Name: Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Öğrenin olgunlaşmamış kedi oositlerinin minimum hacim vitrifikasyonu yöntemini. Bu protokol, üreme biyolojisi ve biyolojik çeşitliliğin korunması için laboratuvar ortamında hazırlanan çözeltilerle uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen EVSSAR (Avrupa Küçük Hayvan Üreme Derneği) Grant 2016 ve Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. MariaGiorgia Morselli'ye burada betimlenen deneylere ve görüntü edinimine olan katkıları için teşekkür ederiz.

Bu vesileyle yapılan işlemler, kedi yumurtalıkları veteriner kliniklerinde sahibinin istediği rutin ovariektomi veya ovariohysterektomiden elde edilen ürünler olarak toplandığı için etik onaya tabi tutulmadı.
1. Yumurta toplama
<ol><li>Deneylere başlamadan önce, yumurtalık ve yumurta toplama için çözümler hazırlayın. Antibiyotik ve antimikotikkarışımı (100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat, 0.25 μg/mL amphotericin B) karışımı ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile yumurtalık toplama çözeltisi hazırlayın. 100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat ve %0.1 (w/v) polivinil alkol (PVA) ile PBS ile oosit toplama çözeltisi (yani PBS/PVA) hazırlayın.</li>
	<li>Yumurtalık ve yumurta toplama için çözümleri kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Vezirlerin ödeme gününde, numuneleri işlemeden birkaç saat önce, yumurtalık ve yumurta toplama solüsyonlarının bir parçası olun ve oda sıcaklığında (RT; 25 ± 2 °C) ısınmalarına izin verin.</li>
	<li>Örnekler laboratuvara geldiğinde, yumurtalıkları çevredeki bağ dokusundan ve oviduct'ten izole edin ve petri kabında taze yumurtalık toplama ortamında yıkayın.</li>
	<li>Her kraliçe için yaklaşık 3 mL RT PBS/PVA ile bir adet 35 mm Petri kabı doldurun ve yumurtaları toplamak için bir çanak daha doldurun.</li>
	<li>Bir Petri kabına bir çift yumurtalık yerleştirin ve bir cerrahi neşter ile korteks kıyma. Tüm foliküllerin stereomikroskop (büyütme 8x) yardımıyla kırıldığından emin olun.</li>
	<li>Bir pipet ile COCs toplamak ve ayrılan Petri çanak taze PBS / PVA onları taşımak. Homojen, koyu sitoplazmalı ve birkaç kompakt küulus hücresi katmanı ile çevrili iyi nitelikler ekolleri seçin (Grade I18).</li>
</ol>2. Vitrifikasyon
<ol><li>Denge ve vitrifikasyon ortamını hazırlayın.<ol>
<li>Orta 199 yılında %7,5 (v/v) etilen glikol (EG) ve %7,5 (v/v) dimethylsulphoxide (DMSO) ile %20 fetal sığır serumu (FBS) ile denge çözeltisi (ES) hazırlayın.</li>
		<li>%15 (v/v) EG, %15 (v/v) DMSO ve Orta 199'da 0,5 M sakaroz ile %20 FBS (19'danmodifiye) ile vitrifikasyon solüsyonu (VS) hazırlayın.</li>
		<li>Es ve VS'nin kullanmadan önce RT'de ısınmasına izin verin. NOT: Kriyoprotekterlerin (örneğin, EG, DMSO) sitotoksik olduğu bilinmektedir. Onların toksisite karşı bir strateji hangi hücrelerin onlara maruz olduğu sıcaklığı azaltmaktır20, ve yumurtalar genellikle RT kriyoprotektörler maruz kıtatüran. Böylece, sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için bu protokolde yumurta toplamadan vitrifikasyona kadar tüm prosedür RT'de gerçekleştirilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrifikasyon kabını (örneğin, "Repro plakası" olarak bilinen iki sıraya bölünmüş altı konik kuyudan oluşan özel bir yemek) hazırlayın. Her vitrifikasyon desteği için bir satır (üç kuyu) hazırlayın.<ol>
<li>İlk kuyunun altına 20°L ES ekleyin.</li>
		<li>İkinci (yani, 1VS) ve üçüncü (yani, 2VS) kuyuların altına 300 μL VS ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>ES'deki COC'ları dengeleyin.<ol>
<li>Küçük delikli bir pipetle (örn. bir Pasteur pipeti daha ince yapmak için Bunsen gagasına çekilir – çapı en az 200 μm olmalıdır), ilk kuyunun alt kısmında bir (veya daha fazla) COC(lar) aktarın. NOT: Pipetin boyutunu, her adımda COC'lerle aktarılan ortam hacmini mümkün olduğunca azaltmayı amaçlayan, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerinin katman sayısına göre seçin. Mevcut protokol ile, eğitimli operatörler her vitrifikasyon desteği başına en fazla sekiz kedi COC'u başarıyla vitrifiye edebilirler.</li>
		<li>Yavaşça damla sınırında ES 20 μL ekleyin. 3 dakika bekleyin.</li>
		<li>Yavaşça damla sınırında ES diğer 20 μL ekleyin. 3 dakika bekleyin.</li>
		<li>Yavaşça damla sınırında ES 240 μL ekleyin. 9 dakika bekleyin.</li>
		<li>Beklerken, sıvı nitrojen (LN2)içeren bir kutu hazırlayın, deney/kedi tanımlama koduyla vitrifikasyon desteği etiketleyin ve açık bırakın. Her ikisini de stereomikroskobun yakınına koyun, böylece çalışırken kolayca ulaşılabilir ler. Dikkat! LN2'yikullanırken kişisel koruyucu ekipman takın.</li>
		<li>Alternatif olarak, birkaç COVitrifiye olması gerekiyorsa, başka bir COC grubu için (yeni bir vitrifikasyon desteğine yüklenecek olan adım 2.3.1 - 2.3.2'ye bakınız) ilk dengeleme adımına başlayabilirsiniz.</li>
	</ol></li>
	<li>90 saniyeden daha kısa bir sürede VS'deki COC'ları vitrifiy.<ol>
<li>Aynı küçük delikli pipeti kullanarak, 1VS ile doldurun, ilk kuyunun (ES) altındaki COC'ları alın ve ikinci kuyunun (1VS) yüzeyine taşıyın.</li>
		<li>Pipeti 1VS ile yıkayın.</li>
		<li>COCs alın ve başka bir alanda (alt) kuyunun taşıyın; pipet ile çevreleyen orta karıştırın.</li>
		<li>Pipeti kuyunun başka bir alanında 1VS ile doldurun, COC'leri alın, taşıyın ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın.</li>
		<li>Adımı tekrarlayın 2.4.4.</li>
		<li>Pipeti 2VS ile yıkayın.</li>
		<li>COC'ları alın ve üçüncü kuyunun (2VS) altına taşıyın; pipet ile çevreleyen orta karıştırın.</li>
		<li>Pipeti kuyunun başka bir alanında 2VS ile doldurun, COC'leri alın, taşıyın ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın.</li>
		<li>Adımı tekrarlayın 2.4.8.</li>
		<li>Pipeti kuyunun başka bir alanında 2VS ile doldurun, COC'ları alın ve vitrifikasyon desteğinin şeridine mümkün olduğunca ucuna yakın yükleyin. VS hacmini mümkün olduğunca azaltmak için aşırı ortamı aspire edin.</li>
		<li>Hemen LN2vitrifikasyon desteği dalma , hareket ettirin. Bazı kelepçeler yardımıyla kapatın, her zaman LN2'yedaldırılmış olarak kaldığından emin olun. NOT: Kriyoprotektif hücre toksisitesi nedeniyle doğru zamanlamayı tutmak çok önemlidir. Vitrifikasyon ortamlarında yüksek konsantrasyon nedeniyle, hücre maruziyeti kontrol edilmelidir, ayrıca tekniğin kusursuz yürütülmesi ile21. Numuneler bolise, bunları daha hızlı işlemek için bölmeyi düşünün ve yumurta koleksiyonundan vitrifikasyona kadar olan süreyi en aza indirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yüklü vitrifikasyon desteklerini bir kadehte saklayın ve ısınmaya kadar bir depolama LN2 tankında saklayın. NOT: LN2 varsa, protokolün önceki tüm adımları alan koşullarında da uygulanabilir. Numuneleri güvenli bir şekilde laboratuvara taşımak ve aşağıdaki aşamalarla devam etmek için kuru bir gönderic gerekli olacaktır.</li>
</ol>3. Isınma
<ol><li>Isınma ortamı hazırlayın.<ol>
<li>Orta 199 yılında 1 M sakaroz ile %20 FBS ile eritme çözeltisi (TS) hazırlayın.</li>
		<li>Orta 199 yılında 0,5 M sakaroz ile seyreltme çözeltisi (DS) hazırlayın, % 20 FBS ile.</li>
		<li>%20 FBS ile Orta 199 ile yıkama çözeltisi (WS) hazırlayın.</li>
		<li>Kullanmadan önce TS'yi 38 °C'ye, DS ve WS'yi RT'de ısıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerekirse, ısıtılmış COC'ların sonraki kullanımına (örn. in vitro maturasyon, IVM) kültür ortamı nı hazırlayın.</li>
	<li>Isıtma aşamasını stereomikroskoba yakın yerleştirin ve açın (38 °C). Isınmak için petri kabının kapağını koyun.</li>
	<li>Her şey hazır olduğunda, depolama tankından ısıtılması gereken vitrifikasyon desteklerini LN2içeren bir kutuya aktarın ve kutuyu stereomikroskobun yakınına koyun.</li>
	<li>"Repro plakasını" hazırlayın. Isınması gereken her vitrifikasyon desteği için bir satır hazırlayın.<ol>
<li>İlk kuyunun altına 300 μL DS ekleyin.</li>
		<li>İkinci kuyunun altına (yani 1WS) ve üçüncü (2WS) kuyuların altına 300 μL WS ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Petri kabının kapağına bir damla TS (100 μL) yapın.</li>
	<li>Kelepçeler ile LN2'debir vitrifikasyon desteği açın.</li>
	<li>Stereomikroskop altında TS damla koyun ve hızlı bir hareketle LN2 vitrifikasyon desteği almak ve damla onun şerit batırın, tüm COCs kopmak kadar hareket. Boşalır boş almaz desteği damladan çıkarın, ancak CoC'leri toplamda 1 dakika ts olarak bırakın (aşağıdaki adıma kadar daldırmadan).</li>
	<li>Vitrifikasyon için kullanılan benzer bir pipet alın ve DS ile doldurun. Damla (TS) den COCs alın ve ilk kuyu (DS) altına taşıyın. 3 dakika bekleyin.</li>
	<li>Pipeti 1WS ile yıkayın. COC'ları alın ve ikinci kuyunun (1WS) altına taşıyın. 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Pipeti 2WS ile yıkayın. COC'leri alın ve üçüncü kuyunun (2WS) yüzeyinde taşıyın. Kuyunun dibine dokunmalarını bekle.</li>
	<li>Kuyunun başka bir alanını kullanarak adım 3.11'i tekrarlayın.</li>
	<li>Pipetleri kültür ortamıyla yıkayın ve yumurtaları aşağıdaki kullanım için kültür yemeğine taşıyın (örn. IVM).</li>
</ol>

<ol><li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+social+implications+of+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li>
<li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li>
<li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li>
<li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+mammalian+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li>
<li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li>
<li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li>
<li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).</li>
<li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+The+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73(2007).</li>
<li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification%2C+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li>
<li>Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li>
<li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329(2019).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture%3A+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li>
<li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature%2C+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li>
<li>Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li>
<li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cryobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncofertility+-+Fertility+preservation+for+Cancer+Survivors%22%5BJournal%5D)">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li>
<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li>
<li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li>
<li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li>
<li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos%3A+current+problems+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li>
<li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li>
<li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+%28Felis+catus%29+in+reproductive+season%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li>
<li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viability+of+Serval+%28Leptailurus+serval%29+and+Pallas+Cat+%28Felis+manul%29+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Oosit kriyoprezervasyon felidae ailesi gibi birçok türün nesli tükenmekte olan taksonlarda özellikle önemli bir germplazm koruma tekniğidir. Bu yazıda, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının vitrifikasyonu için basit ve alan dostu bir protokol sunulmuştur. Laboratuvar yapımı ortam, minimum hacim vitrifikasyon destekleri ve eğitimli personel, bu yöntemin başarısı için önemli faktörlerdir, bu da temsili sonuçlarda gösterildiği gibi sürekli ve sürekli olarak canlı yumurtaların elde edilmesine olanak sağlar.
<p class="jove_co...

Kriyopreservation destekli üreme teknikleri (ARTs) önemli bir adım haline gelmiştir. İnsanlarda, bu tıbbi veya kişisel nedenlerle doğurganlık korunması veya ebeveynlik ertelenmesi sağlar. Hayvanlarda, özellikle çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlarda, planlanan çiftliklerde mesafe ve zamanın üstesinden gelmek ya da özellikle nesli tükenmekte olan vahşi türler olmak üzere koruma programlarındaki değerli deneklerin genetik materyallerini korumak gereklidir. Gamet kriyoppreservation bireylerin henüz seçilmiş değil ya da amacıyla embriyo dondurma ile ilgili etik sorunları önlemek için, özellikle insan tıbbı1en iyi seçimdir. Spermatozoakorumak ve erime sonra tatmin edici sonuçlar vermek nispeten kolaydır, ancak yumurta, yapısal özellikleri nedeniyle, saklamak için daha karmaşık olabilir. Nitekim, düşük yüzey / hacim oranı, hem de ooplazma çevreleyen zona pellucida varlığı,hücre2 boyunca kriyoprotektif ve su hareketini sınırlar . Ayrıca, felidler de dahil olmak üzere evcil hayvanlarda, onlar kriyopreservation3onları daha duyarlı hale getirmek için düşünülen bir lipid açısından zengin sitoplazma ile karakterizedir.
En felids tehdit altındadır, ve evcil kedi rutin ovariektomi gelen gonadların durumu sayesinde germplasm korunması için protokoller geliştirmek için bir model olarak kullanılır. Vahşi hayvanlarda, gonadlar elektif ameliyatlardan sonra veya (daha sık) post-mortemsonra elde edilebilir, ve olgunlaşmamış (germinal vezikül) gametler alınabilir. Hormonal stimülasyon olgun elde etmek için amaçlayan (metafaz II) oositler etik sorunlar ve tür nedeniyle insan ARTs olarak yaygındeğildir-ve tedavilere bireysel-özel yanıt 4 .
Bu nedenle, kriyoprezervasyon stratejilerinin geliştirilmesi genellikle nadir bireylerin beklenmedik veya ani ölümünden sonra alınabilir olgunlaşmamış gametler, odaklanmıştır. Biyolojik bir bakış açısıyla, her birinin avantajları olan olgunlaşmamış veya olgun gametlerin kriyopreservation bazı farklılıklar vardır. İlk olarak, DNA daha olgunlaşmamış oositler korunur, olan germinal vezikül bir nükleer membran ile çevrili kromozomlar içerir, metafaz II oositlerin meiotik mil kriyoyaralanmalara karşı daha savunmasız olabilirise 5. İkinci olarak, soğuk kaynaklı sitoiskelet hasarları iğ rotasyonunu, kutup cisim ekstrüzyonu, pronükleer göç ve sitokinezi etkileyebilir, bu da oosit gelişim evresine göre farklı etkilere yol açabilir, mayoz progresyonu veya döllenme sonrası olayları etkileyebilir. Son olarak, ve belki de en önemlisi, olgun yumurtadöllenmeye hazır iken, olgunlaşmamış gametler nükleer ve sitoplazmikolgunlaşma6 geçmesi için çevreleyen kümülüs hücrelerinin desteğine güveniyor , ve bu nedenle tüm kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) cryopreserved vardır. Ancak, kümülüs hücrelerinin kaybı ve/veya gamet ve çevresindeki somatik hücreler arasındaki fonksiyonel bağlantının kaybı muhtemelen olgunlaşmamış COC'lerin kriyopreservation en zararlı etkisidir.
Kriyopreservation teknikleri arasında vitrifikasyon alan koşullarında daha kolay uygulanabilen bir tekniktir. Yavaş (veya kontrollü hız) dondurma ile karşılaştırıldığında, vitrifikasyon daha hızlıdır ve programlanabilir bir dondurucu gibi belirli ekipmanlar gerektirmez. Vitrifikasyonun üç temel prensibini (yani yüksek viskozite, yüksek kriyoprotektif konsantrasyon, küçük hacimler ve ultra hızlı sıcaklık düşüşüne bağlı) karşılamak için, özellikle olgunlaşmamış ve olgun yumurtalar için kedilerde çeşitli ortam ve destekler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Basit pipetler7ile başlayarak, cihazlar daha sonra "Minimum hacim" hedefine ulaşmak için geliştirilmiştir. Cryoloop8, açık çekti pipetler (OPS)9, plastik oluklar (modifiye saman)10 ve kriyotüpler11 kullanılmıştır, kadar daha verimli bir cihaz (yani, Cryotop) istihdam edildi11, hayatta kalma ve kızamık devamı iyileştirilmesi. Cryotop (Ek Şekil 1) vitrifikasyon için seçmeli açık sistem haline gelmiştir ticari olarak kullanılabilir bir destektir. İnsan yumurtaları ve embriyoların vitrifikasyon için geliştirilen, bu depolama sırasında plastik bir tüp kapağı ile korunan sert bir plastik tutucu bağlı küçük bir film şerit oluşur12. Kullanılabilirliği ve vitrifikasyon hacmindeki aşırı azalma (0,1 μL gibi az), aynı zamanda son derece hızlı soğutma ve ısınma oranlarıyol açar, bu vitrifikasyon desteği giderek çeşitli medya13,,14,15,16,17ile kullanılmıştır yerli kedi de dahil olmak üzere çeşitli türler, uygulanmıştır .
Bu makalenin amacı, insan yumurtaları için başlangıçta geliştirilen, minimum hacimli vitrifikasyon için laboratuvar yapımı medya ve ticari destekler kullanan ve olgunlaşmamış kedi COC'larının kriyopreservation için saha koşullarında kolayca uygulanabilen küçük değişikliklerle bir koleksiyon-vitrifikasyon-ısınma protokolünü tanımlamaktır.

<table><tbody><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Otomatik pipetler ve uçlar</td> <td>/</td><td>/</td> <td>20, 100, 240 ve 300 ve mikro pipetlemek için gerekli; L</td></tr><tr><td>Cerrahi neşterler</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Boyut 10 genellikle tamam</td></tr><tr><td>Bunsen gagası</td> <td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr> <tr><td>Kelepçeler</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Yumurtalık izolasyonu için bazı küçük (Sivrisinek kelepçesi), sıvı nitrojen Cryotop Kitazato'da çalışmak için daha büyük (Klemmer kelepçesi</td></tr><tr><td></td><td>) (distribütör: MBT - Tıbbi Biyolojik Teknolojiler)</td><td>01.CR</td><td>Distribütörler ve katalog numarası farklı ülkelerde değişebilir</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Etilen glikol (EG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E9129</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Cam Pasteur pipetleri</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Tavsiye edilen uzunluk 230 mm (100 + 130)</td></tr> <tr><td>Gobeletler</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Depolama tankının bidonları göre</td></tr><tr><td>Isıtma aşaması</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Tüm ısıtma aşamaları, 38&ordm'yi tutabildikleri sürece tamam; C</td></tr><tr><td>Sıvı azot</td> <td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr> <tr><td>Orta 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Penisilin G sodyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Polivinil alkol (PVA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Repro plakası</td><td>Kitazato (distribütör: MBT - Tıbbi Biyolojik Teknolojiler)</td><td>01.K-2</td><td>Distribütörler ve katalog numarası farklı ülkelerde değişebilir</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>/</td><td>/Operatör</td> <td>oositleri seçebildiği sürece diğer stereomikroskoplar uygundur</td></tr><tr><td>Depolama tankı</td><td>/</td><td>/</td><td>Düzenli olarak doldurulan herhangi bir tank tamam</td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>Strafor/nitrojene dayanıklı kutu</td><td>/</td><td>/Operatör</td> <td>rahat ettiği sürece sıvı nitrojen içerebilen tüm kutular uygundur. Kitazato kutusu "Soğutma Rafı" olarak</td></tr> <tr><td>adlandırılırSucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Zamanlayıcılar</td> <td>/</td><td>/</td> <td>9 dakikaya kadar sürelere ayarlanabilen tüm zamanlayıcılar tamam</td></tr></tbody></table>

olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimvitrifikasyonu

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Vahşi hayvanların koruma programlarında, gamet bankacılığı değerli bireylerin ve nadir türlerin genetik kaynaklarını korumak ve biyolojik çeşitliliğin korunmasını teşvik etmek için çok önemlidir. Felids, çoğu tür yok olma tehlikesiyle karşı karşıya, ve yerli ırklar germplasm bankacılık için protokollerin verimliliğini artırmak için bir model olarak kullanılır. Oosit kriyoprezervasyon teknikleri arasında, vitrifikasyon insan ve veteriner destekli üreme daha popüler. İlk olarak insan yumurtaları ve embriyolar için geliştirilen cryotop vitrifikasyon, kedi yumurtaları için çok uygun olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, alan koşullarındafizibilite ve yordamın hızı gibi çeşitli avantajlar sunar ve bu da birkaç numunenin işlenmesi gerektiğinde yararlı olabilir. Ancak, verimlilik güçlü operatörün becerilerine bağlıdır ve intra-ve laboratuvarlar arası standardizasyon yanı sıra personel eğitimi gereklidir. Bu protokol, yumurta koleksiyonundan ısınmaya kadar, adım adım alan dostu protokolile ticari destek te olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimli vitrifikasyonu dur. Protokolün ardından, yumurta bütünlüğünün ve ısınmada canlılığın korunması (%90'a kadar) ısınma sonrası olgunlaşma ve embriyonik gelişim sonuçlarında iyileşme için hala yer olmasına rağmen, beklenebilir.

Mevcut protokole göre kedi yumurtası vitrifikasyonve ısınmasını takiben(Şekil 1 ve Ek Şekil 1),gametlerin büyük çoğunluğu hayatta kalır. Vitrifikasyon sonrası, diğer tekniklerin yanı sıra, canlılık optik mikroskopta morfolojik bütünlük22 veya hayati lekelerin kullanımı ile değerlendirilebilir. İkincisi floresan diasetat / propidium iyodür (FDA / PI), hangi canlı (parlak yeşil floresan) ve ölü hücrelerin (kırmızı floresan) belirlenmesini sağlar. <stron...

Bu el yazması, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının ticari destekler de laboratuvar yapımı ortamla minimum hacimli vitrifikasyonuna ilişkin bir protokolü açıklamaktadır. Oosit izolasyonundan ex vivo gonadlardan vitrifikasyon ve ısınmaya kadar her adımı kapsar.

Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Bu protokol, hayvan türlerinde doğurganlık ve biyolojik çeşitliliğin korunması için çok önemli olan vitrifikasyon ile bilinen kriyopreservation tekniği ile kedi yumurtalarının uzun süreli korunması için yararlıdır. Vitrifikasyonun en önemli avantajları, 17 dakikadan daha kısa sürede tamamlanabildiği için hızı ve sıvı nitrojen varsa alan koşullarındaki fizibilitesidir. Evcil kedi vahşi nesli tükenmekte olan kedi için uygun bir modeldir.Kriyoppreservation protokollerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu kedi koruma programları için gamet biyobankaların kurulmasını sağlayacaktır. Bir satırda üç konik kuyular ile bir Repro vitrifikasyon plaka sıyrık hazırlayarak başlayın. Birinci kuyuya 20 mikrolitre denge çözeltisi, ikinci ve üçüncü kuyulara ise 300 mikrolitre vitrifikasyon çözeltisi ekleyin.Kümülüs yumurta komplekslerini veya COC'leri dengelemek için, bir veya daha fazla kompleksi ilk kuyunun altına aktarmak için küçük delikli bir pipet kullanın. Yavaşça damla sınırına 20 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve üç dakika bekleyin, sonra başka bir 240 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve dokuz dakika bekleyin. Beklerken sıvı nitrojen içeren bir kutu hazırlayın ve deney veya kedi tanımla

minimum-volume-vitrification-of-immature-feline-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu el yazması, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize eden deneysel bir yaklaşımı anlatmaktadır. Özellikle mevcut çalışma, ultrason kılavuzluğundaki ovum toplama (OPU) ile olgunlaşmamış ve olgun ata oositlerinin nasıl toplanacağını ve kromozom ayrımını, iğ morfolojisini, küresel histone asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağını göstermektedir.

At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi

Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

Oosit kriyoprezervasyonu, postpubertal kadınlarda doğurganlığın korunması için altın standart olarak çeşitli uluslararası bilim toplumları tarafından kabul edilmektedir. Uygun klinik ve laboratuvar stratejileri, doğurganlık koruma tedavilerinin maksimum etkinliğini, verimliliğini ve güvenliğini sağlar.

Oosit Vitrifikasyonu ile Doğurganlığın Korunması: Klinik ve Laboratuvar Perspektifleri

Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.

Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu

Özel bir ekip, Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser hastalarına laparoskopik vajinoplasti sırasında kontrollü yumurtalık stimülasyonu ve oosit kriyoprezervasyonu yapma seçeneği sunabilir.

Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser Sendromu Tedavisinde Vajinoplasti Sırasında Laparoskopik Oosit Elde Edilmesi ve Kriyoprezervasyonda

Yaygın olarak kullanılan yavaş dondurma protokolüne alternatif bir kriyoprezervasyon yöntemi olarak yumurtalık dokusunun vitrifikasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Camsı bir agregasyon durumu elde etmek için yumurtalık korteks dokusunun vitrifikasyonu

Bu protokol, foliküler sıvıyı, somatik hücreleri ve olgunlaşmamış oositleri IVF prosedürlerinden izole etmek ve işlemek için standartlaştırılmış yöntemleri özetlemekte ve yüksek kaliteli moleküler ve hücresel analizlere olanak sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, tipik olarak klinik bakımda atılan materyalleri kullanarak doğurganlık, üreme yaşlanması ve yumurtalık disfonksiyonuna ilişkin translasyonel araştırmaları destekler.

İn Vitro Fertilizasyon Uygulanan Bireylerden İnsan Foliküler Sıvısı, Folikül Somatik Hücreleri ve Olgunlaşmamış Oositlerin Toplanması

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Burada Nükleolar organizasyon dayalı fare antral oosit karakterizasyonu için bir protokol mevcut.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin olgunlaşmamış kedi oositlerinin minimum hacim vitrifikasyonu yöntemini. Bu protokol, üreme biyolojisi ve biyolojik çeşitliliğin korunması için laboratuvar ortamında hazırlanan çözeltilerle uygulanır.

Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu

Daha fazla video keşfet