Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Bu protokol, sağlam veya yumuşak laboratuvar mikron çözünürlüğünün tahribatsız görüntülenmesine izin verir. Hayvan fizyolojisi, anatomisi ve gelişim mekanizmalarını anlamak için kullanılabilir. Sinekler doku diseksiyonuna gerek kalmadan bozulmamış bir durumda görüntülendiğinden, doku ve organların mekansal mimarisi doğal durumlarında korunur ve kolayca gözlemlenir.

Mikro BT, sineklerde insan hastalıklarının modellenmesine veya yaşam kalitesini etkileyen gelişimsel kusurların anlaşılmasına yönelik çalışmalar için ideal bir araçtır. Mühendislik, fizik, malzeme bilimi, jeoloji ve antropoloji gibi diğer disiplinlerde de yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Görüntüleme için ilgilenilen gelişimsel zaman noktasını seçtikten sonra, 5 ila 20 hayvanı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre PBST'ye aktarın ve hidrofobik kaplamanın çıkarılmasına yardımcı olmak için tüpü oda sıcaklığında periyodik olarak hafifçe vurarak beş dakika inkübe edin ve hayvanların tamamen suya daldırılmasına izin verin.

Kuluçka işleminin sonunda, PBST'yi bir mililitre Bouin çözeltisi ile değiştirin ve sinekleri tamamen batırmak için tüpe hafifçe vurun. Larva ve pupa örnekleri için, oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyondan sonra, hayvanları beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve yıkama başına bir mililitre taze PBS kullanın. Son yıkamadan sonra, numuneleri bir diseksiyon mikroskobu altında kuyucuk başına taze PBS içeren çok kuyulu bir diseksiyon kabına aktarın ve alttaki yumuşak dokuyu bozmamaya dikkat ederek her numunenin ön ve arka kütikülünde bir delik açmak için bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pimi kullanın.

Tırnak etlerine nüfuz ettikten sonra, numuneyi 30 dakika boyunca üç kez ve yıkama başına bir mililitre bir mikro CT yıkama tamponu yıkamadan önce, numuneyi oda sıcaklığında 24 saat boyunca yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte bir mililitre taze Bouin solüsyonunda inkübe edin. Son yıkamadan sonra, tüpe bir mililitre uygun boyama solüsyonu ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında iki ila yedi gün inkübe edin. Daha uzun görüntü koruması gerekiyorsa, numuneleri kritik nokta kurutmaya hazırlamak için, artan etanol serisi içindeki numuneleri, belirtildiği gibi konsantrasyon başına bir saat boyunca bir mililitre etanol içinde kurutun.

Kritik noktada kurutulmuş numuneleri monte etmek için, tüpleri döner tabla tutucusuna monte etmeden önce numuneleri plastik veya cam kılcal tüplere yerleştirin. Hidratlı numune montajı için bir P10 pipet ucunu suyla doldurun ve dar ucu parafin film ile sabitleyin. Tek bir numuneyi pipet ucuna aktarmak için forseps kullanın ve numuneyi yerinde tutmak için ucun duvarına temas edene kadar numuneyi dikkatlice ucun içine doğru itmek için uzun, ince bir nesne kullanın.

Pipetin açık ucunu kapattıktan sonra, P10 pipetini dönen tablanın takozuna sığacak şekilde tasarlanmış bir tutucuya monte edin. Tarama için, dönen aşama takozuna erişmek için tarayıcı yazılımındaki Açık Kapı simgesine tıklayın ve numuneyi takmak için numune tutucunun tabanının etrafındaki bileziği sıkın. Optimum çözünürlük ve kontrast için yazılımdaki tarama parametrelerini ayarlayın ve x-ışını kaynağı güç kontrolünü açmak için Seçenekler ve X-Işını Kaynağı'na tıklayın.

Üç ila dört Watt güce ve küçük bir nokta boyutuna sahip bir x-ışını ışını ışını üretmek için x-ışını voltajını 30 ila 40 kilovolta ve akımı 100 ila 110 mikro ampere ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Taramalar sırasında elde edilecek projeksiyon görüntülerinin sayısını ayarlamak için, kamera pozlama süresini 500 ila 800 milisaniye olarak ayarlamak için Seçenekler ve Çekim Modları'nı seçin ve kamera ayarlarına ve konumuna göre istenen görüntü piksel boyutunu ayarlamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Örneği 360 derecelik dönüş yolu boyunca hareket ettirmek için kaydırma çubuğunu tıklatın ve sürükleyin ve örneği görüş alanı içinde tutun.

Edinmeye başla simgesini tıklayın. Ek tarama parametrelerinin ayarlanmasına izin veren bir iletişim kutusu görünecektir. Taramanın kaydedileceği dosyayı ve çıktı klasörünü adlandırın.

Rastgele hareketi 10'a ve ortalamayı dört ila altı kareye ayarlayın. Döndürme adımı, kullanılan kamera ayarlarına bağlı olarak otomatik olarak hesaplanacaktır, ardından alıma başlamak için Tamam'a tıklayın. Tarama süresini gösteren bir ilerleme çubuğu iletişim kutusu görünecek ve tarayıcı, dönüş yolu boyunca numunenin bir dizi projeksiyon görüntüsünü almaya başlayacaktır.

Tomogramları oluşturmak için, projeksiyon görüntülerini yeniden yapılandırma yazılımında açın ve ilk görüntü hizalamasını gerçekleştirmek için kaydırma düzeltme algoritmasını seçin. Projeksiyon görüntülerini düzgün bir şekilde hizalayan en iyi değeri seçin ve her bir yeniden yapılandırma parametresine ince ayar yapmak için İnce ayar'ı tıklatın. Doğru değerleri seçmek için kullanılabilecek bir dizi önizleme oluşturulur.

Ayarlar sekmesinde en uygun parametre değerlerinin görüntülendiğini onaylayın ve Çıktı sekmesinde bit derinliği, dosya adı ve verilerin kaydedileceği klasör gibi dosya parametrelerini ayarlayın. Bir ilgi alanı, yalnızca ilgilenilen yapıları yeniden yapılandırmak için kullanılabilir. Birden fazla yeniden yapılandırma gerekiyorsa, geçerli görüntüyü toplu iş yöneticisine eklemek ve kalan görüntüler için yeniden yapılandırmayı tekrarlamak için Başlat ve Toplu işleme ekle'ye tıklayın.

Yeniden yapılandırılmış görüntülerin morfometrik analizi için, Segment sekmesi altında, uygun bir morfometrik analiz yazılım programında, Temel ve Yeni'yi tıklatın, görüntüye yeni bir ad verin ve uygun bir renk seçin. Aralığı tanımla kutusunu işaretleyin ve ilgilenilen yapıyı kapsayan eşik aralığını ayarlamak için kaydırıcıyı ayarlayın. Eşikle tanımlanan bir alanı boyamak için, farenin sol tuşunu basılı tutarken Control tuşunu basılı tutun.

Bir alanı kaldırmak için, farenin sol tuşunu basılı tutarken Shift tuşunu basılı tutun. İlgilenilen ağ bölgesinin ölçümlerinin, temel morfometrik analiz için bilgi panelinde görüntülendiğinden emin olun. Kafes nesnesini ve tüm tomogram görüntüsünü oluşturun ve elde edilen görüntüyü 3B olarak görselleştirin, ardından görüntüleyiciden tek tek kareler kullanarak nesnenin bir videosunu oluşturmak için Movie Maker'ı Göster'i seçmek için sağ tıklayın.

Bu görüntülerde, bir embriyo, üçüncü instar larva, ferrat yetişkin aşamasında pupa ve iyotla boyanmış ve ticari bir tezgah üstü tarayıcı kullanılarak suda görüntülenen yetişkin dişi sinek gözlemlenebilir. Hassas dokunun mükemmel bir şekilde korunması ve hatta boyanması belirgindir ve tüm ana organların kolayca tanımlanmasını sağlar. Burada, hem yavaş hem de hızlı projeksiyon tarama modunda elde edilen aynı yetişkin sinek başlığının bir karşılaştırması gösterilmektedir.

Daha da önemlisi, yavaş görüntülerdeki çözünürlük daha yüksek olmasına rağmen, morfometrik analiz yavaş ve hızlı taramalar arasında farklılık göstermez. İşleme yazılımı kullanılarak, ilgilenilen herhangi bir doku veya organ sistemi bölümlere ayrılabilir ve morfometrik analiz ve 3D görselleştirme için kullanılabilir. Bu görüntülerde, fosfotungstik asit ile boyanmış ve su ile nemlendirildiğinde veya bir x-ışını mikroskobunda kritik nokta kurumasını takiben görüntülenen bir sinek karnı gözlemlenebilir.

Fosfotungstik asit kullanılarak, orta bağırsağın bireysel epitel hücreleri ve testislerdeki sperm demetleri kolayca çözülür. Kritik nokta kuruma görüntüleri, hidratlı numuneye kıyasla marjinal olarak daha yüksek çözünürlük gösterirken, kütikül yakınındaki yağ hücreleri gibi hidratlı numunelerle hassas dokuların üst yapısının daha iyi korunması sağlanır. En iyi çözünürlük için numune hareketini ve aşırı titreşimleri sınırlayın.

Numuneyi sahneye sabitlemek bunun için kritik öneme sahiptir, ancak bunu başarmak için yaratıcılık ve beceriklilik gerekebilir. Işık ve elektron mikroskobu gibi ek görüntüleme yöntemleri, nano ölçekten tüm organizmaya kadar belirli bir gen mutasyonunu anlamak için görüntüleme iş akışının bir parçası olarak kullanılabilir.