CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması

Bu protokol, metalik yüzeylere terapötik peptidler eklemek için yeni bir kimyasal strateji içerir ve metalik biyomalzemelerin geniş bir yelpazede biyouyumluluğu artırmak için potansiyele sahiptir. Bu biyoimplantlar çıplak metal yüzeylere peptidler ve terapötik proteinler iklemek için evrensel ve sağlam bir tekniktir. Biz stent tarafından tetiklenen inflamasyon yanıtları önlemek için CD47 peptidler ekleyerek metalik stent biyouyumluluğunu artırmak için bu teknolojiyi kullandık.

Beş dakika boyunca bir shaker 2-izopropanol ile paslanmaz çelik folyo kuponveya örgü diskler yıkayarak başlayın. Bu yıkamayı iki kez yapın, ardından numuneleri iki kez kloroformla yıkayın ve yıkama başına 10 dakika yıkayın. Temizlenmiş paslanmaz çelik numuneleri 220 derecede 30 dakika fırında pişirin.

Pişmiş folyoları veya kafes diskleri PABT'nin %0,5 sulu çözeltisi içine batırın ve bir saat çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. PABT modifiye edilmiş numuneleri beş kez deiyonize edilmiş distile suile yıkayın. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve yıkıntıları tekrarlayın.

Numuneleri tcep ile 15 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde tedavi edin. Degas deionized su yuvarlak bir alt şişede bir vakum üreten cihaz ile, bir lyophilizer gibi, ve gazsız su ile folyo veya örgü diskler yıkayın beş kez. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve yıkıntıları tekrarlayın.

Gazsız suda 212,5 mikrolitre pei-PDT ve 0,4 molar sodyum asetat 125 mikrolitre seyrelterek% 1 PEI-PDT çözeltisi beş mililitre hazırlayın. Yıkanmış paslanmaz çelik numuneleri %1 PEI-PDT ile kuluçkaya yatırın. Havayı argon gazıyla değiştirin, şişeleri hava geçirmez kapatın ve bir saat çalkalayın.

Hemen peptit çekimi ile devam edin veya bir hafta kadar dört santigrat derece örnekleri saklayın. Gazdan arındırılmış %50 asetik asitte insan peptiti CD47 tozunu eriterek mililitre başına bir miligram insan peptit CD47 stok çözeltisi hazırlayın, ardından 4,5 mililitre gazdan arındırılmış PBS'de 500 mikrolitre stoğu eriterek çalışma çözümünü hazırlayın. Yıkanmış PEI-PDT kaplı numuneleri, bir saat boyunca sallayarak oda sıcaklığında peptid CD47'nin çalışma çözeltisi ile inkübedin.

Bittiğinde, metin el yazmasında açıklandığı gibi peptid CD47 kaplı örnekleri yıkayın. Metal folyoları ya peptit CD47 veya çırpılmış peptid ile kapladıktan sonra, çeyrek inç PVC tüpleri üç 38 santimetre uzunluğunda parçalarhalinde kesin ve sekiz adete kadar değiştirilmemiş, karıştırılmış peptid veya peptit CD47 modifiye edilmiş metal folyoları üç farklı tüpe yerleştirin. Sağlıklı insan donörlerden herhangi bir anti-trombosit ilaçsız 30 mililitre kan toplayın, toplanan kanın pıhtılaşmasını önlemek için şırınganın mililitresini %4 sodyum sitratla önceden yükleyin.

10 mililitrelik bir şırınga kullanarak her tüpe 10 mililitre kan koyun ve uçları metal adaptörlerle bağlayın. Chandler döngü aparatlarının tekerleklerine kan dolu tüpleryerleştirin ve dört saat boyunca 37 santigrat derecede tekerlek dönüşü ile metal folyolar boyunca kan geçirin. Tüplerden kan drenaj ve IRB gereksinimlerine göre atmak, sonra folyo almak için bir neşter ile tüpler kesti.

Sodyum kacodylate tamponundaki %70 çözeltiyi 0,1 molar sodyum klorür ile seyrelterek %2 glutaraldehit çözeltisi hazırlayın. Folyoları %2 glutaraldehit çözeltisinde 15 dakika kuluçkaya yatırın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Metal folyoları analiz etmeden önce, pbs ile üç kez yıkayın.

37 santigrat derece su banyosunda sekiz mililitre PBS ısıtın. Bir CFDA şişesine 90 mikrolitre DMSO ekleyerek 10 milimolar CFDA boya stok çözeltisi hazırlayın, ardından sıcak PBS'ye 75 mikrolitre cfda ekleyerek çalışma çözümünün hazırlanın. Karıştırmak ve alüminyum folyo ile kaplayın tüpü birkaç kez ters çevirin.

Her folyoyu 24 kuyulu bir plakaya bir mililitre CFDA boyaya yerleştirin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve plakayı 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından folyoları PBS'de üç kez yıkayın ve floresan mikroskopla görüntüleyin. Kovalent bağlı TAMRA konjuge peptid CD47 konsantrasyonu metal yüzeyinde peptid maksimal hareketsizlik yoğunluğunu belirlemek için ölçüldü.

Maksimum peptit tutma yaklaşık 180 santimetre kare, hangi mililitre başına 100 mikrogram bir giriş konsantrasyonu ile elde edildi. Modifiye metal yüzeylerde TAMRA konjuge peptid CD47 immobilizasyon daha floresan mikroskopi ile doğrulandı, tamra konjuge peptid CD47-tedavi örgü disklerin yüzeyinden yayılan tek tip floresan gösterdi. Modifikasyondan yoksun kontrol meshes yüzeyinde sadece minimal floresan tespit edildi, bu nedenle floresan ana kaynağı olarak bir non-özel bağlı TAMRA konjuge peptid CD47 hariç.

Ayrıca peptid CD47 kaplı yüzeylerin, karıştırılmış modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş peptid kontrollerine kıyasla kan yoluyla bulaşan hücre ekinde ciddi bir azalma gösterdiği doğrulandı. Sıçan buffy kat hücrelerinden izole monositler çıplak metal ve peptit CD47-modifiye paslanmaz çelik folyo kültürlü edildi. İşlevselleştirilmiş yüzeylerde akut monosit eki%58 oranında intenuulasyon, makrofajlara dönüşüm ve makrofaj proliferasyonu gözlendi.

Bu protokolü denerken, gazdan arındırılmış su veya reaktifiçeren adımların mümkün olan en kısa sürede yapılması ve oksijene maruz kalmanın en aza indirilmesi çok önemlidir. Teknolojimiz seçici olarak metal yüzeylerle hücresel etkileşimi modüle eder ve RT-PCR, akış sitometrisi ve immünoforesans gibi tipik bir hücre tipi tanımlama talimi bu teknikle uyumludur. Biyoaktif peptid bir dizi için geliştirilen, Bu teknoloji doku malzeme arayüzübiyouyumluluğu artırmada etkili olabilir.