Name: Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogasterın Tüm Hayvan Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, mikro bilgisayarlı tomografi kullanarak Drosophila melanogaster'ın gelişim aşamalarını zarar vermeden görüntüleme yöntemini. Bu teknik, doku mimarisini koruyarak anatomik yapıları detaylı incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasser Rusan'ın desteği olmasaydı bunların hiçbiri mümkün olmazdı. Nih Fare Görüntüleme Tesisi'nden H. Doug Morris, Danielle Donahue ve Brenda Klaunberg'e ve Micro Photonics'den Ben Ache'ye eğitim ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca Zeiss'li Mansoureh Norouzi Rad'e Xradia 520 Versa'daki karın örneklerini taradığınız için teşekkür ederim. Lauren Smith, Samantha Smith ve Rachel Ng de taramaya yardımcı oldu. Nesne Araştırma Sistemleri'nden Mike Marsh, Dragonfly teknik desteği sağladı. Ayrıca Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1K22HL137902-01) ve Wyoming Üniversitesi'nden Start Up Fonları desteği için minnettarım. Ayrıca anonim yorumculara yararlı önerileri ve yorumları için teşekkür ederim.

1. Örnek seçimi ve manikül hazırlığı
<ol><li>Görüntüleme için uygun gelişimsel zaman noktasını (embriyo, larva, pupa veya yetişkin) seçin.<ol>
<li>Embriyonik aşamalar için, maya ezmesi ile bulaşmış üzüm suyu agar tabaklarındaki kafes dişileri ve her 30-60 dakikada bir yumurta toplayın. Uygun aşamaya gelene kadar bu embriyoları 25 °C'de gelişmeye bırakın.</li>
		<li>Larva aşamaları için, zamanlanmış embriyo toplama deneylerinden birinci ve ikinci instarları toplayın. Kalabalık olmayan koşullar altında yiyecek şişesinin yanından doğrudan 3rd instars seçin.</li>
		<li>Pupal zamanlama için, beyaz pupa öncesi (ters spiracles) toplayın ve kıtikalenin kahverengi olmaya başladığı zamanı not edin. Hayvanlar, tiktik kahverengimsi takiben tanımlanmış zaman noktalarında pupal gelişiminin 15 aşamasında ilerleyecek ve buna göre toplanabilir42.</li>
		<li>Yetişkinleri eklozyonu takiben bakire olarak toplayın ve gerekli bir süre boyunca bir gıda şişesinde yaşlanmaya izin verin (örneğin, tam bağırsak gelişimi için 5 gün).</li>
	</ol>
</li>
	<li>5-50 hayvanı 1x Fosfat Tamponlu Salin 'de (%0,5 PBST) %0,5 Triton X-100'ün 1 mL'sini içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tezgahta periyodik olarak tüpe dokunurken, hidrofobik kaplamanın çıkarılmasına yardımcı olmak ve hayvanların tamamen suya batmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Embriyonik, larva ve pupal aşamaları için, tüpü 20 s için 100 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirerek ve ardından RT'de 5 dakika soğutarak daha fazla gelişmeyi kesin. NOT: Hayvanlar sıvı nitrojen37'deflaş dondurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fiksasyon ve boyama
<ol><li>%0,5 PBST'yi çıkarın ve Bouin'in Çözümünden 1 mL ekleyin. Hayvanların tamamen su altında kalmasını sağlamak için tüpe dokunun. DİkKAT: Bouin'in Çözümü formaldehit içerir. Dökülürse cilt ve gözlere akut toksisiteye neden olabilir ve yutulabilirse ölümcül olabilir. Kullanırken eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. NOT: Etanol kullanımı gibi ek fiksasyon teknikleri de kullanılabilir. Diğer fiksatiflerin yararlarıref. 1,30.<ol>
<li>Embriyo ve yetişkin örnekleri için RT'de 16-20 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Larva ve pupal örnekleri için, RT'de hayvanları 2 saat sabitle. 1x PBS içeren çok iyi bir diseksiyon kabına aktarın ve ön ve arka kütiküldeki bir deliği dürtmek için bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim kullanın.</li>
		<li>Larva ve pupal örneklerini bir mikrofuge tüpüne geri aktarın ve 1 mL taze Bouin çözeltisi ekleyin. RT'de 24 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin'in Çözeltisi'ni çıkarın ve numuneyi 1 mL μ-CT Yıkama Tamponu (0,1 M Na 2 HPO4,%1,8Sakkaroz) veya 1x PBS üç kez ile 30 dakika yıkayın.</li>
	<li>Uygun boyama çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 2-7 gün boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın. NOT: Leke seçimi birçok faktöre bağlı olacaktır, ancak genellikle penetrasyon, kuluçka süresi ve çözünürlük arasındaki bir dengedir. Genel olarak, fosforungstik asit (PTA) yumuşak dokunun üstün kontrastını ve çözünürlüğünü sağlar, ancak kütikülün mekanik bozulmasını ve daha uzun kuluçka sürelerini gerektirir. Farklı leke tiplerinin yararları ref.1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol>
<li>İyot boyama için 1 mL 0.1 N I2KI (Lugol Çözeltisi) kullanın. 2 gün kuluçkaya yatır. Yetişkin manikülde daha fazla bozulmaya gerek yoktur.</li>
		<li>Fosfoungstik asit (PTA) boyama için, suda seyreltilmiş% 0,5 (w / v) çözeltinin 1 mL'sini kullanın. Bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim ile toraks veya abdominal kütiküldeki ağız partilerini veya delikleri dürterek yetişkin kütiküllerini bozun. Doku lekesi homojen değilse 5-7 gün veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dakika boyunca 1 mL ultra saf su veya 1x PBS ile yıkayın. Yıkama adımlarını tekrarlayın. Rt'de hayvanları ultra saf suda veya 1x PBS'de bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>Hayvanlar nemlendirilirken taranacaksa, doğrudan bölüm 4'e geçin. Numunenin daha uzun süre korunması gerekiyorsa, protokolün bölüm 3'üne geçin.</li>
</ol>3. Kritik nokta kurutma (İsteğe bağlı)
<ol><li>Numune üzerinde bir etanol (EtOH) dehidrasyon serisi gerçekleştirin: %10, %25, %50, %75, %100, %100. EtOH çözeltisinin 1 mL'lik kısmını ekleyin ve belirtilen sırayla her konsantrasyon için 1 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Son % 100 EtOH ıslatıldıktan sonra, taze% 100 EtOH ile değiştirin ve numunenin tezgahta bir gecede kuluçkaya yatmasına izin verin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak numunelerin kritik nokta kurutmasını gerçekleştirin. NOT: Elektron mikroskopi tesisleri genellikle EtOH dehidratasyonunu takiben numuneninkurumasını gerçekleştirecek kritik bir nokta kurutma makinesine (bkz. Malzeme Tablosu) sahiptir.</li>
</ol>4. Numune montajı
<ol><li>Kritik nokta kurutulmuş numuneler için, dönen aşamanın aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir böcek pimine veya başka bir tutucuya sıcak tutkal örnekleri veya plastik veya cam kılcal boruya (~1,0-1,25 mm iç çap) yerleştirin.</li>
	<li>Hidratlı numuneler için, bir P10 pipet ucunu suyla doldurun ve sızıntıyı önlemek için dar ucunu ısı sızdırmazlık veya parafin filmi ile sabitleyin. DİkKAT: Suyun tarayıcıya sızmaması ve hasara yol açmaması için bağlantıları sıkıca sardığınızdan emin olun.<ol>
<li>Tek bir örneği tokmak kullanarak pipet ucuna aktarın. Körelmiş 20 G iğne veya başka bir pipet ucu gibi uzun, ince bir nesne kullanarak, numuneyi yerinde tutmak için pipet ucunun duvarına temas edene kadar dikkatlice uçtan aşağı itin.</li>
		<li>Uzun taramalar sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için pipet ucunun açılmasını parafin filmi ile örtün.</li>
		<li>P10 pipetini döner sahnenin aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir tutucu kullanarak monte edin (Şekil 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tarama
<ol><li>Gün için görüntülemeden önce makinenin gerekli kalibrasyonlarını gerçekleştirin. NOT: Bunlar üreticiye göre değişecektir ve uygun adımları belirlemek için bir uygulama uzmanına danışmanız önerilir. Bu protokolde kullanılan kurulum ve yazılım hakkında özel bilgi için lütfen Malzeme Tablosu'na bakın. Genellikle, mandrenin dönen aşamaya göre eksen dışında olmasıyla ilişkili herhangi bir 'sallantıyı' kaldırmak ve kameradaki tekdüze arka plan piksel yoğunluklarını sağlamak için düz alan düzeltmeleri yapmak için sahne ekseni hizalaması gibi kalibrasyonlar, birden fazla taramada karşılaştırılabilir en iyi çözünürlük ve veri kümeleri için en uygun görüntüleme koşullarını sağlar.</li>
	<li>Yazılımın sol üst köşesindeki 'Kapıyı Aç' simgesine tıklayarak dönen sahne aynasına erişmek için tarayıcı kapısını açın. Yakayı numune tutucunun tabanına sıkarak numuneyi takın. NOT: Tarayıcı hizalamasını korumak için numuneyi dönen aynaya taktırırken hafif basınç kullanın.</li>
	<li>Tarayıcıyı en iyi çözünürlük ve kontrast için kontrol eden yazılımda tarama parametrelerini ayarlayın. NOT: Her tarayıcının X-ışını kaynağı, kamerası/dedektörü ve geometrisi üreticiye göre değişeceğinden bunların ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. En iyi parametreleri seçmek için ek bilgileri burada da bulabilirsiniz43, ayrıca üreticinin uygulama uzmanından.<ol>
<li>X-Ray kaynak güç kontrolünü açma (Seçenekler | X-ray Kaynağı). X-ışını voltajını 30-40 kV'a ve akımı 100-110 μA'ya ayarlamak için kaydırıcı çubuklarını kullanın ve gelişmiş çözünürlük için 3-4W güce ve küçük bir spot boyutuna sahip bir X-ışını ışını üretin.</li>
		<li>Edinme Modları iletişim kutusunu kullanma (Seçenekler | Alma Modları) kamera pozlama süresini 500-800 ms olarak ayarlamak için.</li>
		<li>Kamera ayarlarına ve konumuna bağlı olarak istenen görüntü piksel boyutunu (~700 nm ila 4 μm) ayarlamak için yazılımın altındaki büyüteç simgesinin yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu kullanın. Bu, tarama sırasında elde edilen projeksiyon görüntülerinin sayısını belirler ve daha fazla projeksiyon gelişmiş çözünürlüğe ancak daha uzun tarama sürelerine yol sağlar (bkz. Temsili Sonuçlar).</li>
		<li>Örneği 360° döndürme yolu boyunca taşımak için yazılımın altındaki dönen okun yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu tıklatıp sürükleyin. Örneğin görüş alanında kaldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazılımın üst kısmındaki 'Edinmeye Başla' simgesine (mavi daire ok simgesi) tıklayın. Ek tarama parametrelerinin ayarlanıp taramanın kaydedileceği dosya ve çıktı klasörünün adlandırılmasına izin veren bir iletişim kutusu görüntülenir.<ol>
<li>Rastgele hareketi 10 ve ortalama 4-6 kareye ayarlayın. Döndürme adımı, kullanılan kamera ayarlarına bağlı olarak otomatik olarak hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Edinme iletişim kutusunda'Tamam'ı tıklatarak taramaya başlayın. Tarama süresini gösteren ikinci bir ilerleme çubuğu iletişim kutusu görüntülenir. Tarayıcı artık dönüş yolu boyunca numunenin bir dizi projeksiyon görüntüsü(Şekil 1D)elde edecek ve izlenmesine gerek yok.</li>
</ol>6. Yeniden Yapılanma
<ol><li>Tomogramları oluşturmak için projeksiyon görüntülerini kullanarak görüntü yeniden yapılandırma gerçekleştirin. NOT: Koni ışını geometri tarayıcılarından gelen görüntülerin hemen hemen tüm rekonstrüksiyonu Feldkampalgoritması 16'ya dayanırken, bireysel parametreler yazılım uygulamasına bağlı olarak değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir. Ticari olarak kullanılabilen bir yazılıma özgü aşağıdaki ayarlar (bkz. Malzeme Tablosu)kılavuz olarak kullanılabilir. Yanlış hizalama telafisi, halka yapıt azaltma ve ışın sertleştirme düzeltmesi (çoğu sinek örneği için%0) gibi parametreler, son rekonstrüksiyon için en iyi değerleri seçmek için yinelemeli bir şekilde gerçekleştirilir. Yeniden yapılandırma süreci üzerinde daha fazla kontrol sahibi olmak isteyen ileri düzey kullanıcılar için, matlab arayüzüne bakın44.</li>
	<li>Başvuru taramalarına dayalı bir vardiya düzeltme algoritması kullanarak ilk görüntü hizalamasını gerçekleştirme45 (Eylemler | Referans taramasıyla X/Y hizalaması).
</li>
	<li>Her yeniden yapılandırma parametresine ince ayar yapın (Başlangıç | İnce ayar). Bu, bir 'Parametre ince ayarı' iletişim kutusunu etkinleştirir.<ol>
<li>'İleri' ile 'Hizalama Sonrası'nı tıklatarak hizalamaya ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. Düzgün hizalanmış görüntüyü seçin. NOT: Düzgün hizalanmış bir görüntü bulanık olmayacak veya aksi halde sürekli bir yapının (nikle gibi) bölünmüş göründüğü 'yamumlu' yapıları görüntülemeyecektir.</li>
		<li>Yanındaki halka yapıt azaltmayı tıklayarak ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. En az sayıda halka içeren resmi seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıdaki parametreler en iyi görüntüyü verecek şekilde optimize edildikten sonra, seçilen değerlerin Ayarlar sekmesinde(Ayarlar) düzgün bir şekilde temsil edildiğinden emin olun.
</li>
	<li>Histogramı, bit derinliği ve türü gibi dosya parametrelerini kullanarak son parlaklık ve kontrast değerlerini ayarlayın ve hesaplama süresini(Çıktı)azaltmak için yalnızca ilgi alanlarını (örneğin, yalnızca tüm sinek veya kafa) kapsayan bir İlgi Alanı (ROI) kullanın.</li>
	<li>Yeniden yapılandırmaya başlayın (| başlayın Başlat). Birden çok yeniden yapılandırma gerekiyorsa, geçerli görüntüyü toplu iş yöneticisine ekleyin (Başlangıç | Toplu işleme ekle) ve kalan görüntüler için 6.2-6.5 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>7. Görüntü analizi
<ol><li>Tomogramları iki ve üç boyutta görselleştirin ve ücretsiz veya ticari yazılımlarla daha fazla morfometrik analiz gerçekleştirin. NOT: Bu protokolde kullanılan yazılımın ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda mevcuttur. μ-CT veri kümelerini değerlendirebilen diğer yazılım paketleri arasında FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47ve ITK-SNAP48gibi ücretsiz seçeneklerin yanı sıra ticari yazılımlar (örneğin, AMIRA) bulunur. Segmentasyon sürecini yarı otomatikleştirmek için makine öğrenimi tabanlı algoritmalar kullanan diğer uygulamalar, iş akışlarını hızlandırmaya ve insan önyargısını azaltmaya yardımcı olabilir (örneğin, Biomedisa49).</li>
	<li>Tomogram dosyasını yazılıma içe aktarma (Dosya | Görüntü Dosyalarını İçeri Aktar). Dosyayla ilişkili meta veriler otomatik olarak pencereye yüklenmelidir, ancak görüntü özellikleriyle eşleşecek şekilde el ile de ayarlanabilir.</li>
	<li>İlgi çekici bir yapıyı segmentlere ayırmak için ekranın sol tarafındaki Segment sekmesini tıklatın. Yeni bir İlgi Alanı (YATıRıMGK) Oluşturma (Temel | Yeni), ona bir ad verin ve uygun bir renk seçin.</li>
	<li>İlgi yapısını kapsayan eşik aralığını tanımlama (Aralık | Aralığı Tanımla) kaydırıcı çubuğunu kullanarak.</li>
	<li>Uygun bir 2D veya 3D YATıRıM GETIRIsi boyacı araç modu seçin (YATıRıM GETIRI'sine | Boya fırçası seçeneği).
</li>
	<li>Eşik tarafından tanımlanan bir alanı boyamak için; sol fare tuşunu basılı tutarken Ctrl tuşunu basılı tutun. Bir alanı kaldırmak için, sol fare tuşunu basılı tutarken Shift tuşunu basılı tutun. NOT: Dairesel veya kare boya fırçasının boyutunu değiştirmek için, Ctrl veya Shift tuşlarını basılı tutarken fare tekerleğini kaydırmanız yeterlidir.</li>
	<li>Tüm Z hacmi boyunca ilgi yapısını boyamaya devam edin.</li>
	<li>Yatırım Getirisini Mesh'e Dönüştürme (Dışa Aktarma | Mesh | Normal).
</li>
	<li>Sağ üst köşedeki Veri Özellikleri ve Ayarları panelinde üzerine tıklayarak kafes kaplamasını vurgulayın.</li>
	<li>Uygun sayıda yineleme kullanarak ağı düzleştirin(Düz Mesh | Yinelemeler). NOT: Karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı mesh yumuşatma yineleme değerini kullanın.</li>
	<li>Temel morfometrik analiz için ekranın sağ tarafındaki Bilgi panelinde ağ yatırım getirisinin(Yüzey Alanı, Hacim ve Feret Çapı)ölçümlerinin görüntülendiğinden emin olun. Nesne Çözümleme Modülükullanılarak ek analiz yapılabilir.</li>
	<li>Kafes nesnesini ve tüm tomogram görüntüsünü işle ve 3B olarak görselleştir. Nesnenin videosunu oluşturmak için yerleşik Movie Maker'ı kullanma (Sağ Fare Tıklatmasını | Movie Maker'ı görüntüleyiciden tek tek kareler kullanarak göster (Anahtar Ekle). NOT: Belirli özellikleri vurgulamak için sağ paneldeki görsel efektler sekmesi kullanılarak filme çeşitli görsel geliştirmeler de uygulanabilir.</li>
	<li>Movie Maker'daki Animasyonu Dışa Aktar düğmesini kullanarak videoyu görüntülemek üzere dışa aktar.</li>
</ol>

Yazar hiçbir rekabet veya finansal çıkar beyan etmemektedir.

Tüm gelişim aşamalarında bozulmamış Drosophila melanogaster'ı görselleştirmek, öncelikle ışık mikroskopisinin bu hayvanda bulunan kalın, pigmentli kütikülle uyumsuzluğu nedeniyle bir zorluk olmaya devam etti. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Optik Koherens Tomografi (OCT) ve ultramikroskop doku temizleme ile birleştiğinde diğer tüm hayvan görüntüleme yöntemleri sineklerde başarı ile kullanılmıştır50,51,52,53,54, μ-CT bu organizmanın tüm hayvan görüntülemesi için ideal kılan bir dizi avantajsunarken 13 , 15,30 . X ışınları pigmentli kütiküllere kolayca nüfuz eder ve küçük dalga boyları mikron altı görüntülemeye izin verir. Etiketleme, yaygın olarak bulunan kimyasallara minimum yatırım gerektirir ve özel tezgah becerileri yoktur13. μ-CT tarayıcılar da ticari olarak mevcuttur ve maliyetler hafif mikroskopi platformlarıyla karşılaştırılabilirken, aynı zamanda bir kurumda kullanılabilirliğinden de yararlanabilecek daha geniş disiplinler (Jeoloji, Paleontoloji, Mühendislik vb.) için daha çekicidir. Senkrotron X-Ray kaynakları, sabit ve canlı böceklerin31,55,56,ancak ticari tezgah üstü tarayıcılardan daha az erişilebilir olan yüksek çözünürlüklü μ-CT görüntülemesi için de kullanılabilir.
Bu protokol, sinek yetişkinleri, pupa, larva ve hücreselleştirilmiş embriyoların μ-CT görüntülerini elde etmenin etkili bir yolunu sağlar. Yukarıda özetlenen adımların çoğu için, görüntüleme için örnekler hazırlamak için alternatif yöntemlerin de uygulanabileceğini unutmayın. Diğer çalışmalar, böceklerde kullanılmak üzere farklı sabitleme, etiketleme ve kurutma adımlarının ayrıntılı bir karşılaştırmasını sağlamıştır ve bu tekniği benimsemek isteyenler, her yaklaşımın yararlarını değerlendirmeye teşvik edilir 1 ,4,13,29,30,57. Bu protokol nispeten basit olsa da, birkaç yararlı öneri sunulmaktadır.
İlk olarak, alttaki yumuşak dokuların önemli ölçüde bozulmaması için sağlam örneklerin seklisini bozarken dikkatli olunmalıdır. Larva ve erken pupal aşamalarının dürtmeden önce Bouin'in çözeltisinde 2 saat boyunca sabitlenmesine izin vermek önemlidir. Bu, dokuyu sertleştirecek ve organ mimarisini değiştirebilecek lütikül deliklerinden sızacak hemolimf miktarını sınırlayacaktır. İlgi çekici yapı (lar) orada bulunuyorsa, yetişkinin bireysel vücut segmentleri (baş, toraks ve karın) ayrılabilir. Bu segmentleri forsepsle ayırmak yerine temiz bir şekilde dilimlemek için bir neşter kullanılması önerilir, bu da örneğin bağırsak veya merkezi sinir sisteminin 3D mimarisini bozabilir. Zamanlama gelince, yetişkinler genellikle sadece 16 saat gerekir. tam fiksasyon için larva ve pupal aşamaları 24 saat gerekir. Ayrıca, iyot veya PTA lekesi düzensiz görünüyorsa, numune lekeleme bile elde edilene kadar daha uzun süre kuluçkaya yatmak için çözeltiye geri yerlenebilir. Son olarak, nemlendirilmiş numuneler 4 ° C'ye yerlendirilmemelidir, çünkü bu, oda sıcaklığına ısındıktan sonra vücut boşluğu içinde hava kabarcıklarının oluşumunu teşvik ediyor gibi görünmektedir.
İkinci olarak, numune montajı alete, sahne tipine ve numunenin hidratlı kalması gerekip gerekmediğine veya kritik noktanın kurutulup kurutulmadığına göre değişir. Nemlendirilmişse, numunenin sızmadığından emin olun ve muhtemelen tarayıcıyı yok edin. Numuneyi bir pipet ucunun içine monte ederken, numuneler hafif bir dirençle karşılaşana ve hareket edemeyinceye kadar körelmiş bir nesneyle hafifçe itdiğinizden emin olun. Çok fazla itmek oksikül deformasyonuna ve alttaki yapısal kusurlara yol açabilir. Ayrıca, numunenin tutucuda dönme eksenine mümkün olduğunca yakın hizalı olduğundan emin olun. Herhangi bir yalpalama, daha geniş görüş alanı nedeniyle tarama sürelerini artıracak ve yeniden yapılanma sonrasında son tomogramın çözünürlüğünü azaltacaktır.
Üçüncü olarak, projeksiyon görüntülerini elde etmek için tarayıcı ayarları da enstrümana göre değişir. Tarayıcının çözünürlük yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için, X-ışını ışını nokta boyutu mümkün olduğunca küçük olmalıdır (5-10 μm). Bu, X-Ray voltajı ve akım ayarlarının toplam gücü 3-4 W olacak şekilde dengelenmesiyle elde edilebilir. Bu ayarlar ve kameradaki uygun pozlama süresi ile numune ile uygun X-ışını ışını zayıflaması ve optimum görüntü kontrastı elde edilebilir. Nesne ile X-ışını kaynağı arasındaki alüminyum veya bakır filtrelerin kullanımı, en iyi görüntü kontrastı için en uygun X-ışını enerjisi ayarlarında ince ayar yapmak veya daha yüksek güçlü kaynakların kullanılması için kirişi yeterince zayıflamak için kullanılabilir. Görüntü çözünürlüğüne gelince, bu leke türü, projeksiyon görüntüsü sayısı, görüntü piksel boyutu, kamera konumu, numune hareketi, tarayıcı titreşimleri ve yeniden yapılandırma parametreleri dahil olmak üzere birçok farklı değişkene bağlı olacaktır. Bilinen boyut işaretçilerini içeren bir çubuk desen hayaleti (QRM GmbH), belirli bir tarayıcı ve kamera ayarı için uzamsal çözünürlüğü değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Ayrıca kritik nokta kurutulmuş veya hidratlı örnekleri görüntülemenin yararlarını değerlendirmeye değer. Sombke ve ark. iki yöntemin karşılaştırmalı bir değerlendirmesini yaptı ve eklembacaklıları içeren μ-CT uygulamaları için kritik nokta kurutmanın üstün olduğunu buldu30. Bununla birlikte, hidratlı örneklerin yararları, hayvanların hem nicel hem de morfolojik eserlere yol açabilecek daha az kimyasal ve mekanik maruziyete maruz kalmasıdır. Bu aynı zamanda hassas dokuları CPD'den daha iyi koruma eğilimindedir. Bununla birlikte, hidratlı numuneler çok daha kısa bir raf ömrüne sahiptir ve doku bozulması ve düşük görüntü kalitesi bu noktada belirgin hale geldiğinden, fiksasyondan en geç bir ay sonra görüntülenmelidir. Ayrıca, hidratlı numunelerin çözünürlüğü kritik bir nokta kurutulmuş numuneden biraz daha az olacaktır, çünkü X ışınları hem plastik pipet ucuna hem de çevredeki sıvıya (su veya tampon) nüfuz etmelidir. Kritik Nokta Kurutulmuş numuneler, özellikle Drierite'de tutulduğunda çok daha uzun süre korunabilir. Ayrıca, kanatları veya bacakları bir böcek pimine yapıştırarak ve montaj işlemini basitleştirerek sahne aynasına yerleştirerek doğrudan X-ışını ışını yoluna yerlenebilirler. Bununla birlikte, bu örneklerin geniş etanol dehidrasyonu doku büzülmesine ve hassas doku mimarisinin kaybına yol açabilir, bu nedenle bu etkileri en aza indirmek için bir dizi artan EtOH konsantrasyonu yapmak önemlidir. Bununla birlikte, paraformaldehit fiksasyonu ve hatta iyot lekelenmesi de dahil olmak üzere her türlü kimyasal tedavinin doku büzülmesine neden olabileceği belirtilmelidir58,59. Her iki yöntem de canlı bir sinekte 'gerçek organ büyüklüğü' ölçümleri sağlamazken, sabitleme, boyama ve kurutma adımları her iki numune kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirildiği sürece mutant ve wildtype hayvanları karşılaştırırken morfometrik ölçümler hala geçerlidir ( tercihen paralel olarak).
Sonuç olarak, μ-CT Drosophila33 , 34 , 35,36,37,38,39,40,41için yararlı bir tüm hayvan görüntüleme aracı sağlar. Diğer birçok çalışma, böcek taksonomisi, ekoloji, fizyoloji, gelişim ve anatominin sineklerde gelecekteki çalışmaları bilgilendirmeye yardımcı olabilecek çeşitli yönlerini anlamak için bu teknolojinin gücünü sergilemiştir1,28,30,31,32,55,56,57 . Bu organizmada zaten yaygın olarak kullanılan genetik ve hafif mikroskopi araçlarıyla birlikte, μ-CT, genotip ve fenotip arasında daha derin bir anlayışa izin veren deneysel bir boru hattı içinde kendini konumlandırabilir.

Bir nesnenin iç yapılarının genel 3D mimarisini tahrip etmeden ayrıntılı olarak araştırılmasına izin veren görüntüleme yöntemlerinin fizik, mühendislik, malzeme bilimi, arkeoloji, paleontoloji, jeoloji ve biyoloji 1 ,2,3, 4 ,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere bir dizi farklı disipline yaygın olarak yararlı olduğukanıtlanmıştır. . Bu tahribatsız görüntüleme yöntemleri arasında, X-ışını tabanlı platformlar, özellikle yüksek enerjili X ışınlarının görünür ışık dalgalarına kıyasla çok farklı numune türlerine ve malzemelere minimum saçılma ile nüfuz edebilmesi nedeniyle yararlıdır. Bilgisayarlı Tomografi (BT), Mikro bilgisayarlı Tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomografi (Nano-CT) ve Synchrotron Mikrotomografisi, milimetreden mikrona kadar değişen örneklerin X-ışını tabanlı görüntüleme için birincil teknolojiler olarak ortaya çıkmıştır, milimetre ila mikron altı çözünürlük yetenekleri10,11,12,13,14.
Bu platformlar, numune boyutunu ve çözünürlüğünü dengelemek için tasarımlarında, X-ışını geometrilerinde ve bileşenlerinde farklılık gösterse de, hepsi görüntü yakalama için aynı temel ilkeye dayanır: nesnenin içinden geçen ve bir dedektör tarafından yakalanan bir X-ışın kaynağı. Nesne içindeki farklı yoğunluklardan geçerken X-ışını ışınının diferansiyel zayıflaması görüntü kontrastı oluşturur. 3B veriler, numune veya dedektör döndürülerek, daha sonra algoritmalar kullanılarak yeniden yapılandırılan bir dizi 2B projeksiyon görüntüsü toplanarak x,y,z15'teçözünürlüğü izotropik olan 3B bilgileri içeren tomogramlara toplanır. Görüntülenmekte olan nesneye X ışınları yansıtmak için koni ışını X-ışını geometrisi kullanan birçok tezgah üstü μ-CT tarayıcı için, Feldkamp algoritması nesneyi en az hatayla doğru bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılır16.
Belirli bir platformun çözünürlüğü öncelikle X-ışını ışınının boyutu (spot boyutu), tarayıcı geometrisi (nesneden X-ışını kaynağına uzaklık), dedektördeki piksellerin boyutu ve kullanılan yeniden yapılandırma algoritması gibi sistem parametrelerine göre belirlenir. Tarayıcı titreşimleri, X-ışını ışını dalgalanmaları, numune hareketi ve malzeme tipi veya nesneyi görselleştirmek için kullanılan kimyasal leke gibi ek faktörler de gerçek dünya görüntüleme çeşnileri altında mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde etkileyebilir15.
Biyomedikal uygulamalar için BT ve μ-CT anatomi, fizyoloji, gelişim ve hastalık mekanizmaları anlayışımızı geliştirmede kilit rol oynamış, hem insan hasta tanıları için bir araç hem de model organizmalar için preklinik görüntüleme platformu olarak hizmet vermektedir17,18. Örneğin, amacı fare genomundaki her genin işlevini tanımlamak olan Mouse International Phenotyping Konsorsiyumu, fenotipleme boru hattı19'unbir parçası olarak μ-CT kullanır. Sonuçları, gelişim ve hastalık süreçlerinde yer alan genleri anlamak için kritik öneme sahipken, fare anatomisi ve gelişimi için bir atlas görevi degörür 20. Zebra balıkları ve sıçanlar gibi diğer model organizmalar da, bir dizi gen mutantının tüm hayvan fenotiplemesini gerçekleştirmek için μ-CT kullanımını tamamen benimsemiş17,21,22,23.
Tüm hayvan görüntülemeyi model organizmalarla birleştirmenin avantajı, belirli bir biyolojik süreç için gen fonksiyonunun mekanistik bir anlayışının tam olarak araştırılabilmesidir. Bu, iyi karakterize edilmiş genomlar ve farklı gelişimsel zaman noktalarında, belirli dokularda, bireysel hücrelerde ve hatta hücre altı organellerde gen fonksiyonunun hassas bir şekilde manipüle olmasına izin veren model organizmalarda bulunan birçok genetik araç nedeniyle mümkündür. Bunlar UAS/GAL4 sistemi (ve birçok türevi), CRISPR/Cas9 ve RNAi24 , 25,26gibi ikili ifade sistemlerini içerir. Bu genetik araçlar elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi (floresan ve floresan olmayan) ve μ-CT gibi tüm hayvan görüntülemeden oluşan güçlü bir görüntüleme boru hattı ile birlikte kullanıldığında, moleküllerin, hücrelerin, dokuların, organların ve tüm organizmanın kapsamlı bir değerlendirmesi elde edilebilir ve bu da gen fonksiyonunun çok daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, sayısız genetik aracı çok sayıda moleküler mekanizmanın aydınlatılmasına yardımcı olan memeli olmayan model organizma Drosophila melanogaster'da μ-CT kullanımına odaklanmaktadır26,27. Model olmayan böcekler1 , 28 ,29,30,31,32'deki önceki protokollerden benimsendi ve bu hayvanda kullanımı için standartlaştırılmış bir protokol oluşturmak için Drosophila'daki önceki μ-CT çalışmalarından yola çıktı33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Ticari olarak kullanılabilen tarayıcılar kullanılarak fly μ-CT veri kümelerinin başarılı bir şekilde numune hazırlanması, görüntülenmesi ve analizi için adımlar özetlenmiştir. Bu protokol ile, sineğin tüm gelişim aşamaları taksonomi, anatomi, gelişim, fizyoloji ve hastalık dahil olmak üzere hem tanımlayıcı hem de hipotez testi çalışmaları için yüksek çözünürlükte görselleştirilebilir27. Bu protokol, μ-CT ile görselleştirmeyi geliştirmek için görüntü kontrastı için kimyasal boyama gerektiren hemen hemen her böcek ve hatta canlı olmayan malzemeleri görüntülemek için de yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>%100 Etanol</td><td></td><td></td><td>Kritik nokta kurutma için</td></tr><tr><td>Bouin'in Çözümü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>Hayvan fiksasyonu için</td></tr><tr><td>Kritik Nokta Kurutucu</td><td></td><td></td><td>Kritik nokta yöntemini kullanarak numuneleri kurutur; birden fazla seçenek mevcuttur (Balzers CPD 020 veya Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Yazılımı</td><td>Nesne Araştırma Sistemleri</td><td></td><td>Mikro-CT veri kümelerinin görselleştirilmesi ve segmentasyonu için; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Isı Bloğu</td><td></td><td></td><td>Mikrofüj tüpleri için</td></tr><tr><td>Görüntü Analiz İş İstasyonu</td><td></td><td></td>, <td>3D render için yeterli RAM ve kaliteli grafik kartı içermelidir</td></tr><tr><td>İyot Çözeltisi (I2KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>Boyama için</td></tr><tr><td>Mikrobilgisayarlı Tomografi Tarayıcı</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Koni ışınlı X-Işını geometrisi; dedektör, 11.54 ve mikro özellikli bir Hamamatsu 10 MP kameradır; m piksel boyutu.</td></tr><tr><td>Mikrobilgisayarlı Tomografi Tarayıcı Yazılımı</td><td>Bruker</td><td></td><td>Tarayıcının kendisini kontrol etmek için (örneğin, düz alan düzeltmeleri, X-ışını tüpü gücü, kamera kullanım süreleri, edinme vb.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-15</td><td>Kütikülde delik açmak için</td></tr><tr><td>NRecon Görüntü Yeniden Yapılandırma Yazılımı</td><td>Bruker</td><td></td><td>Konik ışınlı X-Ray geometrisi P10 pipet uçları ile çekilen 2D projeksiyon görüntülerinden kesit görüntülerini yeniden oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Numune montajı</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>P32060-4000.0</td><td>Kullanmadan önce su ile 1X'e seyreltin</td></tr><tr><td>Boyama için Fosfotungstik Asit Hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>Pim</td></tr><tr><td>Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26018-17</td><td>Minutien Pimleri için</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>111036</td><td>Yetişkin sineklerden mumsu kaplamayı çıkarmak için (%0,5 PBST olarak)</td></tr><tr><td>X-Işını Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometrisi, Resoluton at a Distance için Fresnel bölge plakası objektif lenslerine sahip (RaaD&trade;)</td></tr></tbody></table>

mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak drosophila melanogaster'ın tüm hayvan görüntülemesi

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biyomedikal görüntüleme araçları, genlerden organizmalara kadar mekansal ölçeklerde moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin vermektedir. İyi karakterize edilmiş bir model organizma olan Drosophila melanogaster, hücre ve doku düzeyinde gen fonksiyonunu anlamak için ışık ve elektron mikroskopisi kullanımından yararlanmıştır. Tüm bozulmamış organizma düzeyinde gen fonksiyonunun anlaşılmasını sağlayan görüntüleme platformlarının uygulanması, genetik mekanizmalar hakkındaki bilgimizi daha da artıracaktır. Burada, mikro bilgisayarlı tomografi (μ-BT) kullanarak Drosophila'yı herhangi bir gelişim aşamasında görselleştirmek için gereken adımları özetleyen bir hayvan görüntüleme yöntemi sunulmaktadır. μ-CT'nin avantajları arasında, doku diseksiyonu veya temizleme yöntemlerine gerek kalmadan mikron düzeyinde çözünürlükte doğru 3D bilgi üretmek için piyasada bulunan enstrümantasyon ve minimum uygulamalı zaman bulunur. Görüntü analizi ve 3D işlemeyi hızlandıran yazılımlarla eşleştirilmiş, hem tanımlayıcı hem de hipotez test çalışmaları için gelişim, fizyoloji ve anatomi mekanizmalarını daha iyi anlamak için herhangi bir doku veya organ sisteminin ayrıntılı morfometrik analizi yapılabilir. Elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi ve μ-CT kullanımını içeren bir görüntüleme iş akışı kullanılarak, gen fonksiyonunun kapsamlı bir değerlendirmesi yapılabilir, böylece bu güçlü model organizmanın yararlılığı daha da arttırılabilir.

Şekil 2'de bir embriyonun, 3rd instar larvalarının, faz yetişkin aşamasındaki (P7) pupaların ve ticari bir tezgah üstü tarayıcı kullanılarak iyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş yetişkin bir dişi sineğin görüntüleri gösterilmiştir. Hassas dokunun mükemmel korunması ve hatta boyanmaları belirgindir, bu da tüm ana organların kolayca tanımlanmasını ve morfometrik analiz ve 3D görselleştirme için kullanılmasını sağlar.
Tipik olarak, numunenin daha az projeksiyon görüntüsü elde eden taramalar, daha fazla projeksiyon görüntüsü elde eden taramalardan daha düşük çözünürlük sağlar ve takas tarama için harcanan zamandır. Tarama süreleri enstrümana ve diğer tarama parametrelerine göre değişse de, birkaç yüz projeksiyon (~3 μm görüntü piksel boyutu) elde eden taramalar numune başına yaklaşık 30 dakika süre alırken, binlerce projeksiyon görüntüsünden (700 nm-1,25 μm görüntü piksel boyutu) oluşan taramalar 8-16 saat sürebilir. Şekil 3'tehem 'yavaş' (binlerce projeksiyon) hem de 'hızlı' (yüzlerce projeksiyon) tarama modunda çekilen aynı yetişkin sinek başlığının karşılaştırması gösterilmiştir. Daha da önemlisi, morfometrik analizler 'yavaş' ve 'hızlı' taramalar arasında farklılık gösterir (Şekil 3C)40. Bu nedenle görüntüleme boru hattımız, morfometrik analiz için yeterince büyük bir örnek boyutu oluşturmak için hızlı taramalar ve daha yüksek çözünürlükte morfolojik veya anatomik kusurları görselleştirmek için yavaş taramalar kullanır. Yazılımı kullanarak (Adım 7), ilgi çekici herhangi bir doku veya organ sistemi bölümlerek morfometrik analiz için kullanılabilir ve film yapımcısı (Film 1) kullanılarak 3D olarak görselleştirilebilir.
Şekil 4, PTA ile boyanmış sinek karnının bir örneğini gösterir ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya bir X-ışını mikroskobundaki (Malzeme Tablosu) kritik nokta kurutmasını (CPD)takip eder. PTA'nın bir kombinasyonu ve bu platformun yetenekleri tarafından sağlanan ayrıntı, bu görüntülerde kolayca belirgindir, böylece testislerdeki midgut ve sperm demetlerinin bireysel epitel hücreleri kolayca çözülür. CPD görüntüsü hidratlı örneğe kıyasla marjinal olarak artmış çözünürlük gösterirken, hassas dokuların (kütikül yakınındaki yağ hücreleri gibi) ultrayapısının daha iyi korunması hydrated örneklerle elde edilir (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Şekil 1: μ-CT için tarayıcı tasarımına ve örnek montajına genel bakış. (A) Ticari tezgah üstü μ-CT tarayıcı. (B) Tarayıcının içini görüntüleyin. X-ışını kaynağı (sağda), dönen bir aşamada (sarı ok) bulunan numuneden geçen X-Ray'ler yayar. Bu X ışınlarının zayıflaması, numuneden geçerken ve X ışınlarını fotonlara dönüştüren bir scintillation ekranından ve standart bir CCD kameradan (solda) oluşan dedektöre geçerken görüntü kontrastı oluşturur. (C) Suda hidratlı görüntüleme için yetişkin bir meyve sineği monte etmek. Pipet ucu ile pirinç tutucu arasındaki bağlantı noktaları, sızıntıyı ve tarayıcının potansiyel hasarını önlemek için parafin filmine sarılır. Sahne aynası da vurgulanır. Pipet ucunun biraz eksen dışı konumlandırıldığını ve bu da son rekonstrüksiyonda daha uzun bir tarama süresine ve daha az çözünürlüğe yol açtığını unutmayın. (D) Yetişkin bir dişi sineğin tek bir 2D projeksiyon görüntüsü; bu projeksiyonların yüz ila binlercesi dönme ekseni boyunca bir tarama sırasında elde edilir ve izotropik çözünürlük ve doğru 3D bilgiler içeren tomogramlar oluşturmak için yeniden yapılandırma için kullanılır. Ölçek Çubukları (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Şekil 2: Tüm Drosophila melanogaster yaşam döngüsü aşamaları, μ-CT tarafından görüntülenmiştir. İyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş görüntüler. Gösterilen tek bir 2D dilimdir. (A) Gastrülasyonun erken aşamalarını tamamlamış bir embriyo (yıldız). (B) Üçüncü bir başlangıç larvası. (C) Metamorfoz sırasında bir P7 faz yetişkin. (D) Yetişkin bir kadın. Çeşitli organlar vurgulanır: BWM, vücut duvarı kasları; Br, beyin; Cd, cardia; Cr, kırpma; DLM'ler, dorsal boyuna kaslar; DVM, dorsal ventral kaslar; E-AD, göz antenli disk; Em, embriyo; FB, yağ gövdeleri; FBC'ler, yağ vücut hücreleri; H, kalp; Hg, arka ayak; La, lamina; L, bacak; Mg, midgut; OL, beyin optik lob; Ov, ovipositor; PC, pupal manikül; SG, tükürük bezleri; VNC, ventral sinir kordonu; W, kanat; WD, kanat diski. Ölçek Çubukları (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-D) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Şekil 3: Tarama parametreleri ve görüntü çözünürlüğü morfometrik analizleri değiştirmez. Yetişkin kafası hem (A, A') 'hızlı' tarayıcı ayarları (yüzlerce projeksiyon) ve (B, B') 'yavaş' tarayıcı ayarları (binlerce projeksiyon) kullanılarak tarandı. Beyin sarı ile özetlenmiştir. (C) Yavaş ve hızlı taramalardan beyin hacmi ölçümleri. Vurgulanan yapılar: AL; anten lob; CB, merkezi beyin; FB, fan şeklinde gövde; FCS, yağ hücreleri; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobula plaka; Ben, medulla; Tekrar, retina. n = 5, Welch'in t testi. ns = önemli değil. Ölçek çubukları = 100 μm. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 348 (B) 350. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-B) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Şekil 4: Drosophila melanogaster karın X-ışını Mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Karınlar % 0.5 PTA ile boyandı ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya kritik nokta kuruması (CPD) takip edildi. (A) Kritik Nokta Kurutulmuş karın, YZ perspektifinden ve (A') XZ perspektifinden gösterilmiştir. (B) YZ perspektifinden ve (B') XZ perspektifinden gösterilen hidratlı karın. Çeşitli organlar vurgulanır: FC, yağ hücreleri; Hg, arka ayak; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Ölçek Çubukları (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 1: Dragonfly'daki Movie Maker kullanılarak 3D olarak işlenen üçüncü bir instar larva. Vurgulanan organlar arasında beyin (sarı), göz-antenli imaginal diskler (kırmızı), yağ gövdesi (mavi) ve vücut duvarı kasları (yeşil) bulunur. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Film 2: Suda görüntülenmiş örneklerin karşılaştırılması veya kritik nokta kurutmayı takip edin. %0,5 PTA ile lekelenmiş karınlar gösterilir. Her iki karın da aynı görüntü piksel boyutu ayarlarıyla (0,65 μm) tarandı. Bir dizi 2D dilim, sırt yüzeyinden başlayıp karnın ventral yüzeyinde biten bir 'Z-stack' formatında (YZ) gösterilir. Vurgulanan organlar: FC, yağ hücreleri; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Bu protokol, sağlam veya yumuşak laboratuvar mikron çözünürlüğünün tahribatsız görüntülenmesine izin verir. Hayvan fizyolojisi, anatomisi ve gelişim mekanizmalarını anlamak için kullanılabilir. Sinekler doku diseksiyonuna gerek kalmadan bozulmamış bir durumda görüntülendiğinden, doku ve organların mekansal mimarisi doğal durumlarında korunur ve kolayca gözlemlenir.Mikro BT, sineklerde insan hastalıklarının modellenmesine veya yaşam kalitesini etkileyen gelişimsel kusurların anlaşılmasına yönelik çalışmalar için ideal bir araçtır. Mühendislik, fizik, malzeme bilimi, jeoloji ve antropoloji gibi diğer disiplinlerde de yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Görüntüleme için ilgilenilen gelişimsel zaman noktasını seçtikten sonra, 5 ila 20 hayvanı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre PBST'ye aktarın ve hidrofobik kaplamanın çıkarılmasına yardımcı olmak için tüpü oda sıcaklığında periyodik olarak hafifçe vurarak beş dakika inkübe edin ve hayvanların tamamen suya daldırılmasına izin verin.Kuluçka işleminin sonunda, PBST'yi bir mililitre Bouin çözeltisi ile değiştirin ve sinekleri tamamen batırmak için tüpe hafifçe vurun. Larva ve pupa örnekleri için, oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyondan sonra, hayvanları beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve yıkama başına bir mililitre taze PBS kullanın. Son yıkamadan sonra, numuneleri bir diseksiyon mikroskobu altında kuyucuk başına taze PBS içeren çok kuyulu bir diseksiyon kabına aktarın ve alttaki yumuşak dokuyu bozmamaya dikkat ederek her numunenin ön ve arka kütikülünde bir delik açmak için bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pimi kullanın.Tırnak etlerine nüfuz ettikten sonra, numuneyi 30 dakika boyunca üç kez ve yıkama başına bir mililitre bir mikro CT yıkama tamponu yıkamadan önce, numuneyi oda sıcaklığında 24 saat boyunca yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte bir mililitre taze Bouin solüsyonunda inkübe edin. Son yıkamadan sonra, tüpe bir mililitre uygun boyama solüsyonu ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında iki ila yedi gün inkübe edin. Daha uzun görüntü koruması gerekiyorsa, numuneleri kritik nokta kurutmaya hazırlamak için, artan etanol serisi içindeki numuneleri, belirtildiği gibi konsantrasyon başına bir saat boyunca bir mililitre etanol içinde kurutun.Kritik noktada kurutulmuş numuneleri monte etmek için, tüpleri döner tabla tutucusuna monte etmeden önce numuneleri plastik veya cam kılcal tüplere yerleştirin. Hidratlı numune montajı için bir P10 pipet ucunu suyla doldurun ve dar ucu parafin film ile sabitleyin. Tek bir numuneyi pipet ucuna aktarmak için forseps kullanın ve numuneyi yerinde tutmak için ucun duvarına temas edene kadar numuneyi dikkatlice ucun içine doğru itmek için uzun, ince bir nesne kullanın.Pipetin açık ucunu kapattıktan sonra, P10 pipetini dönen tablanın takozuna sığacak şekilde tasarlanmış bir tutucuya monte edin. Tarama için, dönen aşama takozuna erişmek için tarayıcı yazılımındaki Açık Kapı simgesine tıklayın ve numuneyi takmak için numune tutucunun tabanının etrafındaki bileziği sıkın. Optimum çözünürlük ve kontrast için yazılımdaki tarama parametrelerini ayarlayın ve x-ışını kaynağı güç kontrolünü açmak için Seçenekler ve X-Işını Kaynağı'na tıklayın.Üç ila dört Watt güce ve küçük bir nokta boyutuna sahip bir x-ışını ışını ışını üretmek için x-ışını voltajını 30 ila 40 kilovolta ve akımı 100 ila 110 mikro ampere ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Taramalar sırasında elde edilecek projeksiyon görüntülerinin sayısını ayarlamak için, kamera pozlama süresini 500 ila 800 milisaniye olarak ayarlamak için Seçenekler ve Çekim Modları'nı seçin ve kamera ayarlarına ve konumuna göre istenen görüntü piksel boyutunu ayarlamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Örneği 360 derecelik dönüş yolu boyunca hareket ettirmek için kaydırma çubuğunu tıklatın ve sürükleyin ve örneği görüş alanı içinde tutun.Edinmeye başla simgesini tıklayın. Ek tarama parametrelerinin ayarlanmasına izin veren bir iletişim kutusu görünecektir. Taramanın kaydedileceği dosyayı ve çıktı klasörünü adlandırın.Rastgele hareketi 10'a ve ortalamayı dört ila altı kareye ayarlayın. Döndürme adımı, kullanılan kamera ayarlarına bağlı olarak otomatik olarak hesaplanacaktır, ardından alıma başlamak için Tamam'a tıklayın. Tarama süresini gösteren bir ilerleme çubuğu iletişim kutusu görünecek ve tarayıcı, dönüş yolu boyunca numunenin bir dizi projeksiyon görüntüsünü almaya başlayacaktır.Tomogramları oluşturmak için, projeksiyon görüntülerini yeniden yapılandırma yazılımında açın ve ilk görüntü hizalamasını gerçekleştirmek için kaydırma düzeltme algoritmasını seçin. Projeksiyon görüntülerini düzgün bir şekilde hizalayan en iyi değeri seçin ve her bir yeniden yapılandırma parametresine ince ayar yapmak için İnce ayar'ı tıklatın. Doğru değerleri seçmek için kullanılabilecek bir dizi önizleme oluşturulur.Ayarlar sekmesinde en uygun parametre değerlerinin görüntülendiğini onaylayın ve Çıktı sekmesinde bit derinliği, dosya adı ve verilerin kaydedileceği klasör gibi dosya parametrelerini ayarlayın. Bir ilgi alanı, yalnızca ilgilenilen yapıları yeniden yapılandırmak için kullanılabilir. Birden fazla yeniden yapılandırma gerekiyorsa, geçerli görüntüyü toplu iş yöneticisine eklemek ve kalan görüntüler için yeniden yapılandırmayı tekrarlamak için Başlat ve Toplu işleme ekle'ye tıklayın.Yeniden yapılandırılmış görüntülerin morfometrik analizi için, Segment sekmesi altında, uygun bir morfometrik analiz yazılım programında, Temel ve Yeni'yi tıklatın, görüntüye yeni bir ad verin ve uygun bir renk seçin. Aralığı tanımla kutusunu işaretleyin ve ilgilenilen yapıyı kapsayan eşik aralığını ayarlamak için kaydırıcıyı ayarlayın. Eşikle tanımlanan bir alanı boyamak için, farenin sol tuşunu basılı tutarken Control tuşunu basılı tutun.Bir alanı kaldırmak için, farenin sol tuşunu basılı tutarken Shift tuşunu basılı tutun. İlgilenilen ağ bölgesinin ölçümlerinin, temel morfometrik analiz için bilgi panelinde görüntülendiğinden emin olun. Kafes nesnesini ve tüm tomogram görüntüsünü oluşturun ve elde edilen görüntüyü 3B olarak görselleştirin, ardından görüntüleyiciden tek tek kareler kullanarak nesnenin bir videosunu oluşturmak için Movie Maker'ı Göster'i seçmek için sağ tıklayın.Bu görüntülerde, bir embriyo, üçüncü instar larva, ferrat yetişkin aşamasında pupa ve iyotla boyanmış ve ticari bir tezgah üstü tarayıcı kullanılarak suda görüntülenen yetişkin dişi sinek gözlemlenebilir. Hassas dokunun mükemmel bir şekilde korunması ve hatta boyanması belirgindir ve tüm ana organların kolayca tanımlanmasını sağlar. Burada, hem yavaş hem de hızlı projeksiyon tarama modunda elde edilen aynı yetişkin sinek başlığının bir karşılaştırması gösterilmektedir.Daha da önemlisi, yavaş görüntülerdeki çözünürlük daha yüksek olmasına rağmen, morfometrik analiz yavaş ve hızlı taramalar arasında farklılık göstermez. İşleme yazılımı kullanılarak, ilgilenilen herhangi bir doku veya organ sistemi bölümlere ayrılabilir ve morfometrik analiz ve 3D görselleştirme için kullanılabilir. Bu görüntülerde, fosfotungstik asit ile boyanmış ve su ile nemlendirildiğinde veya bir x-ışını mikroskobunda kritik nokta kurumasını takiben görüntülenen bir sinek karnı gözlemlenebilir.Fosfotungstik asit kullanılarak, orta bağırsağın bireysel epitel hücreleri ve testislerdeki sperm demetleri kolayca çözülür. Kritik nokta kuruma görüntüleri, hidratlı numuneye kıyasla marjinal olarak daha yüksek çözünürlük gösterirken, kütikül yakınındaki yağ hücreleri gibi hidratlı numunelerle hassas dokuların üst yapısının daha iyi korunması sağlanır. En iyi çözünürlük için numune hareketini ve aşırı titreşimleri sınırlayın.Numuneyi sahneye sabitlemek bunun için kritik öneme sahiptir, ancak bunu başarmak için yaratıcılık ve beceriklilik gerekebilir. Işık ve elektron mikroskobu gibi ek görüntüleme yöntemleri, nano ölçekten tüm organizmaya kadar belirli bir gen mutasyonunu anlamak için görüntüleme iş akışının bir parçası olarak kullanılabilir.

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

MicroCT tarafından Kontrastlı küçük hayvan damar görüntüleme seri için hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verimli...

Kontrast Geliştirilmiş Gemi Görüntüleme MicroCT kullanarak

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Davranış sırasında ve uyaranlara yanıt olarak yetişkin Drosophila'nın tüm beynini imgelemek için özel olarak uyarlanmış bir yöntem sunuyoruz. Baş, tüm beyne optik erişime izin vermek için konumlandırılırken, sinek bacaklarını ve antenleri, hortumun ucunu hareket ettirebilir ve gözler duyusal uyaranları alabilir.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Öğrenin, mikro bilgisayarlı tomografi kullanarak Drosophila melanogaster'ın gelişim aşamalarını zarar vermeden görüntüleme yöntemini. Bu teknik, doku mimarisini koruyarak anatomik yapıları detaylı incelemenizi sağlar.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet