Name: Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin otomatik kültür ve nöronal farklılaşma prosedürlerini. Bu yöntem, yüksek fenotipik tekrarlanabilirlik sağlayarak nörobilim araştırmalarında ve ilaç geliştirmede kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle bu çalışma için biyomalzeme katkıda bulunan hasta ve ailelerini kabul. Çalışmada kullanılan hücre hatları Rutgers ile NINDS koleksiyonundan (ND41865 iPS # 1 olarak) ve Dr Tilo Kunath (iPS # 2) laboratuarı ndan edildi. Bu çalışma kısmen NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, AB Ortak Programı - Nörodejeneratif Hastalık Araştırma (JPND) (PH) tarafından desteklenmiştir; DZNE I2A girişimi (AD); PD-Strat, bir ERA-Net ERACoSysMed finanse edilen proje (PH) ve Parkinson Hastalığı için Temel Veri Girişimi (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD, Michael J. Fox Vakfı'nın PD'ye giden yolu programının bir parçasıdır. Yazarlar Steven Finkbeiner ve Melanie Cobb (Gladstone Enstitüleri) manuel mDA nöron farklılaşma protokolü ve Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) neurite outgrowth analiz kurulum yardım için kurulmasına katkıda bulunmak için teşekkür ederiz.

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li>
<li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177(2019).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+genes+to+gene+networks%3A+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li>
<li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li>
<li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647(2015).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).</li>
<li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+derivation%2C+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li>
<li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760(2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252(2013).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology%2C+autophagy%2C+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+%26+disease%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death & disease. 6, 1811(2015).</li>
<li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2%2B+Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li>
<li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Huntington%27s+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics%2C+Morphology%2C+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrimerBank%3A+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

HiPSC kültürünün standardizasyonu ve nöronal farklılaşma için entegre görüntüleme yeteneklerine sahip otomatik bir hücre kültür sistemi sıyoruz. Minimal kullanıcı müdahalesi nedeniyle, deneysel varyasyon farklılaşma sırasında hücresel fenotiplerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için düşüktür. Takvim tabanlı zamanlayıcı, deneylerin organizasyonunu ve paralelleştirilmesini destekler ve deneylerin gerçekleştirildiği anda yüksek derecede esneklik sağlar. Mevcut yöntemler kolayca uyarlanabilir ve mevcut yöntemlerin spektrumu artırılabilir. Ayrıca, bu sistemin esnekliğini ekleyerek çok sayıda sayma plakası biçimi kullanılabilir. CO2 kuluçka makinesi, robotik kol, parlak alan hücre sitometresi ve sıvı taşıma istasyonundan oluşan minimal sistem, akademik araştırma laboratuvarlarına uygun maliyetlerle hiPSC kültürü ve farklılaşması için gerekli temel birimi oluşturur. Otomatik hücre kültür sisteminin bileşiklerin, RNAi kütüphanelerinin veya CRISPR/Cas9 kütüphanelerinin depolanması için otomatik -20 °C depolama sistemiyle birleştirilmesi ve yüksek içerikli/yüksek iş itimatmikroskobunun entegrasyonu fenotipik taramaların gerçekleştirilmesini sağlar.
Mevcut çalışmada, otomatik hücre kültürü sistemi tek kullanımlık ipuçları kullanılan ve kültür medya rezervuar içine elle doldurulmuş, böylece medya değişiklikleri ve özellikle bir gecede diğer kültür süreçleri için sıvı işleme istasyonu kullanımını sınırlayan. Bu sınırlamayı aşmak için, yöntemler tek kullanımlık ipuçları yerine iğne kullanımına ayarlanabilir ve ortam hatları ile buzdolabında saklanan ortam torbaları arasında tüp bağlantıları yükledikten sonra, ortam rezervuarları ısıtıcı elemanları tarafından önceden ısıtılan taze ortamla otomatik olarak doldurulabilir. Bu, ipuçlarının, kültür ortamının ve rezervuar alışverişinin manuel olarak doldurulmasından kaynaklanan kullanıcı girişimlerini azaltacaktır.
Otomatik hücre kültürü sistemimiz çeşitli avantajlar sunar. Biri barkod takip sistemi. Sisteme yüklenen plakalar, yöntem infazı sırasında ve sonrasında numunelerin izlenmesine olanak tanıyan sistem tarafından okunan ve kaydedilen benzersiz bir barkod ile tanımlanır. Bir diğer avantajı da kullanıcıya özel projeler oluşturma olanağıdır. Burada, sisteme yüklenen kültür plakaları belirli bir projeye atanabilir ve gruplar halinde gruplandırılabilir. Toplu olarak yapılandırılmak, tek tek plakaların seçilmesine gerek olmadığından, belirli bir toplu işlemin tüm plakalarına aynı işlemin uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bir sıvı sınıf düzenleyici borulama hızı ve yüksekliği yanı sıra aspirasyon ve her sıvı transfer adımı için dağıtım parametrelerini ayarlamak için izin verir. Her işlem, belirli bir kültür veya deneme plakası için hangi görevlerin gerçekleştirildiği retrace izin günlük dosyalarında belgelenir.
Nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen diğer hücre tipleri (hiPSC) kişiselleştirilmiş ilaç taramaları için imkanı sunan belirli hasta popülasyonlarında nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları (örneğin Parkinson hastalığı için dopaminerjik nöronlar) çalışma için in vitro araçlar yararlıdır. HiPSC'nin culturing çok zaman yoğun ve genellikle düşük ölçekli üretim ile sınırlı karmaşık farklılaşma protokolleri yürütmek için eğitimli insanlar gerektirir. HiPSC'nin besleyicisiz kültürünü otomatik bir kültüre uyarladık ve iki nöronal farklılaşma protokolü uyguladık, bir tet-on organizatörü 10altındaNGN2 aşırı ekspresyonuna dayalı hızlı bir kortikal nöron farklılaşma protokolü10,11, ve orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronların üretimi için uzun vadeli küçük molekül tabanlı protokol13. Manuel kültürün ve farklılaşma protokollerinin basit aktarımı ve tekrarlanabilirliği otomatik kültür sistemini çok kullanışlı hale getirir. Otomatik hücre kültür sisteminde kültüre giren insan iPSC tutarlı kök hücre morfolojisi gösterdi ve bağımsız deneyler arasında tekrarlanabilir önemli pluripotency belirteçleri ifade etti. Buna ek olarak, hiPSC kültür protokolünün otomasyonu, paralel olarak daha fazla sayıda hücre hattının kültürünü ve genişlemesini tercih etti. Kullanıcı laboratuvardayken gerçekleştirilen akış aşağı işlem adımları için (örn. hücrelerin hasat edilmesi veya farklılaştırmalar için manuel rekaplama) için gün boyunca sistemden tasarruf sağlayan bir gecede yapılması planlanan otomatik birleştirme kontrolleri. Kullanıcı tarafından tanımlanan birleştirme eşiğine ulaşılırken, hücreler otomatik hücre kültür sisteminin istifleyicisinde bulunan hücre dışı matris kaplı plakalara dönüştürülür ve doldurulır. Her pasaj yuvarlak yaklaşık 70 dakika sürer ve bir ana plaka, bir gün içinde 20 pasajlar kapasitesi anlamına gelir dört 1-iyi plakalar üretir.
NGN2 farklılaşma protokolünün otomasyonu başarılı bir şekilde yapıldı ve farklı pasajlar arasında homojen nöronal hücre popülasyonunun oluşmasına ve manuel farklılaşmalarla karşılaştırılabilir bir popülasyonun oluşmasına olanak sağladı. Ayrıca, birden fazla hücre hattı veya binlerce test koşulları/bileşikiçeren tarama deneylerini içeren büyük ölçekli tarama çalışmalarının deneysel maliyetleri, hızlı farklılaşmalar nedeniyle azalacaktır. Canlı hücre neurite outgrowth ölçümleri de dahil olmak üzere maliyet-etkin ve yüksek iş çıkışlı okumalar kolayca geliştirilebilir, uygulanabilir ve hastalık modelleme için henotypic okumalar olarak kullanılabilir, daha önce gösterildiği gibi14,15,16. Böylece NGN2 protokolünü, gfp'yi aşırı ifade eden küçük molekül türemiş nöral öncül (smNPC) hücreleri kullanarak da uyarladık. SmNPC hücreleri, kültür medyasıyla daha az maliyet (iPSC kültürüne sahip maliyetin üçte biri) ve deneyleri ölçeklendirmek için gereken süre dahil olmak üzere daha fazla avantaj sunar. SMNPC'den alınan hücre verimleri iPSC ile elde edilenden 7 ila 10 kat daha yüksektir. Ayırt edici nöronlar, manuel antikor boyamalarına veya kimyasal etiketlemeye ihtiyaç duymadan tam otomatik görüntüleme işlemi kullanılarak birkaç gün boyunca başarıyla izlendi ve görüntülendi, maliyetlerden ve tek başına görüntüleme de dahil olmak üzere manuel işlemler için gereken zamandan tasarruf edildi. 96 kuyulu bir plakanın iç 60 kuyunun mevcut görüntülemesi, kuyu başına 25 alan görüntülendiğinde plaka başına yaklaşık 16 dakika sürer, bu da 1000 bileşik için görüntüleme tabanlı tarama verilerinin bir günde elde edilip analiz edilebildiği anlamına gelir. Gelecekte, bu okuma nötrit büyüme kusurları nın kurtarılması için bileşik tarama çalışmalarında kullanılabilir.
Ayrıca, biz de iPSC orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlar üretmek için manuel bir diferansiyasyon protokolü transferi göstermektedir. Bu küçük molekül tabanlı farklılaşma protokolü 65 gün sürer ve birden fazla replating adımları ve sık medya değişiklikleri nedeniyle emek yoğun, çoğunlukla her 2 gün, aynı anda birkaç iPSC hatları için mDA nöronların üretimini sınırlar. Otomatik mDA farklılaştırma protokolü, düzinelerce iPSC satırına farklılaşmayı ölçeklendirme nin büyük avantajına sahiptir. 30 hücre hattına kadar paralel olarak ayırt edilebilir. Farklılaşma çoğunlukla medya değişikliklerine dayandığı için, neredeyse tüm farklılaşma süreci insan müdahalesi olmadan yürütülebilir. Otomatik sistemin takvim tabanlı zamanlayıcısı'nı kullanarak, ortam değişikliklerini farklılaşma adımlarına göre planlayabiliriz. Bu kadar çok sayıda hücre hattı ve kültür plakasıyla çalışmanın bir sınırlaması, bir gecede medya değişiklikleri gerçekleştirmek imkansızlıktı. Bunun temel nedeni, sistemimizin tek kullanımlık ipuçları nı kullanmak ve bu manuel adımı yürütmek için laboratuvarda bir kullanıcıgerektiren kültür ortamının manuel olarak doldurulması için kurulmuş olmasıdır. Ortam değiştirme işlemini kolaylaştırmak için, sisteme yüklenen plakalar bir projeye atanmış ve gruplar halinde gruplandırIlmiştir. Toplu iş boyutu daha sonra tek kullanımlık ipuçları ve mevcut kültür ortamının hacmi sayısına uyarlanmıştır. Yukarıda da belirtildiği gibi, bu sınırlama kolayca yeniden kullanılabilir / yıkanabilir iğneler ve medya otomatik dolum uygulanması ile aşılabilir. iPSC için gösterildiği gibi, hücrelerin otomatik geçişi/rekaplaması, otomatik hücre kültür sistemimiztarafından sunulan kolaylıklardan biridir. MDA nöronlarının otomatik rekaplamasını 25. Ancak, mDA nöronların ayrışması iPSC (8 dk) daha dissociation enzimi ile daha uzun (40 dk) kuluçka gerektirir hücre hatları başına 1 saat daha fazla otomatik replating süreci uzanan. Sonuç olarak, aynı gün içinde 30 hücre hattının otomatik rekaplaması imkansız hale geldi. Otomatik rekaplama (plakaların taşınması, pipetleme) sırasında diğer adımların hızlandırılmasını hızlandırmak ve sistemin bir gecede çalışmayı mümkün kılan iğne ve medya hattının kullanımına uyarlanması bu sınırlamayı çözecektir. Sakıncalarına rağmen, manuel protokolü önemli miktarda MAP2 (nöron) ve TH (mDA nöron) pozitif hücrelerle kültür üreten mDA nöronların otomatik bir farklılaşmasına başarıyla aktarabildik.
Düzinelerce iPSC hücre hattını paralel olarak ayırt etmek, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların moleküler mekanizmalarını araştıran projelerde büyük ilgi görüyor. Ancak, görevleri daha az hata ve daha düşük maliyetlerle daha hızlı tamamlamak büyük bir sorundur. Burada sunulan protokollerin otomasyonu (iPSC, smNPC ve mDA nöron) sayesinde, projelerimizde hızlanabilir, maliyetleri azaltabilir ve tekrarlanabilirliği artırabiliriz. FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) gibi yüzlerce hasta hücre hattını içeren projelerin geliştirilmesi, otomatik kültür ve farklılaşma protokollerine duyulan ihtiyacı göstermektedir. Gelecekteki bakış açılarımız manuel 3 boyutlu (3D) hücre kültürü modellerinin otomatik sisteme aktarılmasını içerir. Plaka tanım ayarlarındaki küçük uyarlamalar ve adaptörlerin kullanımı, 3B kültürler için gerekli olan ticari veya özel yapım plakaların ve mikroakışkan odaların kullanılmasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, otomatik bir etiketsiz görüntüleme modelinin uygulanması bize gerçek zamanlı olarak nöronal büyüme izlemek ve neurite outgrowth değişiklikleri çevirmek sağlayacak, nöron organizasyon ve hücre ölümü hastalık mekanizmaları daha iyi anlaşılması içine.

İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC) kendi kendini yenileyen ve hemen hemen her yetişkin hücre tipinde ayırt edebilirsiniz. Bu özellikler hiPSC temel araştırma ve ilaç keşif1hastalık modelleme için yararlı bir araç olun. İnsan iPSC en çok etkilenen / hastalık ders dahil hastalık ile ilgili hücre tipleri türetilmesi sağlayan donör genetik arka plan korur, örneğin, nörodejeneratif hastalıklar için farklı nöronal alt tipleri2,3. Ayrıca, hiPSC bir insan bağlamında ve fizyolojik protein ekspresyonu düzeyleri hastalıkları modelleyerek hayvan ve hücresel aşırı ekspresyon modellerinin bazı sınırlamalar üstesinden gelir ve monojenik arasında değişen hastalıkların modelleme değerli bir varlık olduğu kanıtlanmıştır, karmaşık ve epigenetik bozukluklar yanı sıra geç başlangıçlı hastalıklar4.
Bu avantajlara ve fırsatlara rağmen, hiPSC'nin çeşitli sınırlamalarının hala ele alınması gerekmektedir. Mevcut hiPSC kültürü ve farklılaşma protokolleri uygun maliyetli değildir, standartlaştırılması zordur ve emek yoğundur. Manuel kültür adımları, büyüme deki farklılıklar ve hiPSC'nin spontan farklılaşması nedeniyle verimve fenotiplerde yüksek değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, daha standart işleme teknikleri uygulanarak ve otomasyon5kullanılarak elde edilebilen protokolleri basitleştirerek deneyciye bağımlı varyasyonun azaltılması gerekmektedir. Otomatik hiPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin oluşturulması hem akademik hem de endüstriyel araştırma projeleri için ortak standartlar belirleyecek ve biyolojik olarak ilgili hastalık modellerinin ve daha tekrarlanabilir sonuçların oluşturulmasına olanak sağlayacaktır.
Önceki çalışma hiPSC kültürlerin otomasyon çalıştı6,7,8 ama protokolleri sisteme bağlı belirli hücre kültürü plaka biçimleri ile sınırlı ve farklı test biçimlerine adaptasyon yoksun. Bu tür sistemler hücrelerin şişirilmesinde yararlıdır, ancak istenilen hücre tipleri, hastalık fenotipleme ve tarama amaçlarına otomatik farklılaşma için uygun olmayabilir. Ayrıca, fibroblast türevi, hiPSC üretimi ve farklılaşması için büyük ölçekli bir otomatik platform9 tarif edilmiştir ama sadece çekici görünüyor ama birçok akademik laboratuvarlar için karşılanamaz olabilir hatların üretimine adanmış yüksek iş gücü laboratuvarları tarafından elde edilebilir bir ölçekte.
Yüksek Verimli Partikül Hava (HEPA) filtreli bir ortamda, büyük kapasiteli CO2 kuluçka makinesi, parlak alan görüntüleme sitometresi ve plaka taşıma için robotik bir kol ile birlikte sıvı taşıma istasyonuna dayalı tam otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik. Bu bileşenler kararlı ve tekrarlanabilir hiPSC kültürü ve farklılaşması için temel sağlar. Sistemi bileşik veya virüs depolama için otomatik -20 °C depolama sistemi ve yüksek hızlı dönen disk konfokal canlı hücre görüntüleyicisi ile tamamladık. Özel yapım protokoller otomatik hücre tohumlama, medya değişiklikleri, birleştirme kontrolleri, hücre genişletme ve numune tedavisi ve plaka görüntüleme ile test plakası üretimi, sistem yüksek içerik / yüksek iş letimatları ile uyumlu hale izin oluşturuldu. Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme sistemi, kontrol yazılımı ve özel yapım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kullanılarak işletilmektedir. GUI, kullanıcıların yöntem yürütülmesi için gereken hücre satırına özgü parametreleri içeren CSV dosyalarını almalarına olanak tanır. Ayrıca GUI, yerleşik takvim görünümünü kullanarak herhangi bir dizide çok sayıda deneme zamanlamasını sağlayarak her yöntemin başladığı zaman tam denetimini sağlar.
Otomatik hücre kültür sistemimiz, çeşitli plaka formatlarında (96-, 48-, 24-, 12-, 6- veya 1-well plaka formatında) kültür hücrelerine esneklik ile standartlaştırılmış pipetleme hızları, geçiş süreleri, birleştirme eşikleri, tohumlama yoğunlukları ve orta hacimler kullanır. Biz 6 gün içinde TUBB3 pozitif nöronlar verebilir nöronlar içine hiPSC dönüştürmek için yeni yayınlanan kısa vadeli farklılaşma protokolü uyarlanmış10,11. Ayrıca, ef1a promotörü12 ve iPSC altında GFP'yi orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlara dönüştüren ve 65 gün içinde mDA nöronlarını veren daha önce yayınlanmış çift SMAD inhibisyonu protokol13'ü uyarlayan nöronlara (smNPC) otomatik farklılaşma ve görüntüleme yi kurduk.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Dağıtıcı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< güçlü ></td> <td>< güçlü >Seyreltme< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü >iPSC pluripotens belirteci< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fare anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>1 ila 33</td></tr><tr><td>Tavşan anti-Oct3 / 4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>1 ila 200</td></tr><tr><td><güçlü>NGN2 nöron belirteçleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-TUBB3</td><td>R & D</td><td>MAB1195</td><td>1 ila 500</td></tr><tr><td>Tavşan anti-BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>1 ila 1.000</td></tr> <tr><td>< güçlü>mDA nöron belirteçleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tavuk anti-TH</td><td>Pel-Freez Biyolojikleri</td><td>12137</td><td>1 ila 750</td></tr><tr><td>Fare anti-MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>1 ila 750</td></tr> <tr><td>< güçlü > İkincil antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavuk IgY, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>1 ila 2.000</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1 ila 2.000</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>1 ila 2,000</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 ila 2,000</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 ila 2.000</td></tr><tr><td>Keçi tavşan önleyici IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>1 ila 2.000</td></tr> <tr><td><güçlü>Çekirdek karşı boyama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1 ila 8.000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Instruments</güçlü> </td><td>Distributor</td><td>Katalog Numarası</td><td>Tanım/Uygulama</strong</td></tr><tr><td>>Agilent TapeStation sistemi</td><td>Agilent teknolojileri</td> DNA ve RNA örnekleri için <td>4200</td><td>Otomatik elektroforez </td></tr><tr><td>Otomatik -20 &°; C depolama sistemi</td><td>Hamilton Storage Technologies</td><td>Örnek Erişim Yöneticisi (SAM -20C, 3200 serisi)</td><td>Reaktiflerin depolanması</td></tr><tr><td>Barkod okuyucu</td><td>Honeywell</td><td>Barkod Okuyucu Orbit</td><td>Barkod tarayıcı</td></tr><tr><td>Brightfield hücre sitomatı</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>Birleşme kontrolü ve hücre sayımı</td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager 7000</td><td>Hücre kültürleri için otomatik konfokal mikroskobu</td></tr><tr><td></td><td>Cytomat Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 24 C, CU</td><td>12 istifleyici aralığı 28 mm, 12 istifleyici aralığı 23 mm (toplam 456 plaka)Numunelerin</td></tr> <tr><td>çözülmesi için sitomat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU (Kurutma Ünitesi)</td><td>2 istifleyici aralığı 28 mm (toplam 42 plaka)</td></tr><tr><td>HEPA filtreler</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Hamilton Robotics tarafından modifiye</td>edilen <td>Hood Flow Star</td></tr> UV <tr><td>Sıvı işleme istasyonu</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab Star</td><td>Kanalları: 8x 1 ml, 4x 5 ml ve 96 Kanal MPH</td></tr><tr><td>Medya rezervuarı</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>Medya/reaktif rezervuarı</td></tr><tr><td>Saf su sistemi</td><td>Veolia Water</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td> iğne yıkama istasyonu için saf su sağlar</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>Gerçek zamanlı PCR makinesi</td></tr><tr><td>Robotik kol</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Rackrunner</td><td>Plakaların taşınması Tablayı</td></tr><tr><td>çevir</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Döner Tabla</td><td>Plaka oryantasyonunu ayarlayın</td></tr><tr><td>Kesintisiz güç kaynağı</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT Ünitesi, 10000 VA Güç besleme</td><td>Yedek güç kaynağı</td></tr><tr><td>VIAFLO-pipetler</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>Elektronik pipet</td></tr><tr><td>ViiA 7 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td> Gerçek zamanlı <td>PCR makinesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 4453545 Uygulanan Biyosistemler <tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td>güçlü<td><güçlü>Dağıtıcı</güçlü</td><td>>güçlü<güçlü>Katalog Numarası</güçlü><</td><td> güçlü>Notlar</güçlü></td></tr><tr><td>1 oyuklu kültür plakası (84 cm2)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları (9,6 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC kapaklı işlem görmüş</td></tr><tr><td>12 oyuklu kültür plakası (3,9 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC kapakla işlenmiş</td></tr><tr><td>96 oyuklu kültür plakası (0,32 cm2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96 Siyah</td></tr><tr><td>plaka Uçları, 50-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>50-uL uçlar</td></tr><tr><td>Uçlar, 300-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotik</td><td>235985</td><td>300-&mikro; L ipuçları</td></tr><tr><td>İpuçları, 1000-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotik</td><td>235939</td><td>1000-&mikro; L uçlar</td></tr><tr><td>Uçlar, 5 mL</td><td>Hamilton Robotics</td><td>184022</td><td>5 mL uçlar</td></tr><tr><td>Tüpler, 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>15 mL tüpler</td></tr><tr><td>Tüpler, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50 mL tüpler</td></tr><tr><td>Nalgene kriyojenik 2.0 mL şişeler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>Cryovials</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td>Distributor</td><td>Katalog Numarası</td><td>Notes</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Ron Weiss'tan nazik hediye</td></tr><tr><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td><td>Addgene</td><td>61474</td><td>Ron Weiss'tan nazik hediye</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Primers</güçlü></td><td><güçlü>Sıra (ileri)</güçlü></td><td><güçlü>Dizi (ters)</güçlü></td><td><güçlü>Kaynak<></td></tr><tr><td>güçlü<güçlü>iPSC çoğul gücü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4 (Kimlik: 4505967a1)</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NANOG (ID 153945815c3)</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>REX1 (ID 89179322c1)</td><td>AGAAACGGGCAAAGAAGAC</td><td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NGN2 nöronları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 (ID 87578393c1)</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td><td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>BRN2 (ID 380254475c1)</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td><td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>CUX2 (ID 291045458c2)</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td><td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td><td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td><td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td><td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>mDA nöronları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCGGACCAGGTGTA</td><td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td><td>NCBI PRIMER-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><<tr><td>strong>Housekeeping genleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td><td>NCBI astar-BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td><td>NCBI astar-BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTG</td><td>NCBI PRIMER-BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td><td>NCBI astar-BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Medya ve Reaktifler< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Dağıtıcı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Kullanım konsantrasyonu< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > Kaplama matrisi< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hücre dışı matris (Matrigel)</td> <td>Corning</td><td>354277</td><td>10 &; g / mL</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>2 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td><güçlü>Kültür ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPSC kültür ortamı (Temel 8 Flex ortam)</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>NGN2 nöronları - NGN2 orta</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0.909 mL (50 & mikro; M)</td></tr> <tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (% 1)</td></tr> <tr><td>DMEM / F-12, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484.75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr> <tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>0.25 mL (2.5 ve mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (% 0.5)</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (% 0.5)</td></tr> <tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td><güçlü>mDA nöronlar - SRM orta< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td></td><td>21985023 0.5 mL (55 &mikro; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Nakavt DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409.5 mL</td></tr><tr><td>Nakavt serum replasmanı (serum replasmanı)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 mL (% 15)</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (% 1)</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (% 1)</td></tr> <tr><td>< güçlü > mDA nöronları - N2 orta< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (% 2)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr> <tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td></td><td>17502048 5 mL (% 1)</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td></td><td>21103049 475 mL</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (% 1)</td></tr> <tr><td>< güçlü > mDA nöronları - Farklılaşma ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (% 2)</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (% 1)</td></tr> <tr><td><güçlü > NGN2 nöronları - Takviyeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Doksisilin (dox)</td> <td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2.5 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat magnezyum (AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>Nörotrofik faktör-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Purmorfamin (PMA)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>0.5 &mu; M</td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Sigma</td><td>P8833-10MG</td><td>0.5 & mu; g / mL</td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Merk Millipore</td><td>420220-10MG</td><td>2 & mu; M</td></tr><tr><td>mDA nöronları - Takviyeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>3 &mu; M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Cayman</td><td>13197</td><td>10 ve mikro; M</td></tr><tr><td>Dibutiril-cAMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1</td></tr><tr><td>mM Fibroblast Büyüme Faktörü 8B (FGF-8b)</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>L-askorbik asit (AA1)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0.2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189 (LDN)</td><td>Cayman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorfamin (Purm)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>2 & mu; M</td></tr><tr><td>Sonic Kirpi/Şş (C24II) N-Terminali (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>SB431542 (SB)</td><td>Cayman</td><td>13031</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Dönüştürücü Büyüme Faktörü tipi &szlig; 3 (TGF&szlig; 3)</td> <td>R ve Ge D</td><td>243-B3</td><td>1 ng/mL</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Cayman</td><td>10005583</td><td>10 ve mikro; M</td></tr><tr><td><güçlü>ayrışma reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek hücreli ayrışma reaktifi (StemPro Accutase)</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td><güçlü>RNA izolasyonu ve cDNA kiti</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA izolasyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>RNA lizis tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Trizol lizis tamponu (RNA lizis tamponu)</td></tr><tr><td>Ters transkriptaz (kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III Ters Transkriptaz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yazılım</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Tanım/Uygulama</td></tr><tr><td>Cell Culture Framework (CCF) (Grafik kullanıcı arayüzü, GUI)</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Otomatik sistem için</td><td>özel yapım</td> Kullanıcı arayüzü</tr><tr><td>CellPathFinder yazılımı (görüntü analiz yazılımı 1)</td><td>Yokogawa</td><td>CellPathFinder HCS Yazılımı</td><td>Görüntü analiz aracı</td></tr><tr><td>CellVoyager Ölçüm Sistemi</td><td>Yokogawa</td><td>Şunlarla birlikte verilir CellVoyager 7000</td><td>Mikroskop kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>Columbus yazılımı (görüntü analiz yazılımı 2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Görüntü analiz aracı</td></tr><tr><td>Bulut tabanlı qPCR uygulaması</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Themo Fisher bulut</td><td>qRT-PCR verileri Venüs için analiz yazılımı</td></tr><tr><td> yazılım</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Yazılım</td><td> otomatik sistem için kontrol yazılımı</td></tr></tbody></table>

entegre canlı hücre İzleme ile İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal ve dopaminerjik nöronların otomatik Üretimi

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) manuel kültür ve farklılaşma protokolleri standartlaştırmak, yüksek değişkenlik göstermek ve istenmeyen hücre tiplerine spontan farklılaşmayatkındır. Yöntemler emek yoğundur ve büyük ölçekli deneylere kolayca uygun değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, yüksek iş letimatif görüntüleme sistemiyle birleşen otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik ve paralel ve nöronal farklılaşmada birden fazla hiPSC hattını korumak için protokoller uyguladık. 6\u20128 gün içinde hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar üretmek için Neurogenin-2 (NGN2) aşırı ekspresyonu kullanarak kısa süreli bir farklılaşma protokolünün otomasyonunu ve 65 gün içinde hiPSC kaynaklı orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronları üretmek için uzun vadeli bir ayırım protokolünün uygulanmasını tanımladık. Ayrıca, GFP lentivirus ile transekküçük bir molekül türevi nöral öncül hücrelere (smNPC) NGN2 yaklaşımını uyguladık ve canlı hücre otomatik neurite outgrowth testi oluşturduk. Rutin hiPSC kültürüne ve kortikal ve dopaminerjik nöronlara farklılaşmaya uygun protokollere sahip otomatik bir sistem salıyoruz. Platformumuz, yeni hastalık mekanizmalarını ve ilaç hedeflerini belirlemek için uzun vadeli eller serbest kültür ve yüksek içerikli/yüksek içerikli hiPSC tabanlı bileşik, RNAi ve CRISPR/Cas9 gösterimleri için uygundur.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Bu çalışmanın genel amacı, insan IPS hücrelerinin nöronal soylara dönüştürülmesi ve farklılaştırılması için otomatik prosedürlerin nasıl uygulanacağını ve bunların otomatik görüntülemesini göstermektir. Standartlaştırılmış otomatik prosedürler, yüksek henotypik tekrarlanabilirlik sağlarken düşük deneysel varyasyon sağlar. Buna ek olarak, sistem yeni protokollerin geliştirilmesi için uyarlanabilir.Prosedürleri gösteren joachim Tager ve Elisangela Bressan, laboratuarımızdan post-docs olacaktır. Otomatik sistemin grafik kullanıcı arabiriminde, kaynak enstrüman ı işlem görünümünü tıklatın ve kaynak enstrümanı işlemini seçin. Çalıştır enstrüman işlemini tıklatın ve çalıştırılaç HEPA başlık ve yeniden yükleme işlemlerini çalıştırın.Yüklenecek kaynakları seçin, kapıyı açın ve hücre kültür plakalarını ve tek kullanımlık ipuçlarını açılır görüntülerde belirtildiği gibi uygun konumlara yükleyin. Daha sonra kapanmadan önce kapıyı %70 etanol ile dezenfekte edin ve dekontaminasyon işlemini çalıştırın. Sistem 30 dakika boyunca UV radyasyonu ile sterilize edilecektir.Plakaları kültür ortamı veya dissosiasyon reaktifi ile yüklemek için, run HEPA başlık adımını uygulayın ve sıvı taşıma istasyonunun kapısını açın. %70 etanol ile dekontaminasyondan sonra, rezervuarları güverteye atanan konuma yerleştirin ve kapağını kapatın. Sıvı işleme istasyonunun kapısını kapatın ve HEPA kaputunu kapatmak için InitHepaHood kaynak enstrümanı işlemini çalıştırın.Otomatik bir kültür yöntemini yürütmek için, grafik kullanıcı arabiriminin takvim görünümünde, işlem adımı ekle'yi tıklatın ve denemede kullanılacak hücre satırını seçin. Projeyi seçmek ve kullanılacak toplu işlemi işaretlemek için sihirbazı kullanın. Sağdaki ok ucuna tıklayın ve yürütülecek işlem adımını seçmek için sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin.Sihirbazın son sayfasında, denemeyi zamanlayın ve yöntemi çalıştırmak için gerekli uygun parametreleri ayrıntıları değişkenlerini ayarlayın. Ardından Tamam'ı tıklatın. 50 mililitrelik bir tüpü insan IPS hücre süspansiyonu ile yükledikten sonra, raftaki hücreleri almak için kaplamalı kültür plakaları yükleyin ve tüpler yönteminden plakaların tohumlama yürütmek. Brightfield görüntüleme sitometresindeki hücreleri saymak için, güvertede hücre süspansiyonu olan 384 kuyulu bir sayma plakası otomatik olarak hazırlayın ve 384 kuyudaki sayma plakasını güverteden Brightfield görüntüleme sitometresine aktarmak için robotik kolu kullanın.Sayım dan sonra, sistem plakayı orijinal konumuna döndürecek ve kaplamalı bir kültür veya istinat plakasını raftan pipetleme güvertesine aktaracaktır. Sistem daha sonra hücreleri kullanıcı tarafından tanımlanan sayı ve hacimlerde plakaya uygun olarak tohumlayacak ve pipetleme ile karıştıracaktır. Tohumlamadan sonra, plaka karbondioksit kuvöze aktarılmadan önce hücre dağıtımı için dakikada 500 devirde 10 saniye boyunca güvertede çalkalayıcıya taşınır.Otomatik birleşimi değerlendirmek için, denetim birleştirme yöntemini uygulayın ve en az bir kültür plakası ve hiçbir deneme plakası içeren bir toplu iş seçin. Parametreler ayrıntı bölümünde, görüntüleme analizi ayarlarına görüntü edinme için iPSCf_2020 girin. Sistem daha sonra ilk plakayı kuvözden Brightfield görüntüleme sitometresine aktaracak ve hücre birleşimini görüntüleyecek.Hücre kültürünü veya test plakası ortamını değiştirmek için, kültür plakaları yönteminin ortam değişikliğini uygulayın ve yalnızca kültür plakaları içeren bir toplu iş seçin. Sistem plakaları güverteye aktaracak ve plakaları yatıracak ve süpernatantın aspirasyonuna izin verecek. Supernatant atık toplama modülüne atılır ve uçları atılır ve her plakaya 12 mililitre taze ortam eklenecektir.Sistem daha sonra plakaları yeniden kapatacak ve plakaları hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürecek. Alternatif olarak, test plakalarının ortasını değiştirmek için, test plakaları yönteminin ortam değişimini gerçekleştirin. Hücreleri alt işlemek için, yapışık hücrelerin alt ekimi yöntemini uygulayın ve alt ekimi gereken kültür plakalarını içeren toplu işlemi seçin.Orta attıktan sonra, sistem hücrelere 0.5 milimolar EDTA sekiz mililitre eklemeden önce plaka başına pbs sekiz mililitre ile bir kez hücreleri yıkayın. Eğilme seçeneği ile güvertede sekiz dakika sonra, EDTA plaka başına taze orta 12 mililitre ile değiştirilecektir. Sistem, kolonileri 50 ila 80 mikron kümelere ayırmak için beş döngü boruyla hücreleri üçe ayırmadan önce kolonileri yerinden çıkarmak için dakikada 2,000 devirde plakaları sallayacak.Hücreler daha sonra bir-yedi bölünmüş oranda tohumlama önce güvertede 50 mililitrelik tüp aktarılacaktır. Otomatik yüksek içerik, yüksek iş grubu hücre görüntüleme için görüntüleme yöntemini uygulayın ve en az bir test plakası ve kültür plakası içermeyen bir toplu iş seçin. Sistem daha sonra görüntüleme için otomatik konfokal mikroskoba bir araştırma plakası aktaracaktır.Gerekli işlem adımlarını gerçekleştirirken doğru toplu iş ve plaka adlarını seçtiğinizden emin olun. HiPSC kültürleri büyüme için günlük olarak izlenmeli ve Brightfield görüntüleme sitometresinde biraraya gelen yüzdeleri için analiz edilmelidir. Passaging ve manuel veya otomatik sistem kültürü sonra, hücreler tipik bir kök hücre ve pluripotency marker ekspresyonu sergiler.Otomatik kültür sisteminde farklılaşan nöronlar, manuel olarak yetiştirilen nöronlara benzer morfoloji ve nöronal ağ organizasyonu gösterir. Altı günlük farklılaşmadan sonra, otomatik olarak diferansiye kortikal nöronlar nörona özgü sınıf III beta-tübulin ve üst kortikal tabaka belirteç ekspresyonu için pozitiftir. Sekiz gün sonra, hücreler de mikrotübül ilişkili protein ifade 2, nöral hücre adezyon molekülü, ve sinapsin I, yanı sıra kortikal nöron belirteçleri.HiPSC'de bu belirteçlerin çok düşük veya hiç ekspresyonu gözlenmez. Bu sistem aynı zamanda manuel müdahale olmadan farklılaşma 11 gün boyunca ölçülebilir neurite uzunlukları sağlayan bir canlı hücre otomatik neurite outgrowth çıkış tsay kurmak için kullanılabilir. 65 günlük bir kültür döneminde orta değişiklikler gerçekleştirmek için otomatik kültür sisteminin kullanılması beklenen hücresel organizasyon ve morfoloji ile orta beyin dopaminerjik nöronlar içine hiPSC farklılaşmasını kolaylaştırır.Nötrit çıkıntısına ek olarak, nörodejenerasyonu incelemek le ilgili diğer otomatik henotik tahliller, örneğin, TDP-43 translokasyon RNA foci ve alfa-sinüklein fibril alımı, bu yüksek iş üretimi, yüksek içerik biçimi kullanılarak incelenebilir.

automated-production-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Bu video, insan nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) nöronlara ayırmak için bir yöntem göstermektedir. NPC'ler, yerleşik bir fare astrosit-sıçan kortikal nöron ko-kültürüne tanıtılır ve NPC'nin nöronlara farklılaşmasını teşvik eder. Farklılaşma, hücrelerin konfokal bir mikroskop altında görüntülenmesiyle doğrulanır.

İnsan Nöral Progenitör Hücrelerini Nöronlara Ayırmak İçin Bir Ko-Kültür Tekniği

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) uyarıcı kortikal nöronlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Doksisiklin indüksiyonu üzerine, hiPSC'ler nöral spesifik bir transkripsiyon faktörü olan nörogenin-2'yi aşırı eksprese eder. Bu süreç, belirli ortamlar kullanarak ve astrositlerle birlikte kültürlenerek, hiPSC'lerin sinaptik bağlantıları olan nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mikro Elektrot Dizileri Üzerinde Nöronlara Farklılaşması

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Mevcut pluripotent kök hücre (PSC)-fonksiyonel hücre farklılaşma sistemleri şu anda ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Burada, kardiyak farklılaşmayı ana örnek olarak kullanarak, görüntü tabanlı makine öğrenimine dayalı PSC farklılaşma sürecini akıllıca izlemek ve modüle etmek için bir protokol sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin otomatik kültür ve nöronal farklılaşma prosedürlerini. Bu yöntem, yüksek fenotipik tekrarlanabilirlik sağlayarak nörobilim araştırmalarında ve ilaç geliştirmede kullanılabilir.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi (Video) | JoVE Journal

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Daha fazla video keşfet