Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Çalışmalar, kraniyal yüz kemiğinden elde edilen BMSC'lerin aksiyel ve apendiküler kemiklerden daha üstün yetenekler sergilediğini göstermiştir. Bu nedenle, mandibular BMSC'ler, kraniyofasiyal hastalıkların gelecekteki terapötiklerini geliştirmek için tercih edilen kaynak olarak kabul edilmektedir. Bu protokol, kısa sürede önemli sayıda saflaştırılmış mandibular BMSC elde etmek için tüm kemik iliği aderansı ve floresan hücre sınıflandırmasının avantajlarını birleştirir.

Bu protokolü ilk kez deniyorsanız, sıçan mandibulasının anatomik yapısını ve fonksiyonel hareketini anlamanın çok önemli olduğunu düşünüyorum, bu da bu videoyu izleyerek veya ilgili literatürü okuyarak elde edilebilir. Fareye ötenazi yaptıktan sonra, sırtüstü pozisyonda temiz bir davlumbaz içine yerleştirin. Deri ve buccinator kaslarını bilateral angulus oris'ten mandibulanın arka bölgesine kadar kesin.

Mandibulaya bağlı olan mandibular dişleri ortaya çıkarmak için maksiller ve mandibular kesici dişleri her iki başparmağınızla ters yöne doğru iterek sıçanın ağzını açın. Bukkal kasları ve korakoidlere bağlı tendonları ve mandibulanın alt sınırını tamamen ayırın. Ardından mandibular arka dişlere bastırın ve her iki taraftaki kondiller net bir şekilde ortaya çıkana kadar geri ve aşağı doğru döndürün.

Mandibula gövdesini kafatasından ayırın ve kemik yüzeyindeki yapışık yumuşak dokuyu ıslak bir gazlı bez kullanarak temizleyin. Canlılığı korumak için kemiği önceden soğutulmuş minimum esansiyel orta alfa veya buz üzerinde PBS ile doldurulmuş 10 santimetrelik steril bir cam tabağa yerleştirin. Mandibular gövdeden birinci azı dişinin mesial kenarı boyunca ön kemiği kesin, ardından ilik boşluğunu ortaya çıkarmak için üçüncü azı dişinin distal kenarı boyunca korakoid ve kondil dahil olmak üzere mandibular ramusu çıkarın.

10 santimetre steril bir cam tabağı% 10 FBS ile 10 mililitre alfa-MEM ile doldurun. Ortamı 10 mililitrelik bir şırınga ile aspire edin, ardından iğneyi kemik iliği boşluğuna yerleştirin ve kemik iliğini tekrar tekrar tabağa yıkayın. Kemik beyazlaşana kadar kemik boşluğunu sırasıyla kemiğin hem mesial hem de distal tarafından en az üç kez yıkayın.

Yıkanmış hücreleri içeren ortamı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 800 RPM'de ve beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve% 10 FBS ile üç mililitre alfa-MEM ile hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 santimetrelik yeni bir kültür kabına koyun ve 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Kültür ortamını aspire edin ve tabağı PBS ile yıkayın. Tabağa iki mililitre% 0.25 EDTA ile% 0.02 tripsin ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için% 10 FBS ile dört mililitre alfa-MEM ekleyin.

Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra hücreleri 120 mikrolitre PBS'de% 10 FBS ile yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Hücre süspansiyonlarını CD16 ila CD32'ye karşı bir mikrolitre antikor ile dört santigrat derecede 15 dakika boyunca bloke edin ve hücreleri CD45'e karşı PE konjuge antikor, CD90'a karşı FITC konjuge antikor ve CD29'a karşı APC-antikoru ile boyayın, karanlıkta bir saat boyunca dört santigrat derecede. Diğer 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu lekelenmemiş negatif kontrol olarak kullanın. Tüpleri 800 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve% 10 FBS ile 0.5 mililitre PBS'de hücreleri yeniden süspanse edin. Analizden 10 dakika önce mililitre DAPI başına 10 mikrolitre 0.01 miligram ekleyin. Hücreleri filtrelemek için santrifüj tüplerine yerleştirilen 40 nanometre filtreleri kullanın, ardından hücreleri floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcıda analiz edin.

Önce DAPI negatif hücreleri geçitleyerek ölü hücreleri toplam hücre sayısından çıkarın, ardından seçilen hücrelerde hedeflenen mBMSC'ler olarak CD29 pozitif, CD90 pozitif, CD45 negatif için kapı açın. Sıralanan mBMSC'leri% 10FBS ile beş mililitre alfa-MEM içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Tüpleri 800 RPM'de beş dakika santrifüjleyin ve toplama tamponunu çıkarın.

Hücreleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre taze ortam ekleyin, ardından bunları altı santimetrelik bir kültür kabına koyun. Bu protokolü kullanarak, hücrelerin büyük bir kısmı ilk kültürden sonraki üçüncü gün plakaya yapıştı. Üç ila dört günlük ek bir kültürden sonra, hücre birleşmesi %70 ila 80'e ulaştı P0 hücrelerinde yaklaşık %81.1'lik bir paya sahip olan mBMSC'leri saflaştırmak için floresan hücre sıralaması kullanıldı.

P2 mBMSC'leri bir hafta boyunca altı oyuklu bir plakada kültürledikten sonra, önemli miktarda koloni oluşturan birimler gözlendi. mBMSC'lerin çok soylu farklılaşma yeteneğini değerlendirmek için, osteo-kondro ve adipo soylarına indüklendiler. ALP'nin artmış aktivitesi, alizarin kırmızı boyaması altında kırmızı kalsifik nodüller ve osteojenik spesifik genler Runx2, Alp, Bsp ve Ocn'nin artmış ekspresyonu osteojenik indüksiyonu gösterdi.

Adipogenezi tanımlamak için yağ-kırmızı-O boyaması kullanıldı. Dokuz günlük indüksiyondan sonra çok sayıda lipid açısından zengin vakuol belirgindi. Ayrıca, adipojenik spesifik genler Ppar-gamma-1 ve Cebpa'nın ekspresyonu artmıştır.

Numuneler, kondrojenik farklılaşmanın mikroskobik gözlemi sırasında Alcian mavisi için pozitif boyama gösterdi. Ek olarak, anti-tip II kollajen antikoru ile immün boyama, kıkırdak matrisi birikiminin arttığını gösterdi. Bu protokolde mBMSC'lerin yaşayabilirliğinin sağlanması çok önemlidir.

Bu amaca, uygun deney hayvanının seçilmesi, buz üzerinde çalışma yapılması ve deney süresinin kısaltılması ile ulaşılabilir. Bu in vitro modeli kullanarak, biyolojik özelliklerin incelenmesini, mikro çevreye müteakip reaksiyonu ve mandibular BMSC'lerin diğer uygulamalarını kolaylaştırabilecek çok sayıda proliferatif mandibular BMSC elde edilebilir.