İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti
8 Temmuz 2020
mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.
Bu yöntem, küçük bir hayvan modeli kullanarak IGA nefropatisindeki mikroRNA'ların değişimini kolayca doğrulamak için kullanılabilir ve bu da IGA nefropatisini insan böbrek biyopsisi olmadan incelemeyi mümkün kılar. Protokol, IGA nefropatisinin genetiği hakkında yeni bilgiler sağlayabilir ve bu da böbrek hastalığı için yeni tanısal ve yeni terapötik yöntemlerin keşfedilmesine potansiyel olarak yardımcı olabilir. Farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olduktan sonra, farenin karın duvarında üç ila dört santimetrelik bir orta hat kesisi yapmak ve böbreğin her iki tarafını tanımlamak için cerrahi makas ve forseps kullanın.
Kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaları ve diyaframı kesin. Sağ atriyumu kestikten sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönene kadar sol ventriküle PBS enjekte edin, bu da farenin tüm vücudunun PBS ile perfüze edildiğini gösterir. Renal arteri, renal veni ve üreteri kesin, ardından böbreği çıkarın.
30 miligramlık böbrek örneklerini bir silikon homojenizatör ve 700 mikrolitre fenol guanidin bazlı lizis reaktifi kullanarak oda sıcaklığında homojenize edin. Lizatı biyopolimer parçalama spin kolonuna aktarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 15.000 G'de santrifüjleyin. El yazması talimatlarını izleyerek RBNA saflaştırmasına devam edin.
Son yıkamadan sonra, silika membran bazlı spin kolonuna 30 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve RNA'yı elüte etmek için bir dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin. cDNA sentezi için, numune başına toplam sekiz mikrolitre olmak üzere iki mikrolitre nükleik asit karışımı, iki mikrolitre ters transkriptaz karışımı ve dört mikrolitre tampon içeren bir ana karışım hazırlayın. Sekiz oyuklu bir tüp şeridinin her bir oyuğuna sekiz mikrolitre ana karışım ekleyin.
Toplam RNA'yı nükleaz içermeyen suda seyreltin. Ardından, şeridin her bir oyuğuna 12 mikrolitre toplam RNA çözeltisi ekleyin. Numuneleri termosiklere yerleştirin ve 37 santigrat derecede 60 dakika, ardından 95 derecede beş dakika inkübe edin.
Kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için, ana karışımı el yazması talimatlara göre hazırlayın, ardından 96 oyuklu bir reaksiyon plakasının her bir oyuğuna 22,5 mikrolitre ana karışım ekleyin. Her oyuğa 2,5 mikrolitre hazırlanan cDNA ekleyin. Reaksiyon plakasını gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirin.
Ardından, 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ilk aktivasyon için programlayın, ardından 15 saniye boyunca 94 santigrat derecede 40 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 55 santigrat derecede tavlama ve 30 saniye boyunca 70 santigrat derecede uzatma için programlayın. Delta-delta CT yöntemini kullanarak gen ekspresyonunu ölçün. Bu protokol, Balb/c farelerinin böbreklerini kontrol olarak kullanarak HIGA farelerinin böbreklerindeki mikroRNA'ların ekspresyon seviyelerini araştırmak için kullanıldı.
Üç IGA nefropati ile ilişkili mikroRNA'nın ekspresyon seviyeleri ölçüldü. İki grubun nispi mikroRNA ekspresyon seviyeleri, 0.05'ten küçük bir P ile istatistiksel olarak anlamlı olan bir T-testi kullanılarak karşılaştırıldı. miR-155-5p, HIGA grubunda kontrol grubuna göre 3.3 kat daha yüksek seviyelerde eksprese edildi ve miR-21-5p, 1.58 kat daha yüksek seviyelerde eksprese edildi.
miR-1461-5p ekspresyonu iki grup arasında anlamlı farklılık göstermedi. Bu protokolü denerken, ortamdaki nükleazın deneyi etkilemesini önlemek için maske, eldiven ve bone takmak ve laboratuvar masasını ve aletlerini temiz tutmak önemlidir. Bu deneysel yöntem şu anda laboratuvarımızda pratik olarak kullanılmaktadır.
Amacı, İGA nefropatisi için yeni tanı ve tedavi yöntemleri oluşturmaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir IgA nefropatisi fare modelinin böbreklerinde mikroRNA ekspresyon seviyelerinin saptanması için güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, insan böbrek biyopsilerine gerek kalmadan mikroRNA'ların IgA nefropatisindeki rolünün araştırılmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nefroloji
- MikroRNA araştırmaları
- Hayvan modelleri
Arka Plan
- IgA nefropatisi, glomerüllerde IgA birikimi ile karakterize bir böbrek hastalığıdır.
- MikroRNA'lar, böbrek bozuklukları da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynar.
- MikroRNA ekspresyonunun anlaşılması, hastalık mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- MikroRNA'ların incelenmesi için kullanılan mevcut yöntemler genellikle invaziv prosedürler gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- IgA nefropatisi fare modelinde microRNA seviyelerini değerlendirmek için bir yöntem geliştirmek.
- IgA nefropatisinin genetik yönleri üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmak.
- Böbrek hastalıkları için potansiyel tanısal ve terapötik yaklaşımları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- IgA nefropatisi için bir model olarak HIGA farelerin kullanımı.
- Cerrahi işlem öncesinde fareye anestezinin uygulanması.
- Midline insizyon ve organ çıkarımı dahil olmak üzere, böbreklere erişim için cerrahi teknikler.
- Böbrek ekstraksiyonuna hazırlık amacıyla farenin PBS ile perfüzyonu.
Ana Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, IgA nefropatisindeki mikroRNA değişikliklerinin kolayca doğrulanmasına olanak tanır.
- Bu yöntemden elde edilen içgörüler, yeni tanı araçlarının geliştirilmesine yol açabilir.
- IgA nefropatisinin tedavisi için yeni terapötik stratejiler keşfetme potansiyeli.
- Ön çalışmalarda insan böbrek biyopsisi ihtiyacının ortadan kaldırılması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, IgA nefropatisinde microRNA rolünün anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Böbrek hastalığı genetiği araştırmaları için yeni yollar açmaktadır.
- Bu yaklaşım, gelecekteki tanısal ve terapötik gelişmeleri önemli ölçüde etkileyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Bu protokol, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin valide edilmiş bir IgA nefropatisi fare modelinde mikroRNA ekspresyonunu profilleyebilmesini sağlayarak, böbrek hastalığı programlarında hedef validasyonunu ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. İnsan biyopsilerine gerek kalmadan değişmiş miRNA seviyelerini tespit etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunarak, geliştirilmiş öngörü güveni ile biyobelirteçlerin ve terapötik hedeflerin erken keşfini kolaylaştırır. Bu yaklaşım, hastalık mekanizmalarını sorgulamaya ve preklinik geliştirme için adayları önceliklendirmeye yönelik keşif aşaması çalışmalarıyla uyumludur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: HIGA farelerinde kontrol grubuna kıyasla hastalıkla ilişkili miRNA ekspresyon değişikliklerini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: miR-155-5p, miR-21-5p ve miR-146a-5p seviyelerini ölçmek için qRT-PCR kullanarak fonksiyonel hedef doğrulaması için güvenilir bir iş akışı sunar.
- Öngörücü Değer: İstatistiksel olarak anlamlı katlanım değişimleri gösteren (örneğin, miR-155-5p için 3,3 kat) miRNA'ları potansiyel biyobelirteçler veya hedefler olarak belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Keşif tarama kampanyalarında analiz standardizasyonuna uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir miRNA ekspresyon verileri sağlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli qRT-PCR platformlarıyla uyumlu, standardize edilmiş bir RNA saflaştırma ve cDNA sentez protokolü oluşturur.
- Analiz Hazırlığı: Delta-delta CT yöntemini kullanarak normalize edilmiş CT değerleri üretir, böylece örnekler arası karşılaştırma ve hit onayı yapılabilmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Keşif bulgularını, miRNA aracılı yolakların preklinik doğrulamasıyla ilişkilendirmek için hastalıkla ilgili bir HIGA fare modeli kullanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: IgA birikimiyle bağlantılı miRNA ekspresyon değişikliklerinin değerlendirilmesine olanak tanıyarak, aday belirleme öncesinde hedef mekanizmadaki belirsizliği azaltır.
- Preklinik Süreklilik: Çalışma grupları genelinde böbrek dokusundan tutarlı ve ölçülebilir veriler sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamada hipotez testlerini destekleyerek ve ön madde belirleme kararlarına temel teşkil eden tarama ve analiz iş akışları için kantitatif çıktılar üreterek erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik bir fare modelinde IgA nefropati patogenezi ile ilişkili miRNA ekspresyon değişimlerini ölçerek yolakların netleştirilmesini sağlar.
- Tarama: Sonraki aşamadaki analizlerde bileşiklerin hedef yolaklar üzerindeki etkilerini değerlendirmeye uygun, standartlaştırılmış ve kantitatif miRNA verileri üretir.
- Analitikler: Ekiplerin koşulları karşılaştırmasına ve T-testleri kullanarak istatistiksel anlamlılığı değerlendirmesine olanak tanıyan delta-delta CT değerleri ve kat değişimi (fold-change) metrikleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Fenotipik öneme sahip, valide edilmiş bir IgA nefropati modeli kullanarak keşif aşamasındaki miRNA bulgularını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Böbrek hastalığı projeleri genelinde birden fazla miRNA hedefi için uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR protokolü oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bir hastalık modelinde miRNA disregülasyonunun doğrudan ölçümü yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış RNA saflaştırma, cDNA sentezi ve qRT-PCR parametreleri (örneğin, 8,000 G santrifüjasyon, 37°C inkübasyon) aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü hastalık ilişkisi olan hedefleri önceliklendirmek için istatistiksel olarak anlamlı ekspresyon verileri (p<0.05) sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Katlanım değişimi (fold-change) büyüklüğü ve tekrarlanabilirlik temelinde, miRNA tabanlı biyobelirteçlerin veya terapötik hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Nükleaz degradasyonunu önlemek ve örnek bütünlüğünü sağlamak için kemirgen cerrahisi, RNA işlemi ve qRT-PCR konularında uzmanlık gerektirir.
- Homojenizasyon ekipmanına, santrifüje, termosiklere ve floresans deteksiyonlu gerçek zamanlı PCR cihazına erişime bağlıdır.
- RNA girdisi (30 mg böbrek), reaktif hacimleri (700 μL liziz reaktifi) ve döngü koşulları (95°C aktivasyon, 40 döngü) için ekipler arasında standardizasyon gereklidir.
- Tutarlı tavlama (55°C) ve uzama (70°C) sıcaklıklarını korurken, spesifik miRNA hedefleri için primer setlerinin adaptasyonunu gerektirir.
- Uç nokta RNA analizi ile sınırlıdır; ek metodolojiler olmadan böbrek dokusu içinde mekansal veya tek hücre çözünürlüğü sağlamaz.
