Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu protokol kullanılarak geliştirilen 3 boyutlu organoid kültürler distal akciğer epitelinde proksimaldir. Akciğer dokusu bakımının veya hastalıkla ilişkili yeniden şekillenmenin temel mekanizmalarını incelemek için izlenebilir bir model sağlayın ve ilaç keşfi ve validasyonu için etkili bir platform sunar. Bu protokol diğer doku ayrışması hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları ile uyumludur.

Epitelyal progenitör hücreler farklı anatomik kompartmanlardan izole edildiğinden, in vitro olarak pozisyonel kimliklerini koruduklarından, ekzojen veya endojen uyaranlara akciğer yanıtlarındaki bölgesel farklılıkları modellemek için kullanılabilir. Bu seviye tekniği, orijin bölgesini temsil eden uzman diferansiyel dölleri elde etmek için kültürlenebilen bölgeye özgü progenitör hücreler de dahil olmak üzere epitel hücrelerinin farklı alt popülasyonunun izolasyonu için kullanılabilir. Akciğer dokusunu aldıktan sonra, proksimal trakea ve bronşları, çapı iki milimetre veya daha az olan küçük hava yolları içeren distal akciğer epitelinden ve çevresindeki parankimal dokudan ayırın.

Numuneleri ayrı ayrı steril 150 x 15 milimetre Petri kaplarına yerleştirin ve distal doku numunesini yaklaşık bir santimetre küp küp parçalar halinde doğrayın. Parçaları 50 milimetrelik temiz bir tüpe yerleştirin ve dokuları yıkama başına taze soğutulmuş HBSS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, dokuları yeni bir Petri kabına aktarın ve parçaları steril tüy bırakmayan mendillerle kurulayın.

Ardından, dokuları yaklaşık iki milimetre çapında parçalara ayırmadan önce mümkün olduğunca fazla viseral plevrayı çıkarmak için forseps ve makas kullanın. Doku parçası sindirimi için, 50 mililitrelik konik bir tüpte 25 mililitre steril HBSS'ye mililitre liberaz başına 50 mikrogram ve mililitre DNA başına 25 mikrogram ekleyin. Ve tüpe yaklaşık iki ila üç gram kıyma dokusu ekleyin.

Daha sonra dokuları 40 ila 60 dakika boyunca dakikada 900 devirde sürekli çalkalayarak 37 santigrat dereceye yerleştirin. 30 dakika sonra, topak oluşumunu önlemek için sindirilmiş dokuyu ezmek için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. İnkübasyonun sonunda, dokuyu beş kez ezmek için 16 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, süspansiyonu belirtildiği gibi vakum basıncı altında bir dizi hücre süzgecinden geçirmek için geniş delikli bir pipet kullanın. Kalan hücreleri toplamak için son süzgeci 20 mililitre HBSS plus ile yıkadıktan sonra, izole edilen hücreleri toplamak için filtratları santrifüjleyin. Süpernatanları attıktan sonra, hücreleri bir dakika buz yapmak için inkübe etmeden önce hafif pipetleme ile peletlere bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, lizisi nötralize etmek ve kalan hücreleri santrifüjleme ile toplamak için 10 ila 20 mililitre HBSS artı tampon ekleyin. Monoklonal anti-insan CD31 ve CD45 antikoruna konjuge CD31 ve CD45 mikroboncukları ve LS Kolonlarını kullanarak toplam hücre havuzundan CD31 pozitif endotel hücrelerini ve CD45 pozitif bağışıklık hücrelerini üreticinin protokolüne uygun olarak tüketin. FACS için hücre yüzeyi boyama için, gerekli konsantrasyonda uygun primer antikorları ekleyin ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri üç mililitre HBSS plus ile yıkayın ve hücreleri, uygun şekilde buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için uygun konsantrasyonda florofor konjuge ikincil antikor ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri üç mililitre HBSS plus ile yıkayın ve hücreleri bir süzgeç kapağından beş mililitre polistiren tüplere süzmeden önce mililitre HBSS artı konsantrasyonu başına 10 ila yedinci hücrede bir kez yeniden süspanse edin tek bir hücre süspansiyonunun oluşumunu sağlamak için. Daha sonra geçirgen hücreleri lekelemek için mililitre DAPI başına bir mikrogram ekleyin.

Proksimal doku epitelyal progenitör hücre zenginleştirmesi için, proksimal hava yollarını akciğerlerden ayırın ve lümeni ortaya çıkarmak için hava yollarını uzunlukları boyunca açmak için makas kullanın. Bir karıştırıcı üzerinde sürekli çalkalayarak 37 santigrat derecede 20 dakikalık inkübasyon için dokuları mililitre liberaz başına 50 mikrogram ile kaplayın. İnkübasyonun sonunda, dokuyu steril 150 x 15 milimetrelik bir tabağa aktarın ve luminal epitel hücrelerini dokudan tamamen çıkarmak için hava yolu yüzeyini nazikçe kazımak için bir neşter kullanın.

Daha sonra, yerinden çıkan tüm luminal epitel hücrelerini toplamak ve hücreleri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarmak için kabı beş mililitre steril HBSS artı tampon ile yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanarak süspansiyonu art arda beş kez ezin. Daha sonra süspansiyonu santrifüjleme ile toplayın.

Daha sonra peleti taze HBSS ve buz üzerinde tampon içinde yeniden süspanse edin. Küçük doku şeritleri oluşturmak için kalan trakeobronşiyal dokuyu halkaları boyunca kesmek için makas kullanın. Yeni bir tabakta, şeritleri daha küçük parçalara ayırmak için tek taraflı bir tıraş bıçağı kullanın ve doku parçalarını tüp başına iki mililitre liferaz içeren C tüplerine aktarın.

Ardından, dokuyu mekanik olarak daha fazla ayırmak için bir gentleMACS otomatik ayrıştırıcıda insan akciğer protokolü iki'yi kullanın. Ayrışmanın sonunda, yaklaşık iki gram kıyılmış proksimal dokuyu, mililitre liferaz başına 50 mikrogram ve mililitre DNA çözeltisi başına 25 mikrogram içeren 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Çalkalama ile 37 santigrat derecede 45 dakikalık bir inkübasyonun sonunda, doku bulamacını distal akciğer dokusu için gösterildiği gibi bir dizi süzgeçten süzün ve sindirimi durdurmak için süzüntüye eşit hacimde HBSS artı tampon ekleyin.

İzole edilmiş luminal proksimal hava yolu hücrelerini tüpe ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücreler daha sonra mikroboncuk izolasyonu ile zenginleştirilebilir ve distal akciğer dokusu hücreleri için gösterildiği gibi ilgilenilen hücre yüzeyi belirteçleri için boyanabilir. Psödostratifiye bir epitel ile kaplı proksimal hava yolları, membran proteini NGFR için immünoreaktif olan bol miktarda bazal progenitör hücreleri içerir.

Buna karşılık, alveolleri kaplayan epitel hücreleri, alveolar tip II hücre kimliklerini düşündüren HTII-280 monoklonal antikoru ile apikal membran immünoreaktivitesi gösteren bir alt küme içerir. Kirletici kırmızı kan, bağışıklık ve endotel hücrelerinin manyetik boncuk tükenmesi, hem distal hem de proksimal doku örneklerinde epitel hücre popülasyonlarının önemli ölçüde zenginleşmesine ve buna karşılık gelen FACS verimliliğinde artışlara neden olur. Daha fazla FACS tükenmesi, NGFR veya HTII-280 yüzey boyamalarına dayalı olarak ek olarak fraksiyonlanabilen yüksek oranda zenginleştirilmiş distal hücre popülasyonlarına yol açar.

HTII-280 pozitif distal akciğer epitel hücre kültürleri, ortalama %10'luk bir koloni oluşturma etkinliği ile hızla genişleyen organoidler verir30. gün kültürlerinin immünofloresan boyama, lümen içeren organoidlerin ağırlıklı olarak HTII-280 ve SPC pozitif distal akciğer epitel hücrelerinden oluştuğunu ortaya koymaktadır. NGFR pozitif hücrelerden kültürlenen proksimal akciğer epitelyal organoidleri, kültürün 30. gününde ortalama %7.8'lik bir koloni oluşturma verimliliği ile lümen içeren organoidlerin oluşumuna neden olurEnzimatik doku ilişkisinin ampirik optimizasyonu, bölgeye özgü organize kültürlerin sonraki nesli için immünofloresan boyamaya ve canlı epitel hücre alt kümelerinin zenginleştirilmesine izin veren yüzey epitoplarının korunması için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, bağışıklık, vasküler, stromal ve epitel hücre alt kümelerinin tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve 3D organoid çip platformları kullanılarak ko-kültür modellerinin geliştirilmesi için uyarlanabilir.

Yakın zamanda, insan akciğer epitelinin SARS-CoV-2 enfeksiyonunu incelemek ve COVID-19 ilaç doğrulaması için bir platform olarak bu teknik kullanılarak üretilen alveolar organoidlerin kullanımını tanımladık.