Name: GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, dmp1-topaz transgenik farelerden GFP eksprese eden primer osteositleri FACS ile izole etme yöntemini. Bu protokol, kemik metabolizması ve hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek verimli hücre elde etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (No. 19K10397'den H.K.'ye ve No. 18K09862'den I.M.'ye).

Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu
<ol><li>Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.</li>
	<li>Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.</li>
	<li>Makas ve cımbız kullanarak, kafatasının tabanındaki cildi tutun ve bir kesi yapın.</li>
	<li>İlk insizyonu başlangıç noktası olarak kullanarak, kafatasının her iki lateral tarafını kulakların önünde kesin, cildi çıkarın ve kalvariyi açığa çıkarın.</li>
	<li>Kafayı burun köprüsünden tutun ve lambdoid sütür boyunca kalvariyi kesin. Parietal kemiklerin yanal kenarları boyunca kesin ve ön kısmı içerecek şekilde genişletin.</li>
	<li>Kalvariyi altta yatan beyin dokusundan ayırın. NOT: Minimal yumuşak doku ekine sahip temiz bir kemikli kalvari sağlamak için kemiğin derinliklerine kesilmemelidir; referans olarak, kemiğin altındaki makasın gölgesini görebilmelidir.</li>
	<li>Kalvariyi fosfat tamponlu saline aktarın (protokol boyunca PBS, pH 7.4). İçbükey kısmın yukarı baktığından emin olun.</li>
</ol>2. Yenidoğan fare kalvarisinin fraksiyonasyonu
<ol><li>5 mL 2 mg/mL kollajenaz çözeltisi içeren 50 mL'lik bir konik tüpe 5 kalvariye kadar aktarın. Kullanımdan hemen önce hazırlanan taze kollajenaz çözeltisini kullanın.<ol><li>Taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlamak için, 2 mg / mL'de izolasyon tamponuna (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 5 mg / mL glikoz ve 25 mM HEPES) kollajenaz tozu ekleyin. Kollajenaz tozunu manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün.</li>
		<li>Kollajenaz çözeltisini 0,22 μm'lik steril bir filtre ünitesinden 50 mL'lik bir tüpe çalıştırın ve protokol boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kesir 1'i elde etmek için kalvariyi 37 ° C'de 20 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Fraksiyon 1'in sindirimini atın, kalvariyi 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve yıkamayı atın.</li>
	<li>PBS'de 1 mg/mL BSA içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 37 °C'de PH 7.4 içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içindeki kalvariyi inkübe edin.</li>
	<li>Sindirimi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Kalvariyi 5 mL PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu sindirime ekleyin. NOT: Sindirimin toplanması ve yıkanmasının her noktasında, hücreleri kemikten ayırmak ve çiftleri ve hücre agregalarını önlemek için kemikleri çözeltilerinde pipetleyin.</li>
	<li>Fraksiyon 2'yi elde etmek için, sindirimi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 IU / mL penisilin G ve 100 μg / mL streptomisin içeren 8 mL α-Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) tekrar askıya alın. 10 cm'lik bir kültür kabına tohumlayın. Fraksiyon 2'yi 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.</li>
	<li>Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 3'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 3'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin. NOT: Bu noktada kemikler küçülecek ve parçalara ayrılacaktır. Hiçbir kemiğin yanlışlıkla sindirimlere aspire edilmemesini ve bu da süreçte hücre kaybına yol açmamasını sağlamak için, özetleri toplamak için küçük bir uç pipeti kullanın (1000\u2012200 μL pipet uçları).</li>
	<li>Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 4'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 4'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin.</li>
	<li>Kalvariyi, PBS'de (pH 7.4) 1 mg/mL BSA içeren 5 mL 5 mM EDTA'da, 37 °C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 5'i toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 5'i 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin. Osteositler aynı gün sıralama için hazırlanabilir veya sıralamadan önce 24 saate kadar kültürlenebilir.</li>
</ol>3. Floresan aktive hücre sıralaması için osteositlerin hazırlanması
<ol><li>Her hücre fraksiyonunun ortamını aspire edin ve iki kez 10 mL PBS ile nazikçe yıkayın.</li>
	<li>PBS'ye 5 mL% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri nazikçe ayırmak için 5 mL% 10 FBS α-MEM ve pipet ekleyin. Her fraksiyondaki hücreleri, 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne eleyerek birleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne elenerek toplayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve pelete% 10 FBS α-MEM ekleyin. Hücre konsantrasyonunu yaklaşık 1 x 107 hücre/mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri 35 μm naylon ağ kapaklı bir tüpte filtreleyin. Hücreler artık FACS için hazırdır.</li>
	<li>Bu protokol için 100 μm boyutunda bir nozul kullanın. Toplama sıvısı %10 FBS α-MEM'den oluşmalıdır. Numuneyi karıştırma sırasında ve mümkünse sıralama boyunca 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Sıralamadan önce, yan saçılma (SSC) alanını ve ileri saçılma (FSC) alanını ayarlayarak yapıları ve hücreleri kaldırmak için geçidi en iyi duruma getirin. SSC genişliğini SSC-Yüksekliğine ve FSC alanını FSC-genişliğine göre ayarlayarak çiftleri ortadan kaldırın. GFP-negatif osteositler, sıralama cihazının parametrelerini ayarlamak için bir kontrol olarak kullanılmalıdır.</li>
	<li>Hücre toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Hücreleri yeniden askıya alın ve %10 FBS α-MEM kullanarak sayıyı istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yaklaşık% 70 olarak bel...

Osteositler, salgılanan matriks1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi2 ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme3'e adaptasyon sağlayan birincil mekanosensoriyel hücrelerdir, fosfat homeostazı4 ve kemik matriks mineralizasyonundarol alırlar 5 ve lakunokanaliküler sistemle birlikte uzak dokuları işaret eden endokrin bir organ görevi görürler6.
Osteositler, erişilebilirliği sınırlayan ve izolasyonlarını zorlaştıran, böylece in vitro araştırmayı engelleyen mineralize bir matris içinde yer almaktadır. İlk izolasyon yöntemlerinden biri, daha sonra PHEX'in kuş varyantı olarak bilinen osteosit spesifik bir monoklonal antikor (OB7.3)7 kullanarak tavuk kalvarisinden izole osteositleri tanımlamıştır (X kromozomundaki Endopeptidazlara homoloji ile PHosfat düzenleyici gen)8. Diğer araştırmacılar, osteosit saflığının yaklaşık% 70 olduğu bildirilen osteosit bakımından zengin fraksiyonlar elde etmek için sıçan9 veya fare10 uzun kemiklerinin sıralı sindirimini kullandılar9. Bu prosedürün sınırlamaları, osteositlerin yanı sıra diğer hücre tipleriyle kontamine olmuş kültürlerin optimal olmayan saflığını ve osteositlerin bölünme yeteneğini kaybettiği için osteositlerin kültürdeki diğer hücreler tarafından potansiyel olarak büyüyebileceğini içerir. Bu zorluklar uzun vadeli kültürlerin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı osteosit hücre hatları geliştirilmiştir. MLO-Y4 hücre hattı11 ve MLO-A5 hücre hattı12, özellikle erken evre osteositlerin incelenmesi için yararlı olan en yaygın olarak çalışılan hücre hatlarıdır; Bununla birlikte, her ikisi de olgun osteosit belirteçleri olan düşük sklerostin ve FGF2313 seviyelerini ifade ettikleri için olgun osteosit sinyallemesini incelemek için daha az faydalıdırlar. IDG-SW314 ve Ocy45415 dahil olmak üzere diğer hücre hatları, yüksek seviyelerde sklerostin ve FGF23 eksprese eder ve geç osteosit evresinin incelenmesinde yararlıdır. Hücre hatlarının yararlı araştırma araçları olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, birincil hücrenin biyolojisini tam olarak temsil etmedikleri için sınırlama olmaksızın gelmezler. Farklı hücre hatları, osteosit olgunluk spektrumunun farklı gelişim aşamalarını temsil eder ve hücre hatları, primer osteositlerin heterojenliğini temsil edemez16,17.
Primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için araştırmacılar, osteositlerde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendirmek için 8-kb dmp1 promotörünün kullanıldığı cre fare modelinden yararlandılar18,19. Paic ve ark.19 tarafından çift transgenik fareler (pOB-Col 2.3- GFP-camgöbeği ve DMP1-GFP-topaz) ve Nakashima ve ark.20 tarafından dmp1-topaz transgenik fareler osteosit popülasyonları elde etmek için kullanılmıştır. Primer osteositlerin kültürlerini elde etmek için GFP'yi ifade eden osteositlerin sıralı sindirim ve FACS'sini kullandılar19,20. TdDomates proteinini aktive eden 10 kb dmp1 muhabir fare Ai9'daki cre yönünün, osteositlerde, osteoblastlarda, kaslarda ve kemik iliğindeki hücrelerde mevcut olduğu gösterilmiştir. 8-kb dmp1 promotörü aynı ekspresyon modeline sahipti, ancak osteoblastların ve kemik iliği hücrelerinin sadece bir kısmı proteini ifade etti, bu da 8-kb dmp1 promotörünün daha spesifik21 olduğunu gösteriyor. Buna rağmen, 8-kb dmp1 promotörü kullanılarak elde edilen sonuçlar dikkatle yorumlanmalı ve elde edilen popülasyonun yeterince yüksek saflıkta olmasını sağlamak için osteosit ve osteoblasta özgü belirteçler kullanılarak gen ekspresyon profilleri rutin olarak gerçekleştirilmelidir.
Osteoklast belirteçleri OSCAR ve Dcstamp, hematopoetik tükenmemiş ve tükenmiş osteosit popülasyonlarında bulundu, bu bulgu yazarları 8-kb dmp1-topaz yenidoğan kalvarisinin fraksiyonasyonundan ve GFP ayıklamasından elde edilen sindirimlerin hematopoetik hücrelerle kontamine olduğu sonucuna götürdü. GFP-pozitif hematopoetik hücreler GFP-pozitif mezenkimal hücrelerden (osteositler)22 oldukça düşük GFP yoğunluğuna sahip olduklarından, GFP sıralama kapısının sıkılaştırılmasıyla hematopoetik hücrelerle kontaminasyon azaltılabilirdi.
Osteositleri in vitro olarak incelemek için kullanılan yöntemler, osteosit biyolojisi hakkındaki son zamanlardaki bilgi zenginliğine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, osteosit izolasyonu, düşük hücre verimi ile emek yoğun ve uzun süren bir prosedür olmaya devam etmektedir. Kollajenaz ve EDTA kullanılarak sıklıkla fraksiyon 823'e kadar tarif edilen kemik sindirim yöntemi, osteosit canlılığının vergilendirildiği birkaç saat sürer. Araştırmacılar, hücre sıralaması 20 için fraksiyonlar (2\u20125) kullandıklarını bildirmişlerdir ve osteositlerle ilişkili genlerin osteoblastlarınkilere karşı ekspresyon profilinin, saf osteosit popülasyonlarının izole edilmesinin başarısını doğruladığını göstermiştir20. Bu makalede, fraksiyon elde etme sürecini (2\u20125) açıklayacağız ve her fraksiyondaki osteositlerin geri dönüşünü belirlemek için fraksiyon 1 ila 8 ile başlayan her fraksiyondan osteositlerin verimini karşılaştırıyoruz. Ayrıca, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve kollajenaz ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak kalvaryal sindirimin yanı sıra FACS için hücrelerin hazırlanmasını da tanımladık.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Veri toplama ve analizi</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Hücre Süzgeç Kapaklı Tüp, 35 & mu; m naylon ağ.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich, MO, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Wako, Osaka, Japonya</td><td>034-22363</td><td>% 0.2 (a/h), C. histolyticum'dan elde edilen ham kollajenaz karışımı.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japonya</td><td></td><td>%0.1 BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> ile hazırlanmış 5mM EDTA <tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Fransa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon tamponu</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, %0.1 (a/h) BSA, %0.5 (a/h) glikoz ve 25 mM HEPES</td></tr> ile hazırlanmıştır. <tr><td>Millex Steril Filtre Ünitesi</td><td>Merck Millipore, İrlanda</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&mu; m</td></tr><tr><td>Naylon hücre süzgeci</td><td>FALCON, NY, ABD</td><td></td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri, NY, ABD</td><td></td><td>%0,5 x10. PBS</td></tr><tr><td>&alfa;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japonya'da</td><td></td> x1'e seyreltilmiş <td>%10 fetal sığır serumu, 100 IU/ml penisilin G ve 100 &mu içeren; g/ml streptomisin</td></tr></tbody></table>

gfp eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.
Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle23'ü sıralamak için fraksiyonların (1\u201...

Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.

GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primer osteosit izolasyonu, genellikle düşük hücreli alanlarda bırakılan uzun bir prosedürdür. Bu protokol, yüksek sayıda primer GFP eksprese eden osteositin izole edilmesi için etkili yöntemler sağlar. Bu protokol, işlem süresini azaltır ve hematopoietik veya mezenkimal hücrelerden minimum kontaminasyon ile tek bir prosedürde daha fazla sayıda osteosit elde edilmesini sağlar.GFP eksprese eden osteositlerin izolasyonu için, ötenazi yapılmış, doğum sonrası altı ila yedinci gün, transgenik fare yavrularını tedavi edilmemiş bir kültür kabına yerleştirin ve kafatasının tabanındaki cildi kavramak için makas ve cımbız kullanın. Kaldırılan deride ilk kesiyi yapmak için makası kullanın, ardından kulakların önünde kafatasının her iki tarafı boyunca kesikler yapın. Kalvaria'yı ortaya çıkarmak için cildi çıkarın ve başı burun köprüsünden tutarak, kalvaria'yı lamboid sütür boyunca ve parietal kemiklerin kenarları boyunca dokunun ön kısmına doğru kesin.Kalvaria'yı alttaki beyin dokusundan ayırın ve kemikleri içbükey tarafı yukarı bakacak şekilde PBS'ye yerleştirin. Birinci fraksiyonu elde etmek için, mililitre başına beş mililitre taze hazırlanmış iki miligram kollajenaz içinde 50 mililitrelik tüp başına beş kalvaria toplayın ve dokuları 20 dakika boyunca 37 santigrat derece ve dakikada 300 devirde inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, sindirimi birinci fraksiyondan atın ve calvaria'yı beş mililitre PBS ile yıkayın.Yıkamayı, PBS'de mililitre sığır serum albümini başına bir miligram ile desteklenmiş beş mililitre beş milimolar EDTA ile 37 santigrat derecede 15 dakika çalkalayarak değiştirin. Kuluçka işleminin sonunda, sindirimi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve calveria'yı beş mililitre PBS ile yıkayın. Ardından yıkama solüsyonunu sindirime aktarın.İkinci fraksiyonu elde etmek için, sindirimi santrifüjleme için yerleştirin ve süpernatanı atın. Peletleri% 10 fetal sığır serumu veya FBS ve antibiyotikler içeren sekiz mililitre alfa minimum esansiyel ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 santimetrelik bir kültür kabına tohumlayın. Daha sonra fraksiyon iki hücreyi hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Az önce gösterildiği gibi üç ve dördüncü fraksiyonları toplayıp kültürledikten sonra. Calveria'yı, PBS'de mililitre sığır serum albümini başına bir miligram ile desteklenmiş beş mililitre beş milimolar EDTA'da 37 santigrat derecede 15 dakika çalkalayarak inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, iki, üç ve dördüncü fraksiyonlar için gösterildiği gibi beşinci fraksiyonu toplayın ve kültürleyin.Fraksiyonlamadan hemen sonra, sıralama için hücreleri toplayın. Alternatif olarak, ortamı aspire ederek 24 saatlik kültürden sonra hücreleri toplayın ve hücreleri yıkama başına bulaşık başına 10 mililitre PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücrelere plaka başına PBS'de beş mililitre% 0.5 tripsin EDTA uygulayın.37 santigrat derecede beş dakika sonra, her plakaya beş mililitre tam alfa minimum esansiyel ortam ekleyin ve hücreleri pipetleme ile nazikçe ayırın. Her fraksiyondaki hücreleri birleştirmek için, hücre süspansiyonlarını 40 mikronluk bir hücre süzgecinden tek bir 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne süzün. Hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkadıktan sonra, bunları tüpe ekleyin.Hücreleri bir süzgeçten süzün ve santrifüjleme ile hücreleri toplayın. Hücreler peletlendikten sonra, peleti tam minimal esansiyel ortamda, mililitre orta konsantrasyon başına bir kez 10 ila yedinci hücreye kadar yeniden askıya alın ve hücreleri 35 mikronluk naylon ağ kapaklı bir tüpten süzün. Bu yöntemin etkinliğini test etmek için, fraksiyonlar ayrı ayrı sıralandı ve her fraksiyondan osteositlerin yüzdesini ve verimini belirlemek için 24 saat boyunca kültürlendi.İki ila beş fraksiyondaki osteositlerin yoğunluğu, fraksiyon bir için gözlemlenenden daha yüksekti ve altı, yedi ve sekizinci fraksiyonlarda önemli ölçüde azaldı. Tüm fraksiyonlar arasında elde edilen osteositlerin yüzdesi istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, osteositlerin yoğunluğu fraksiyonlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. Burada, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması ile GFP-pozitif osteositleri GFP-negatif muadillerinden izole etmek için geçit stratejisi gösterilmektedir.Sıralamadan sonra, osteositler, ilgilenilen osteosit belirteçlerinin ekspresyonu için analiz edilebilir. Bu analizde, osteosit marker genleri, izole GFP pozitif osteositlerde, yüksek osteoblast fraksiyonu olarak bilinen presort fraksiyon ikiye kıyasla daha yüksek seviyelerde eksprese edildi. Burada, plastik bir kültür kabı üzerinde 24 saatlik kültürden sonra hücre gövdesinden uzanan dendritler ile yıldız şeklini koruyan GFP pozitif bir osteositin morfolojisi, sıralama sonrası gözlemlenebilir.Sindirmeleri aspire ederken dikkat edin, çünkü calveria küçük topaklara indirgenecektir. Hücre kaybını önlemek için küçük uçlu bir aspiratör kullanmayı unutmayın. Osteositler esrarengiz olmuştur çünkü kemiğe gömülüdürler.Bu teknik, osteosit moleküler etkileşimlerini ve bunların osteoklastlar ve osteoblastlar üzerindeki kontrolünü incelemenin yolunu açmıştır.

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Retinoik asit ile osteoblastların primer fare tedavisi kemik hücresinin morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler popülasyonu üretir. Yöntem, elde edilmesi ve kültürü birincil kemik hücresinin korumanın zorluğu üstesinden gelir ve transjenik modelleri türetilen hücreler çalışma avantajlı olabilir.

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Bu makale, fare üçüncü metatarsalının doku düzeyinde mekanik yüklenmesine yanıt olarak gömülü osteositlerin mekanik olarak indüklenen kalsiyum sinyalini in vivo gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için intravital bir görüntüleme yaklaşımının gerçekleştirilmesini açıklamaktadır.

Fare Osteositlerinde Yüke Bağlı Kalsiyum Sinyal Dinamiklerini İncelemek için Floresan İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Bu çalışma, hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) analizi için lakünar-kanaliküler ağ (LCN) içindeki osteositlerin üç boyutlu (3D) modellerini görselleştirme ve geliştirme yöntemini özetlemektedir. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan modeller, sağlıklı veya hastalıklı kemiklerde osteosit mekanosyumunun anlaşılmasına yardımcı olur.

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Öğrenin, dmp1-topaz transgenik farelerden GFP eksprese eden primer osteositleri FACS ile izole etme yöntemini. Bu protokol, kemik metabolizması ve hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek verimli hücre elde etme olanağı sunar.

GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

Daha fazla video keşfet