optimize edilebildiğini ve her bir araştırma sorusuna uyarlanması gerektiğinin farkındadırlar. Arabidopsis özleri için optimize edilmiş olmasına rağmen7,17 Bu protokolde, bu yöntem çok yönlüdür ve diğer bitki türlerinin InsP profillerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir. Burada ilk kez l. japonicusiçin bir InsP profili sunarak bu olasılığı örneklemektedir , hangi etiketleme koşulları hiçbir değişiklik gerekli, InsP çıkarma veya SAX-HPLC çalıştırmak (Şekil 2). Özellikle, genel olarak benzer olmakla birlikte, L. japonicus ve Arabidopsis InsP profilleri arasında farklılıklar gözlenmektedir. Örneğin, L. japonicus InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH] daha fazla InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH] Arabidopsisgöre , nerede InsP5 [1-OH] veya enomerantiic formu InsP5 [3-OH] daha fazla dır Baskın InsP türleridir.5 Aynı şekilde, medya bileşimindeki değişikliklerin, [3H]- myo -inositolkonsantrasyonu,bitki yaşı, çevre koşulları (örneğin, ışık ve sıcaklık), kimyasal bileşiklerin eklenmesi veya diğer faktörler arasındaki bitki-mikrobiyal etkileşimlerin analizlerinin test edilmesi ve uyarlanabileceği öngörüyoruz.
Bu yöntemin dikkate alınması gereken önemli bir dezavantajı etiketleme çoğu kara bitkileri için fizyolojik bir ortam temsil etmez (steril) sıvı kültür, yapılır olmasıdır. Buna ek olarak, [³H]-myo-inositol yüksek maliyetler nedeniyle, etiketleme çözeltisi hacmi ve kültür kabının boyutu genellikle sınırlıdır, hangi da kullanılabilir bitkilerin boyutunu kısıtlar. Sıvı kültürde ekimi doğrudan örneğin toprakta yetiştirilen bitkilerin yaprakları [³H]-myo-inositol ve daha sonra burada açıklanan protokolü izleyerek sızma önlenebilir, daha önce bildirilen10.
Bu protokolün, TiO2 pull-down ve ardından PAGE veya kütle spektrometresi teknikleri gibi alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çeşitli dezavantajları vardır. [3H]-myo-inositol etiketlemesi nedeniyle, sonunda sadece radyoetiketli myo-inositol'den kaynaklanan InsP türleri tespit edilir. Burada açıklanan yöntem scyllo-inositol ve diğer izomerleri bazı bitkilerde tespit edilmiştir gibi diğer Ins izomerleri kör44. Ayrıca, diğer yollardan elde edilen myo-InsPs, miyo-inositol ve myo-inositol-3-fosfat isomerizasyonu yoluyla miyo-6-fosfat, miyo-inositol-3-fosfat sintaz (MIPS) proteinleri45de novo sentezi ile sentezlenenler de dahil olmak üzere dışlanacaktır. [32P] veya[33P]-orto-fosfat alternatif etiket olarak kullanılabilse de, bunların kullanımı büyük bir dezavantaj teşkil eder, çünkü bol nükleotitler ve türevleri de dahil olmak üzere her fosfat içeren molekül etiketlenecektir. Bu moleküller de bu protokol ile ayıklanabilir ve SAX sütununa bağlanabilir, hangi bireysel InsP zirveleri belirlenmesi ile müdahale edecek arka plan aktivitesi yüksek düzeyde neden olacak5. Buna ek olarak,[32P]- veya [33P] -etiketli InsPs ve PP-InsPs'lerin sayısallaştırılması fosfat ve pirofosfat moiety cirosundan güçlü bir şekilde etkilenebilir ve inositol türleri için kitlesel bir okuma rapor olmayabilir.
Diğer taraftan, [3H]-myo-inositol özellikle myo-inositol içeren molekülleri etiketler. InsPs, inositol içeren lipidler, fosfoinositititler gibi, ve galactinol bu durumda etiketli. Ancak, lipidler ekstraksiyon tamponunda çözünmez olduğundan ve galactinol SAX sütununa bağlanmadığından, sadece InsPs bu protokol ile analiz edilecektir.
Şimdiye kadar, tio2 pulldown/PAGE tarafından belirlenen bir etiketle karşılaştırıldığında [3H]-myo-inositol etiketlemesi tarafından oluşturulan bir bitki InsP profilinden farklar bilinmemektedir, çünkü bu tür karşılaştırmalar bitkilerde yapılmamıştır. Hayvan hücreleri üzerinde yapılan yeni bir çalışmada bu soru46ele alınmıştır. Bu çalışmada, glukoz-6-fosfattan doğrudan türetilmiş olması gereken [3H]-myo-inositol etiketleme tarafından görülemeyen insP6 havuzu, SAX-HPLC profilleri nin memeli hücre hatlarının PAGE jelleri ile karşılaştırılması yla tanımlanmıştır. 24 saat fosfat açlığı, TiO2 pulldown kullanılarak saflaştırılan InsPs PAGE jellerini ölçerken InsP6'da %150'lik bir artışa yol açtı. [3 H]-myo3-inositol etiketli hücrelerin sax-HPLC analizleri aynı şekilde tedavi edilen hücrelerin sadece %15 oranında bir artış gösterdiğini[3H]-InsP6. Daha önce de belirtildiği gibi, InsP5'ten daha düşük InsPs çoğu durumda PAGE analizi ile tespit edilemez. SAX-HPLC'nin ardından gelen radyoetiketleme, kütle spektrometrik protokolleri bu negatif yüklü molekül grubunu tespit etmek için optimize edilmedikçe tercih edilen yöntem gibi görünmaktadır.
Kalan bir diğer zorluk sax-HPLC analizlerinde (veya InsP analizi için başka bir yöntemde)10,,17enantiomerleri ayırt etmektir. Bu sorun chiral seçiciler eklenmesi ile ele alınabilir, yani, L-arginin amid gibi enantiopure bileşiklerin ilgili enantiomerik moleküller ile etkileşim e-diyanjiyom kompleksleri oluşturmak için10. Bildiğimiz kadarıyla, bu yaklaşım sadece enantiomerik InsP5 izomerleri InsP5 [1-OH] ve InsP5 [3-OH] NMR analizleri10tarafından ayırt etmek için uygulanmıştır. Diğer enantiomerik çiftlerin ayrımcılığı veya chiral SAX-HPLC analizi veya chiral PAGE tabanlı yöntemlerle enantiomerlerin başarılı bir şekilde ayrımcılığı henüz rapor edilmemiştir ve daha da geliştirilmelidir. Korunmuş sentezi ve pp-InsPs korunmuş düzenleme fosfor kullanılabilirliği ile göz önüne alındığında, biz page veya MS tabanlı yöntemler gibi özellikle radyoaktif olmayan yöntemler, besin analizleri ile birlikte, bitkileri besin eksiklikleri teşhis etmek için tasarlanmış uzaktan algılama verileri kalibre etmek için zemin doğrulayıcı çabaları yardımcı olacağını öngörüyoruz17,18,24,25. Ancak, burada sunulan yöntem şu anda hala InsP analizleri için altın standart olarak kabul edilebilir ve bitkilerde bu ilginç haberciler yeni işlevleri keşfetmek için etkili olacaktır.

Neredeyse kırk yıl önce, inositol fosfatlar (InsPs) sinyal molekülleri olarak ortaya çıktı, Ins sonra (1,4,5)P3 (InsP3) hayvan hücrelerinde Ca2 reseptör aracılı salınımını aktive ikinci bir haberci olarak tespit edildi1,2. Bugüne kadar, hiçbir InsP3 reseptörü (IP3-R) bitkilerde tespit edilmiştir, hangi bitki hücrelerinde InsP3 için doğrudan bir sinyal rolü sorular3. Ne olursa olsun, InsP,3 ,belirli sinyal yolları3,4,5,,6,,7,8düzenlenmesi de dahil olmak üzere, çeşitli bitki gelişim süreçlerinde yer alan diğer InsPs için bir öncü olarak hizmet vermektedir. Örneğin, InsP3 daha fazla insP6fosforile edilebilir , ayrıca fosfat önemli bir kaynağı temsil eden "fitik asit", myo-inositol ve katyonlar, ve patojenlere karşı bitki savunma önemli rol oynadığı gösterilmiştir, mRNA ihracat ve fosfat homeostasis5,9,10,11,12.
Inositol pirofosfatlar (PP-InsPs) en az bir yüksek enerjili di-fosfo bağı içeren insps bir sınıftır, başlangıçta hayvan hücrelerinde tanımlanan, amip ve maya, onlar çeşitli hücresel süreçlerde kritik rol oynamaknerede 13,14,15. Bitkilerde PP-InsPs üzerinde ufuk açıcı çalışmalara rağmen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, bu moleküllerin biyolojik fonksiyonları ve izomer kimliği hala büyük ölçüde esrarengiz kalır. Model bitki Arabidopsis thaliana, hücresel InsP8 insPtesadüf-algılama yoluyla böcek otobur ve nekrotrofik mantarlara karşı savunma düzenlemek için önerilmiştir 8 ve ASK1-COI1-JAZ reseptör kompleksi tarafından aktif jasmonate17. Ayrıca, Enerji homeostaz ve besin algılama in InsProlleri 8 ve diğer PP-InsPs, yanı sıra fosfat homeostazönerilmiştir 17,23,24,25,26.
Kullanılan biyolojik sistem ne olursa olsun, InsPs çalışırken önemli bir metodolojik sorun bu moleküllerin güvenilir tespiti ve hassas nicelleştirilmesi olmuştur. Hücre ekstrelerinden PP-InsPs dahil insp'leri tespit etmek için kütle spektrometresi tabanlı yöntemler kullanılmıştır. Ancak, bu çalışmalar farklı izomerleri ayırt etmek için başarısızoldu 26,27. InsPs'i analiz etmek için başka bir yaklaşım, TiO2 boncuklarını kullanarak hücre lizatlarından InsP'lerin çekilmesini, ardından eluted InsPs'in poliakrilamid jel elektroforezini (PAGE) kullanır. InsPs sonra ya toluidin mavi veya DAPI24,,28,,29tarafından boyanmış olabilir. Ancak, bu yöntemi kullanarak bitki özlerinden InsP5'ten daha düşük InsPs'leri güvenilir bir şekilde tespit etmek mümkün değildir. Son zamanlarda, insps nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi için [13C]-myo-inositol kullanarak bir yöntem güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC)30alternatif olarak yayınlandı. Bu teknik SAX-HPLC ile karşılaştırıldığında benzer bir duyarlılık elde etmek ve 5-InsP7tespiti sağlamak için bildirilmiştir , hücre özlerinden farklı antimekomerik InsP5 izomerleri ayrımcılık. Ancak, NMR tabanlı yöntemin uygulanması kimyasal olarak sentezlenmiş ve ticari olarak mevcut değildir [13C]-myo-inositol gerektirir. Bu nedenle, çoğu durumda kullanılan yöntem [3H]-myo-inositol, SAX-HPLC31,32,33takip ile örnekleri radyoetiketleme olduğunu.33 Bu teknik, bitkiiçine radyoaktif miyo-inositol alımı ve özel hücresel kinaz ve fosfatazların kombine aktivitesi ile farklı InsPs içine dönüşüm dayanmaktadır.
[33H] etiketli InsPs sonra asit ayıklanır ve SAX-HPLC kullanılarak fraksiyona alınır. Negatif yüklerinden dolayı, InsPs'ler SAX-HPLC sütununun pozitif yüklü sabit fazı ile güçlü bir şekilde etkileşime girerek, kolondaki InsPs'leri aşacak şekilde artan fosfat konsantrasyonları içeren bir tampon degrade ile eluted olabilir. Böylece elüsyon süreleri ayrılacak Olan InsP türünün yük ve geometrisine bağlıdır. Chiral sütunların yokluğunda, sadece non-enantiomerik izomerler bu protokol ile ayrılmış olabilir. Ancak, radiolabeled standartları belirli bir InsP tepe izomrik doğasını atamak için kullanılabilir. Geçmişte çeşitli laboratuvarlar tarafından (biyo)kimyasal yöntemlerle etiketlenmiş ve etiketlenmemiş standartlar oluşturmak veya onları çeşitli hücre ve organizmalardan arındırmak için yapılan birden fazla çaba, belirli InsP türlerine zirveler atamaya yardımcı oldu ve ayrıca bireysel InsPtürlerinin5,7,21,34,,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Ayrıca, bitkilerde PP-InsPs oluşumuna yol açan enzimatik yolların son açıklaması, hem de belirli bir 1-phytase aktivitesi ile bir bakteriyel tip III efektör keşfi, bu analizler için yararlı standartlar oluşturmak için nasıl bilgi sağlamak10,17,18,22,23.
Ortaya çıkan kesirler, trityumun(3H) β çürümesi nedeniyle sıvı bir sintilasyon sayacında ölçülebilir. Artan etiketleme süresi ile, sabit durum izotopik denge ulaşılır, sonra elde edilen InsP profilleri bitkinin InsP durumunu temsil etmelidir31. Bu protokolün diğer mevcut tekniklere kıyasla en büyük avantajı, InsP'lerin doğrudan öncülünün kullanılması ve radyoaktif sinyalin ölçülmesi ile elde edilen yüksek hassasiyettir.
[3H]-myo-inositol etiketli bitkilerden veya diğer organizmalardan elde edilen örneklerin SAX-HPLC'si, insp'lerin metabolizmasını, işlevini ve eylem modlarını daha iyi anlamak için değerli bir aracı temsil eden, alt InsP türlerinden PP-InsP'lere kadar insp'lerin saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılır. Şimdiye kadar, bu yöntem aynı zamanda düşük InsP türlerine özel ilgi ile araştırmacılar için en uygun seçimdir. Bu prosedürün temelleri, hangi protokol burada inşa, daha önceaçıklanan 7,21,31,34, bitki kaynaklı InsPs analizi için özel ayrıntılı bir protokol ve özellikle PP-InsPs hala eksik. Önceki yayınlar, düşük bol PP-InsP'leri güvenilir bir şekilde tespit etmede güçlükler rapor özellikle InsP8, aşağıdaki faktörlerden biri veya daha fazlası nedeniyle: nispeten düşük miktarda bitki materyali, [3H]- düşük spesifik aktivite (> 20 Ci/mmol) ilemyo-inositol), perklorik asit temel olmayan veya 1 M'den daha az konsantre olan ekstraksiyon tamponlarının kullanımı, farklı nötralize tamponlar, ayrıca [3 H] alt-optimal gradyan veya algılama[3H] bir-line dedektörü ile. Bu çalışmalara göre, burada sunulan protokol PP-InsPs7,21,,34güvenilir tespiti için tasarlanmıştır.
Burada, ekipmanın tesis ekimi ve etiketleme, InsP ekstraksiyonu ve SAX-HPLC'nin kendi kendine çalışmasına kadar ayrıntılı bir iş akışı salıyoruz. Yöntem model bitki A. thalianaoptimize edilmiş olmasına rağmen , kolayca diğer bitki türlerini incelemek için değiştirilebilir, burada model baklagil Lotus japonicusilk bildirilen InsP profili ile gösterildiği gibi . Farklı bir bitki türünün kullanımı bazı optimizasyon gerektirebilir rağmen, bu küçük olacağını öngörüyoruz, bu protokol bitki InsPs daha fazla araştırma için iyi bir başlangıç noktası yapma. Olası optimizasyonları kolaylaştırmak için, protokolün içinde değişikliklerin mümkün olduğu her adımı ve yöntemi ilk kez oluştururken zor olabilecek tüm kritik adımları belirtiriz. Ayrıca, bu yöntemle elde edilen verilerin belirli InsP'lerin nicelleştirilmesi nde nasıl kullanılabileceğini ve farklı örneklerin nasıl analiz edilip karşılaştırılabildiğini de rapor ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf AG</td><td>modeli: 5430 R</td><td></td></tr><tr><td>Diamonyum hidrojen fosfat, > % 97</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0268.1</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat, > %99, pa, ACS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 kuyulu şeffaf düz tabanlı TC ile muamele edilmiş çok kuyulu hücre kültürü plakası, kapaklı, ayrı ayrı sarılmış, steril</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı</td><td>LAMBDA Instruments GmbH</td><td>modeli: OMNICOLL tek kanallı kollektör</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme inkübatörü</td><td>poly klima GmbH</td><td>modeli: PK 520-LED</td><td></td></tr><tr><td>HPLC pompaları</td><td>Kontron Instruments</td> modeli: Rheodyne valfleri için <td>420</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şırınga, 1 mL</td><td>Hamilton Company</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td> <td>için enjektörSupelco</td><td>modeli: Rheodyne 9725</td><td></td></tr><tr><td>Inositol, myo- [1,2-3H (N)]</td> <td>Amerikan Radyoaktif Etiketli Kimyasallar A.Ş.</td><td>ART 0261</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen Üniversite</td><td>, Kimya Bölümü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon sayacı</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>model: TRI-CARB 2900TR</td><td></td></tr><tr><td>Mikro havaneli</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CXH7.1</td><td></td></tr><tr><td>Karışık selüloz Eester filtresi, ME serisi (ME 24), düz, 0.2 ve mikro; m gözenek boyutu, 47 mm daire</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>10401770</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Kontron Instruments</td><td>için Mikser modeli: M 800</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog orta, tuz karışımı</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro yazılımı</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ortofosforik asit, &ge; 85 %, p.a., ISO</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>Partisphere 5 &micro; m SAX kartuş sütunu, 125 x 4,6 mm</td><td>Hichrom Limited</td><td>4621-0505</td><td></td></tr><tr><td>Perklorik asit, %70, %99,999 eser metal bazlı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı, kare, PS, şeffaf, 120/120/17 mm, steril</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>pH indikatör kağıdı pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td><td>Merck KGaA</td><td>109564</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum karbonat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>P743.2</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tüpleri, 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>9725 enjektör için numune döngüsü, hacim 2 mL, PEEK</td><td>Supelco</td><td>57648</td><td></td></tr><tr><td>SNAPTWIST sintilasyon şişesi, 6,5 mL</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>S207-5</td><td></td></tr><tr><td>Steril tezgah</td><td>LaboGene</td><td>modeli: ScanLaf MARS 900</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz, > 99,5 %, yıllık</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-Flo AP sıvı sintilasyon kokteyli</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>6013599</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf deiyonize su</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anahtarsız WVS Uç Bağlantı Kiti</td><td>Hichrom Limited</td><td>4631-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

sax-hplc kullanılarak farklı bitki türlerinden Çözünür, radiolabeled inositol polifosfatların ekstraksiyonu ve niceliği

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Inositol fosfat (InsPs) olarak da adverilen miyo-inositolün fosfat esterleri, bitki fizyolojisinde önemli rol oynayan hücresel regülatörler sınıfıdır. Negatif yük, düşük bolluk ve hidrolitik aktivitelere yatkınlık nedeniyle bu moleküllerin saptanması ve ölçülmesi zordur. Bu durum özellikle inositol pirofosfat (PP-InsPs) olarak da adlandırılan 'yüksek enerjili' diphospho bağları içeren yüksek fosforlu formlar için geçerlidir. Yüksek hassasiyeti nedeniyle,[3H]-myo-inositol ile etiketlenmiş bitkilerin güçlü aiyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC) şu anda bu molekülleri analiz etmek için tercih edilen yöntemdir. [33H]-myo-inositol ile radiolabel bitki fideleri kullanılarak, çeşitli antiomerik izomerler de dahil olmak üzere çeşitli InsP türleri tespit edilebilir ve yüksek hassasiyetle ayırt edilebilir. Burada, uygun bir SAX-HPLC sisteminin kurulumu, yanı sıra bitki ekimi, radyolabeling ve SAX-HPLC çalıştırmak ve sonraki veri analizi için InsP çıkarma tam iş akışı açıklanmıştır. Burada sunulan protokol, çeşitli insp türlerinin, çeşitli antimekomerik izomerler ve PP-InsPs, InsP7 ve InsP8dahil olmak üzere ayrımcılığına ve nicelemesine olanak sağlar ve diğer bitki türlerine kolayca adapte edilebilir. Örnek olarak Arabidopsis thaliana ve Lotus japonicus fidelerinin SAX-HPLC analizleri yapılmalı ve tam InsP profilleri sunulmuş ve tartışılmıştır. Burada açıklanan yöntem, Bitkilerdeki InsP'lerin biyolojik rollerini daha iyi anlamak için umut verici bir aracı temsil etmektedir.

Burada gösterilen sonuçlar, teknik ve biyolojik düzeylerdeki değişimlere göre elde edilen olası sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır. Bunlardan ilki, yeni ve yaşlı sütunlar(Şekil 1)ve taze ve depolanmış numuneler(Şekil 3)kullanılarak yapılan analizlerle örneklenirken, ikincisi iki farklı bitki sisteminden alınan ekstreler değerlendirilerek, A. thaliana (Şekil 1, Şekil 3) ve L. japonicus (Şekil 2).
Optimal Bir SAX-HPLC çalıştırmak Şekil 1A\u2012Ctasvir edilir , Hangi scintillation sayma sonra A. thaliana özleri elde edilen tam bir inositol polifosfat spektrumgösterir. Zirvelerin güzelce ayrılmış olduğunu ve daha önce açıklanan kromatografik mobilitelere göre farklı izomerlere (veya enantiomer çiftlerine) atanabileceğini unutmayın5,7.
Şekil 2, Arabidopsis fideleri ile aynı koşullarda yetiştirilen ve etiketlenen L. japonicus fidelerinin SAX-HPLC analizinin temsili sonucunu göstermektedir. Arabidopsis'ten bilinen tüm InsP türleri ve zirveleri görülebilirken, her iki türün profillerini karşılaştırırken belirli InsP izomerlerinin göreceli (örneğin, izomerler arasındaki oranlar) miktarı ile ilgili önemli farklılıklar vardır. Örneğin, Lotus özleri artmış InsP3cgösterdi , InsP4b, InsP5b ve azaltılmış InsP3a, InsP4a, InsP5a ve InsP5c arabidopsis ile karşılaştırıldığında hangi daha fazla araştırma için yer bırakır. Şekil 2D Arabidopsis ve Lotusarasındaki InsP izomerleri arasındaki farklı oranları göstermektedir.
Şekil 3, çıkarmadan sonra bölünen bir örneğin iki InsP profilini gösterir. İlk yarısı hemen analiz edildi ve ikinci yarısı bir gün sonra, -80 °C'de depolandıktan sonra. Farklı örnekler (şekil 3A\u2012Cve Şekil 3D'dekisiyah ve kırmızı çizgiler) arasında yalnızca küçük farklar gözlendiğini unutmayın. Bu, bir donma-çözülme döngüsünün örneğe zarar vermediğini ve yöntemin kendisinin tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Şekil 1: Bu protokol ile gerçekleştirilen başarılı ve başarısız bir SAX-HPLC analizinin tipik InsP profili. (A\u2012C) SAX-HPLC profili 17 günlük yabani tip (Col-0) Arabidopsis fidesi radiolabeled [3H]-myo-inositol. Global InsP ekstraksiyonu ve SAX-HPLC çalışması aynı gün gerçekleştirildi. (A) Tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere5 dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a insP5 [2-OH] temsil eder, InsP5b, InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formunu insP5 [6-OH], InsP5c ise InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formunu temsil eder. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası hala bilinmemektedir. Panel(D),aynı şekilde yetiştirilen bitkilerin SAX-HPLC profilini ancak yaşlı bir sütun (&gt;40 çalışır) kullanarak gösterir. InsP6'da diğer InsP türlerine göre net bir azalma ve PP-InsP yokluğu görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Şekil 2: L. japonicus bitkilerin Temsilci InsP profili. SAX-HPLC profili (A\u2012C) 17 günlük yabani tip (Gifu) L. japonicus fideleri radiolabeled [3H]-myo-inositol. (A) Tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b büyük olasılıkla InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH], ve InsP5c büyük olasılıkla InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH] temsil eder. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası bilinmemektedir. (D) A. thaliana 'nın (Şekil 1A\u2012C'denelde edilen veriler) ve L. japonicus'un (Şekil2A-C'denelde edilen veriler) bireysel InsP türleri (elüsyondan kaynaklanan toplam aktivitenin %'inde) karşılaştırması). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Şekil 3: SAX-HPLC analizlerinin tekrarlanabilirliğini gösteren bölünmüş bir numunenin InsP profilleri. (A\u2012C) 17 günlük yabani tip (Col-0) Arabidopsis fidelerinin SAX-HPLC profilleri [3H]-myo-inositol ile etiketlenmiştir. Çalışmadan önce, numune ikiye bölündü ve bir yarısı hemen, diğer yarısı ise birAgün sonra -80 °C.'de depolandıktan sonra tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a insP5 [2-OH] temsil eder, InsP5a InsP5 [2-OH], InsP5b InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH] temsil eder ve InsP5c insP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH]. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası hala bilinmemektedir. Panel D, Her iki çalıştırmanın InsP6 ve PP-InsPs InsP7 ve InsP8'inin niceliğini gösterir. Değerler miktarı temsil ediyor (% içinde) ilgili InsP türlerinin tüm InsP'ye göre (elüsyondan toplam aktivite 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Hafif bir sintillasyon sayacı kullanarak sıvı sintillasyon için yazılım ayarları. Yazılım sürümünü gösteren ekran görüntüleri ve bu protokolle gerçekleştirilen[3H] örneklerinin sintilasyon sayımı için kullanılan ayarlar gösterilmiştir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: Veri normalleştirmenin temsili örneği. Çalışma sayfasının ekran görüntüsü, SAX-HPLC'yi normalleştirmek için kullanılan tüm adımları ve formülleri gösterir. Basitleştirme için örneklerin yalnızca 25-35 kesirleri gösterilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 3: Analiz yazılımı kullanılarak tepe belirleme, arka plan çıkarma ve entegrasyon. (A) SAX-HPLC analizinden elde edilen veriler yazılıma yüklenir (dakika 28-96) ve tepe analiz aracı seçilir. (B\u2012E) Taban çizgisi, tek tek zirveler arasındaki noktaları ayarlayarak el ile tanımlanır ve arka plan çıkarılır. (F) Tepeler görünüme göre manuel olarak belirlenir ve yayınlanan kromatografik mobiliteler5,7. (G) Tepe aralıkları cpm değerleri ile el ile tanımlanır. (H) Zirveler tüm tepelerin %'si olarak entegre edilir ve hesaplanır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Burada bitkilerdeki inositol polifosfatları tespit etmek ve ölçmek için son derece hassas bir yöntem olan[3H]-myo-inositol etiketli fidelerin güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisini tanımlıyoruz.

SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Burada gösterilen protokol, bitkilerin inositol polifosfatlarının biyosentezinin aydınlatılanın ve bitki metabolizması ve gelişiminin belirli yönlerindeki rolleriyle ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İnositol fosfatların radyoaktif olarak etiketlenmiş öncülü bitkilerdeki tüm inositol fosfat türlerinin güvenilir şekilde tespit edilmesine olanak sağladığından bu yöntem son derece hassastır. Çoğu bitki biyologları HPLC analizi ve gerekli kurulum aşina olduğu için bu yöntemin görsel gösteri önemlidir.Buna ek olarak, bu protokolün kritik adımları, inositol fosfat çıkarma gibi, uygun gösteri olmadan takip etmek zordur. İki bağımsız HPLC pompaları oluşan bir sistem kurarak başlayın, tampon A ve tampon B.Her pompalar için bir bilgisayar veya ana pompa ile birlikte kontrol edilmesi gerekir. Her iki pompa için de yerçekimi kuvveti veya üçüncü bir alçak basınç pompası ile pistonlu conta yıkama uygulayın.Her iki pompayı da dinamik bir miksere bağlayın, ardından mikseri en az bir mililitre kapasiteye sahip bir numune halkası ile bir enjeksiyon valfine bağlayın. Enjeksiyon valfini kolona ve kolonu kesir toplayıcısına bağlamak için kılcal damarlar kullanın. Deiyonize suda %0,8 bakteriyolojik agardan oluşan katı büyüme ortamıyla dolu kare Petri kaplarında bir sıra halinde lotus tohumu ekin.Tohumların karanlıkta en az üç gün boyunca dört santigrat derecede tabakalamasını bekleyin. Tohumları bir büyüme kuluçka makinesine yerleştirin. 10 ila 20 fideyi% 1 sakaroz ile desteklenen ve pH 5.7 ayarlanmış yarım güçlü MS tuz çözeltisi iki mililitre ile dolu 12-iyi net düz alt hücre kültür plakası bir kuyu içine aktarın.Plakaya 3H miyo-inositol 45 mikrocurie ekleyin ve yavaşça girdap. Bir kapak ile plaka kapağı ve mikro gözenekli cerrahi bant ile mühür. Sonra büyüme kuluçka içine geri yerleştirin.Etiketleme beş gün sonra, medyadan fide kaldırmak ve deiyonize su ile kısa bir süre yıkayın. Kağıt havlu ile kurulayın ve tüp overfill değil emin olun, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine aktarın. Snap tüpü sıvı nitrojenle dondurun ve ekstraksiyona kadar eksi 80 derecede saklayın.Dondurucudan numuneleri alın ve kullanıma hazır olana kadar sıvı nitrojende saklayın. Onlar erime başlayana kadar bir mikrosantrifüj tüp havaneli ile grind, sonra buz soğuk çıkarma tampon 500 mikrolitre ekleyin. Numune homojenize olana ve çözelti renklendirinceye kadar taşlama devam edin.18, 000 kez G ve dört derece santigrat derece 10 dakika için örnekleri santrifüj. Sonra taze bir 1.5 mililitrelik tüp içine supernatant aktarın. Ekstraksiyon için kullanılan tüpler katı radyoaktif atık olarak kabul edilir ve buna göre bertaraf edilmesi gerekir.Dikkatle hemen proteinlerin yağış ve köpüren neden olacak ekstresi, nötralizasyon tampon 300 mikrolitre ekleyin. Bir dakika sonra, pH'ın yedi ile sekiz arasında olduğundan emin olmak için numuneyi bir pipet ucu ve pipet beş mikrolitre pH kağıdına karıştırın. Gerekirse, istenilen pH'a ulaşılına kadar nötralizasyon tamponu veya çıkarma tamponu küçük miktarlarda ekleyin ve numunelerin açık bir kapakla en az bir saat buzun üzerinde dinlenmesine izin verin.Sonra 10 dakika santrifüj ve taze bir 1,5 mililitrelik tüp içine supernatant aktarın. Fraksiyon kolektörü 96 küçük sintilasyon şişeleri ile donatın ve her şişeyi düşük pH tamponları ve yüksek amonyum fosfat konsantrasyonları ile uyumlu uygun bir sintillation kokteyliki mililitre ile doldurun. HPLC sistemini çalıştırın, ardından pistonlu conta yıkamayı etkinleştirin ve tüm çalışma boyunca aktif tutun.Numuneye uygun bir şırınga ile elle enjekte edin. Pompaları ve degradeyi çalıştırın. HPLC çalışması devam ederken, basıncı düzenli olarak kontrol edin.Başlangıç basıncı 18-24 bar civarında olmalı ve %100 tampon B'ye ulaşıldıktan sonra yavaşça 50-60 bar'a yükselmelidir. Koşudan sonra, şişeleri sıkıca kapatın ve karıştırmak için Scintillation kokteyli ile kesirleri şiddetle sallayın. Doğrudan ölçüme devam etmiyorsanız, şişeleri karanlıkta dik bir konumda tutun.Kesirleri ölçmek için, şişeleri küçük şişelere uyan raflar kullanarak Sintillation sayacı raflarına yerleştirin ve her şişeyi sıvı bir sintillation sayacında beş dakika ölçün. Dakika başına ölçülen sayımların veya CPM'nin bekletme süresine göre çizildiği bir 2B satır grafiği hazırlayın. Örnekleri birbiriyle karşılaştırmak için, her bir örnek için her eluted kesirden 25 ila 96 dakikadan cpm'yi özetleyerek ve toplam CPM'yi bu örnekten diğer örneklerin toplam CPM'sine bölerek verileri normalleştirin.Belirli inositol polifosfat zirvelerinin göreceli niceliklerini gerçekleştirmek ve daha sonra istatistiksel analizler için çoğaltma verilerini içeren çubuk grafikler oluşturmak için, kromatografilerin en yüksek alanlarını hesaplayabilen özel bir yazılımla analize devam edin. Sintillasyon sayımı ndan sonra A.thaliana özlerinden elde edilen tam bir inositol polifosfat spektrumu burada gösterilmiştir. Zirveleri güzel ayrılmış ve farklı izomerleri atanabilir.Yaşlı bir kolon kullanıldığında, inositol hekakisfosfat ın net bir azalması ve inositol pirofosfat yokluğu görülebilir. Arabidopsis fideleri ile aynı koşullarda yetiştirilen ve etiketlenen L.japonica fidelerinde de SAX-HPLC analizi yapıldı. Arabidopsis'ten bilinen tüm inositol polifosfat türleri ve zirveleri görülebilse de, iki tür arasında spesifik inositol polifosfat izomerlerinin göreceli miktarlarında farklılıklar vardır.Örneklerin ekstraksiyondan hemen sonra analiz edilmesi gerekmediğini göstermek için, bir numune nin bir kısmı eksi 80 santigrat derecede depolandıktan sonraki gün iki ve yarısına bölündü. Taze ve dondurulmuş numunelerin SAX-HPLC profilleri arasındaki farklar önemli değildi, bu da bir donma-çözülme döngüsünün numuneye zarar vermediğini ve yöntemin kendisinin tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini gösterdi. Bu protokolü denerken, her zaman iyice, dondurulmuş ve ekstraksiyon tampon ile örnekleri eziyet ve SAX-HPLC analizi için radyo etiketli inositol fosfat maksimum kurtarma sağlamak için nötralizasyon sonrası nötr pH yakın hedefliyoruz.Daha sonra kullanılmak üzere bir SAX-HPLC çalıştırmak radyo etiketli arındırmak mümkündür, örneğin scintillation kokteyller olmadan kesirler toplayarak ve sadece küçük aliquots ölçerek karşılıklı reaksiyonlar.

extraction-quantification-soluble-radiolabeled-inositol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

Bitki biyokütle yakıt, yem, gıda ve malzemelerin çeşitli dahil olmak üzere birden fazla ürün için bir yenilenebilir kaynak sunuyor. Bu yazıda tütün ağacı (Nicotiana glauca) ve bir Biorefinery boru hattı için kavak olarak uygun kaynaklarının özelliklerini incelemek.

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

Bu protokol, model örnek olarak Fransız fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris) kullanılarak bitki yapraklarından apoplast yıkama sıvısının optimize edilmiş ekstraksiyonunu detaylandırır.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır Phaseolus vulgaris Bir örnek olarak

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Burada, öğütülmüş bitki materyallerinden glukozinolatların ekstraksiyonu için yerleşik ve sağlam bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ekstraktların kolon üzerinde sülfataz muamelesinden sonra, desülfoglukozinolatlar ayrıştırılır ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile analiz edilir.

Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi ile Glukosinolat Ekstraksiyon ve Analiz A Basit Yöntemi (HPLC)

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.

HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama

Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

Öğrenin, bitki metabolizması ve gelişiminde inositol polifosfatların biyosentezini açıklamak için SAX-HPLC kullanarak radyoaktif etiketli çözünür inositol polifosfatların ekstraksiyonunu ve niceliğini.

SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği

Daha fazla video keşfet